⑤“4”：
高度毒性，LD50<50mg/kg
二、皮肤刺激性试验
化妆品皮肤刺激性试验指采用动物（一般为家兔）试验的方法来评价化妆品对人体皮肤刺激性大小的试验。
试验包括急性皮肤刺激和多次皮肤刺激两部分内容，具体做法是将受试样品一次剂量或多次剂量涂敷于健康无破损的动物皮肤上，观察产生的可逆性炎性症状。
为化妆品对人体皮肤的安全性提供依据。
其结论分为无刺激性、轻刺激性等四个等级。
皮肤刺激强度评价
表17-2
强度
分值
强度
分值
无刺激性
0.0～0.4
中等刺激性
2.0～5.9
轻刺激性
0.5～1.9
强刺激性
6.0～8.0
表17-3
皮肤反应
积分
皮肤反应
积分
红
斑
形
成
无红斑
0
水
肿
形
成
无水肿
0
勉强可见
1
勉强可见
1
明显红斑
2
皮肤隆起轮廓清晰
2
中等到严重红斑
3
水肿隆起约1mm
3
紫红色红斑并有焦痂形成
4
水肿隆起超过1mm,范围扩大。
4
三、眼刺激性试验
试验基本原则：
1 受试样品以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内，以未作处理的另一侧眼睛作为自身对照；
2 在规定的时间间隔内，观察对动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分，以此评价受试样品对眼睛的刺激作用。
观察时间应能足以评价刺激效应的可逆性和不可逆性。
观察时间最少72h，但一般不超过21d；
3 当动物出现严重和持久的痛苦迹象时，以适当的方式将动物处死；
4 强酸或强碱物质如pH≤2或pH≥11.5，由于其可预见的腐蚀特性，不必做本试验；
5 已在皮肤试验中证实具有腐蚀或严重刺激毒性的物质不必进行眼刺激试验，可以推测该物质对眼睛将会引起相似的严重结果；
6 在充分并公认的体外试验结果中确定可能产生刺激性或腐蚀性的物质不必进行体内试验。
目的：
检测外来化合物对实验动物眼和粘膜得原发性刺激和腐蚀作用的急性试验，为人类眼和粘膜接触该受试物的潜在危害提供资料。
实验动物：
首选成年白色家兔（如果使用其它的哺乳动物做试验，试验者应提供选择的依据【应选择与人类皮肤、粘膜反应比较相近的动物，常用的动物有家兔、豚鼠。
动物种属的选择应依据要观察的指标和模型的合理性。
通常一个试验类型选择一种动物进行评价。
】），体重2～3kg，至少3只（如果受试样品的显著效应是可预见的，可以考虑用一只动物。
如果用一只动物试验得出的结果提示受试样品有严重的刺激性和腐蚀性，则不必进行进一步的试验。
如果结果相反，则至少需要3只家兔。
有时，在增加动物的进一步试验中应该适当的阐明可疑反应。
）。
试验前动物要在动物实验室环境中至少适应3d时间。
试验前24h，要对实验动物的两只眼睛进行常规检查。
有眼睛刺激症状、角膜缺陷或结膜损伤的动物不能用于试验。
眼刺激性评价标准
表17-4
急性眼刺激积分指数（1、A、0、1）（最高数）
眼刺激的平均指数（M、1、0、1）
眼刺激个体指数（1、1、0、1）
刺激强度
0～5
48h后为0
------
无刺激性
5～15
48h后<5
------
轻刺激性
15～30
48h后<10
------
刺激性
30～60
7d后<20
（6/6动物<30）
7d后
（4/6动物<10）
中度刺激性
60～80
7d后<40
（6/6动物<60）
7d后
（4/6动物<30）
中度到重度刺激性
80～110
-------
------
重度刺激性
眼刺激性评价标准
表17-5
观察项目
刺激反应
判断符号
分值
角膜浑浊（以最致密部位为准）
无浑浊
散在或弥漫浑浊、虹膜清晰可见
半透明区易分辨、虹膜模糊不清
出现灰色透明区、虹膜细节不清、瞳孔大小勉强看清
角膜不透明、由于浑浊、虹膜无法辨认
+
++
+++
++++
0
1
2
3
4
虹膜
正常
褶皱明显加深、充血、肿胀、角膜周围轻度充血瞳孔对光任有反应
出血、肉眼可见坏死、对光无反应（或出现其中一种反应）
+
++
0
1
2
结膜充血（指眼睑膜、球结膜部位）
血管正常
血管充血呈鲜红色
血管充血呈深红色、血管不易分辨
弥漫性充血呈紫红色
+
++
+++
0
1
2
3
水肿
无水肿
轻微水肿（包括瞬膜）
明显水肿、伴有部分眼睑外翻
水肿至眼睑半闭合
水肿至眼睑超半闭合
+
++
+++
++++
0
1
2
3
4
分泌物
无分泌物
少量分泌物
分泌物使眼睑或睫毛潮湿或粘着
分泌物使整个眼区潮湿或粘着
+
++
+++
0
1
2
3
四、过敏性试验
过敏性试验（皮肤变态反应试验）是以诱发过敏为目的的而进行的诱发性投药，是以确认药物的诱发性效果和过敏性。
实验动物多数为豚鼠，每组受试验动物数为10～25只。
试验配成0.1%水溶液，从头部向尾部成对地做三次皮内注射。
经过一星期后，第8d用2cm*4cm滤纸涂以赋形剂配制的试验物质，将其贴于注射部位，持续48h做封闭试验。
第三节、化妆品微生物检测
一、化妆品中细菌总数的检测
化妆品细菌总数测定：
指对化妆品内容物单位质量〔或体积）内所含细菌数量的检测，通常以1g或1ml化妆品中所含活菌的数量表示。
测定细菌总数可以用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、设备、工艺流程及操作环境的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的科学依据。
国家标准刘一每种化妆品的细菌总数都有具体要求，如优级品的润肤乳液中细菌总数应控制在5010个/1g之内。
具体测定方法参见GF37918.2—87。
仪器设备:
（1）培养箱：
（36±1）℃。
（2）恒温水浴锅：
（46±1）℃。
（3）天平。
（4）灭菌广口瓶或三角瓶：
500ml。
（5）灭菌培养皿：
皿底直径9.0㎝。
（6）灭菌吸管：
1.0㎝、10.1㎝。
（7）灭菌小试管。
（8）玻璃珠：
直径5㎜。
（9）均质机。
（10）灭菌刀、剪刀、镊子。
（11）酒精灯。
培养基和试剂:
（1）蛋白胨10g
（2）琼脂15～20g（3）牛肉膏 3g （4）蒸馏水1000mL
（5）氯化钠 5g （6）pH7.2～7.4（7）营养琼脂培养基
制法：
将除琼脂以外的各成分溶于蒸馏水中，用15%的NaOH调节pH使之在7.2～7.4。
加入琼脂，于121℃下高压灭菌15min
（2）生理盐水
成分：
（1）NaCl 0.9g
（2）蒸馏水 100ml
制法：
一般每种检样配制250ml无菌生理盐水。
称取2.2gNaCl,加入250ml
蒸馏水溶解；分装于2支大试管中，每支9ml;再量取225ml装于500ml广口瓶或三角瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装入另1支试管中，包扎后于121℃下高压灭菌15min。
（3）75﹪的酒精棉球。
实验步骤:
在无菌条件下，将25ml（或25g）检样剪碎，放入装有225ml无菌生理盐水和玻璃珠的500ml广口瓶或三角瓶内，经充分振摇，形成10-1均匀稀释液。
用1ml的无菌吸管吸取10-1稀释液1ml，注入装有9ml无菌生理盐水的试管内，振摇混合均匀，即为10-2稀释液。
再用此吸管吸取10-1稀释液各1ml于2个培养皿内。
另取1ml的无菌吸管吸取10-2稀释液1ml，注入装有9ml无菌生理盐水的试管内，振摇混合均匀，即为10-3稀释液。
再用此吸管吸取10-2稀释液各1ml于2个培养皿内。
采用相同的方法吸取10-3稀释液各1ml于2
个培养皿内。
检样在36±1℃下48h后营养琼脂培养基中细菌的菌落数。
化妆品中微生物指标限值
表17-6
微生物指标
限值
备注
菌落总数（CFU/g）
小于等于500
小于等于1000
眼部化妆品，口唇化妆品和儿童化妆品以及其他化妆品
霉菌和酵母菌总数（CFU/g）
小于等于100
耐热大肠杆菌群/g
不得检出
金黄色葡萄球菌/g
不得检出
铜绿假单胞菌/g
不得检出
二、化妆品中粪大肠菌群的检测
粪大肠菌群是生长于人体和温血动物肠道中的一组肠道细菌，随粪便排除体外，约占粪便干重的1/3以上，故称为粪大肠菌群。
受粪便污染污染的水、食品、化妆品和水壤等物质均含有大量的这类菌落。
在化妆品中若检出有粪大肠菌群，即表明该化妆品已经被粪便污染，这时一般该化妆品的菌落总数均很高。
被粪便污染的化妆品中可能有肠道致病菌存在，经消费者使用等途径进入人体后，可引起肠道性疾病，故这种化妆品对消费者存在潜在的危险性。
从对化妆品微生物污染状况检测表明，有三种微生物（粪大肠菌群、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）容易引起化妆品的污染，其中以粪大肠杆菌群超标比列最高。
（一）粪大肠菌群的生化特性
粪大肠菌群不是细胞学上的分类命名，而是根据卫生学方面的需要，设定的一类与粪便污染有关的一组细菌。
粪大肠菌群为一群需氧及兼性厌氧的菌落，呈革兰阴性反应，能在普通培养基上生长繁殖。
其生化活动能力较强，能发酵多种糖类，产酸产气，其特点是能较快发酵乳酸。
粪大肠菌群在乳酸培养基中于37摄氏度下进行培养，在24h内能使乳糖发酵产酸，还有甲酸解氢酶进行甲酸分解，生成氢气和二氧化碳，产生大量气体，这时，若加入伊红美蓝指示剂，分解乳糖所产生的酸（带阳电荷）与伊红美蓝呈紫色且有金属光泽，故常用此特性来鉴定粪大肠菌群。
将粪大肠菌群接种于蛋白胨水培养基中，于37摄氏度培养24h,粪大肠菌群能分解培养基中蛋白质的色氨酸，产生淀基质（吲哚），当与试剂（对二甲基氨基苄甲醛）作用后，形成红色化合物———玫瑰淀基质（玫瑰吲哚），此种反应在生化中称为吲哚反应。
（二）检测步骤
（1）发酵（产酸产气）试验将试样液以无菌接种于双倍乳糖胆盐发酵管（其内放有倒置的小玻璃管，以收集气体）内，置44摄氏度培养皿中培养24～48h。
由于乳糖胆盐培养基是一种具有选择作用的培养基，其中胆盐具有抑制革兰阳性菌的作用。
若观察到发酵管内不产酸（由酚酞指示剂指示）、不产生，则报告试样为粪大肠菌群阴性，未检出粪大肠菌群，检测结束。
若发酵管内产酸产气，则继续进行下列检测。
（2）鉴别培养将产酸产气的发酵管内试样培养液接种到伊红美蓝琼基平皿上，置37摄氏度培养18
24h;同时将该培养液接种到蛋白胨水中，置于44摄氏度培养24。
（3）验证试验对所检出的细菌需要进一步验证其是否是粪大肠菌，验证方法有以下三种
①菌落观察：
在上述平面培养基上，仔细观察菌落生长情况。
大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上其典型菌落呈深红色、圆形、边缘整齐、表面光滑湿润、常有金属光泽，或呈紫黑色不带或略带金属光泽及粉色，中心较深的菌落。
②革兰染色、镜检:
将以上典型的（或近似的）大肠菌落进行革兰染色、镜检，若呈现阳性（紫色）反应，则报告未检出大肠菌群。
③靛基质试验（吲哚试验）：
在上述已培养好的蛋白胨水中滴入靛基质试剂（对二甲基氨基苄甲醛）进行靛基质反应，若液面呈玫瑰红色，呈阳性反应，则报告粪大肠菌群呈阳性，检出：
若液面任是棕黄色，则报告粪大肠菌群呈阴性，未检出粪大肠菌群。
综合分析以上所有测试结果，当发酵管内产酸产气，观察试验平面皿为典型粪大肠菌落，并经革兰染色、镜检试验为阴性（-）及靛基质试验为阳性（+），则报告该试样液检出粪大肠菌群。
三、绿脓杆菌的检测
1.原理
绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。
此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下能生长。
该菌对人有致病力，可使伤处化脓，引起败血症等。
2.仪器
（1）恒温培养箱：
37℃、42℃。
（2）三角瓶。
（3）试管。
（4）平皿。
（5）刻度吸管：
10mL、2mL、1mL。
（6）显微镜。
（7）载玻片。
（8）接种针、接种环。
（9）电炉。
（10）高压灭茵器。
3.培养基和试剂
（1）SCDLP液体培养基
（2）十六烷基三甲基溴化铵培养基
表17-7
成分:
牛肉膏
3g
蛋白胨
氯化钠
十六烷基三甲基溴化铵
琼脂
蒸馏水
10g
5g
0.3g
20g
1000mL
制法：
除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4～7.6，加入琼脂，68.95kPa（101b）20min灭菌后，制成平板备用。
（3）乙酰胺培养基
表17-8
成分:
乙酰胺
10g
氯化钠
无水磷酸氢二钾
无水磷酸二氢钾
硫酸镁（MgSO4·7H2O）
酚红
琼脂
蒸馏水
5g
1.39g
0.73g
0.5g
0.012g（1.2%溶液1mL）
20g
1000mL
制法：
除琼脂和酚红外，将其它成分加到蒸馏水中，加热溶解，调pH为7.2，加入琼脂、酚红，103.43kPa（15lb）20min高压灭菌后，制成平板备用。
（4）绿脓菌素测定用培养基
表17-9
成分:
蛋白胨
20g
氯化镁
硫酸钾
琼脂
甘油（化学纯）
蒸馏水
1.4g
10g
18g
10g
1000mL
制法：
将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使其溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，68.95kPa（10lb）20min高压灭菌后，制成斜面备用。
（5）明胶培养基
表17-10
成分:
牛肉膏
3g
蛋白胨
明胶
蒸馏水
5g
120g
1000mL
制法：
取各成分加到蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加温使之溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经68.95kPa（10lb）20min灭菌后，直立制成高层备用。
（6）硝酸盐蛋白胨水培养基
表17-11
成分:
蛋白胨
10g
酵母浸膏
硝酸钾
亚硝酸钠
蒸馏水
3g
2g
0.5g
1000mL
制法：
将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加热使之溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，68.95kPa（10lb）20min灭菌后备用。
（7）普通琼脂斜面培养基
表17-12
成分:
蛋白胨
10g
牛肉膏
氯化钠
琼脂
蒸馏水
3g
5g
15g
1000mL
制法：
除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调pH为7.2～7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，103.43kPa（15lb）20min高压灭菌后，制成斜面备用。
4.操作步骤
（1）增菌培养：
取1:
10样品稀释液10mL加到90mLSCDLP液体培养基中，置37℃培养18h～24h。
如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
（2）分离培养：
从培养液的薄膜处挑取培养物，划线接种在十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板上，置37℃培养18h～24h。
凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。
在缺乏十六烷基三甲基溴化铵培养基时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平板上，放37℃培养24h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其它菌不生长。
（3）染色镜检：
挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
（4）氧化酶试验：
取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15s～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。
（5）绿脓菌素试验：
取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置37℃培养24h，加入氯仿3mL～5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后，静置片刻。
如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。
（6）硝酸盐还原产气试验：
挑取可疑的绿脓杆菌纯培养物，接种在硝酸盐蛋白胨水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。
凡在硝酸盐蛋白胨水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。
（7）明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置37℃培养24h，取出放冰箱10min～30min，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。
（8）42℃生长试验：
挑取可疑的绿脓杆菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41～42℃培养箱中，培养24h～48h，绿脓
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