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基因敲除技术及其进展

基因敲除技术研究进展及其在代谢工程上的应用

TheCurrentStatusofGeneKnockoutanditsApplicationinMetabolicEngineering

天津大学化工学院

二零壹六年六月

摘要

基因敲除技术是20世纪80年代发展起来一项重要的分子生物学技术，在微生物代谢工程，动植物改造以及功能基因研究方面具有广泛的应用。

本文介绍了基因敲除的策略和在代谢工程中的作用，着重介绍了四种新兴的基因敲除策略：

RNAi，ZFN，TALENs以及最近研究火热的CRISPR/Cas9。

并在最后展望了基因敲除技术尤其是新兴技术在相关领域的发展趋势，为基因敲除技术的进一步发展提供了参考。

关键词：

基因敲除代谢工程同源重组CRISPR/Cas9

ABSTRACT

GeneKnockoutisanimportantmolecularbiotechnologywhichhasdevelopedsine1980.Ithasbeenprovedefficientinmicrobialmetabolicengineering,transformofnimalsandplantsandfunctionalgenomics.Inthisreview,wemainlyintroducedthestrategiesofgeneknockoutanditsapplicationinmetabolicengineering.AndfournewstrategiesRNAi,ZFN,TALENsandCRISPR/Cas9werehighlightedindetail.Atlast,developingfrontiersandapplicationprospectsofgeneknockoutwerefurtherdiscussed.

KEYWORDS：

geneknockout,metabolicengineering,homologousrecombination,CRISPR/Cas9

第一章基因敲除技术

1.1基因敲除相关背景

随着测序技术的迅速发展，生物体基因功能的研究已经成为当下最热门的课题。

现阶段基因功能的研究主要是通过减弱或中止某一基因表达，观察生物体整体功能变化，推测该基因的相关功能，然后将基因与生物整体功能相关联进行深入探究，为最终确定基因功能提供依据[1]。

随着功能基因组学研究的深入，相关技术也得到不断地发展与完善，其中最为常用的便是基因敲除技术。

基因敲除是20世纪80年代末发展起来的一门新技术，2007年获得诺贝尔生理或医学奖[1]。

该技术是以DNA同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础，经过30余年的发展，现今已经有多种基因敲除技术被应用于分子生物学、遗传学等诸多领域[2]。

而近年来新兴起了ZFNs、TALENS、Cas9等多种基因高效靶向修饰和调控技术。

2012年1月基因组编辑核酸酶技术的NatureMethods杂志评选为年度研究方法[3]。

2012年12月被Science杂志评为2012年度十大科学进展之一[4]。

这些技术极大地提高了基因敲除的效率，且具有极高的特异性，为研究基因功能创造了新的途径必将极大地推动生物学、医学研究的发展。

基因敲除技术分为完全基因敲除和条件型基因敲除。

完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。

条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除[5]。

现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统应用最为广泛。

基因敲除技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。

然而，基因敲除也有其无法克服的缺点和不足：

1）在敲除过程中，被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区，残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能，这将给表型分析带来麻烦；2）敲除掉某个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因在于许多基因在功能上是冗余的，敲除掉

一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其它成员可以提供同样的功能；3）对于某些必需基因，敲除后会造成细胞死亡，也就无法研究这些必需基因的功能；4）实验费用偏高，同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除，获得的表型差异很大[6]。

1.2基因敲除技术在代谢工程中的应用

具体而言，代谢工程是利用基因工程技术或其他物理、化学方法对细胞的代谢途径进行精确地修饰与改造，对细胞内目标物质的代谢流进行扩展、减小、阻断或构建新的代谢途径，从而有目的、有理性地改变微生物原有代谢特性，改进或者构建新的微生物表型，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，提高目的代谢产物活性或产量、或合成新的代谢产物的工程技术科学[7]。

代谢工程的难题就是如何使微生物的代谢主流流经理想载流途径。

在发酵生产中,为了达到这一目的，从营养物质进入细胞到产物产生通常需要从三个方面加以控制[8]，即：

a.使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；b.阻塞或去除与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；c.消除或削弱目的产物进一步代谢的途径。

在上述各过程中，起关键作用的无疑是酶，而基因敲除技术的出现使快速失活成为现实，从而达到调节代谢流，优化代谢途径的目的。

通过基因敲除技术，可研究被敲除基因的生物学功能，还可以进行功能基因的插入及染色体基因的替换，进而可以阻断微生物细胞的代谢旁路，减弱毒/副作用，强化目标产物的产量或质量，降低能耗，从而成为具有重要工业应用价值的微生物细胞工厂研究中的重要内容[9]。

第二章基因敲除策略

以下本文将通过两个方面讲述基因敲除技术，一是传统的基因敲除策略；二是新兴的基因敲除策略。

并对这些策略做一些简单介绍以及概括。

2.1传统的基因敲除策略

2.1.1利用同源重组进行基因敲除

经典的基因敲除策略是利用上述同源重组基本原理，通过体外改造一定长度/形式的基因，与细胞染色体上的靶基因发生同源重组（插入或置换），从而改变细胞的遗传特性。

从同源重组的基本原理出发，分别针对同源重组的底物类型（单链/双链、线性/环状）、重要蛋白（RecA酶、RecBCD酶等及噬菌体中具有相似功能的酶）和功能位点（Chi位点）等进行分子设计，即可开发出各种不同的基因敲除方法，根据同源重组载体的不同，可以把基因敲除方法分为线性单链DNA（ssDNA）、线性双链DNA（dsDNA）以及环状双链DNA（质粒载体）等3类：

1.线性单链DNA敲除策略不但打靶载体易于构建，且其重组效率是双链DNA的10~100倍[10]；

2.采用线性双链DNA进行同源重组，是近年来基因敲除方法的热点之一。

其优点是可以避免较为繁琐的基因克隆和质粒载体构建步骤，而直接采用PCR方法扩增获得目标同源重组片段。

然而，线性双链DNA易于被细胞内的RecBCD酶降解，为了解决上述问题，可以在线性双链DNA的两侧引入Chi位点，保护DNA不被RecBCD酶降解，并能强化RecBCD酶介导的同源重组效率[11]。

3.构建环状质粒载体进行目标基因敲除的方法，是实现微生物基因敲除的经典策略，主要通过微生物本身的RecA重组系统（主要包括RecA和RecBCD等蛋白）发挥作用。

RecA蛋白是单链结合蛋白，促进各类DNA分子间的同源联会、配对、链交换和分支迁移RecBCD是由RecB、RecC和RecD三个蛋白组成的复合体，它能与双链切口结合使DNA链解开，并在Chi位点形成单链，然后由RecA蛋白促进同源重组。

由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性，所以线性DNA分子在细菌体内会被降解。

因此，必须通过环状质粒载体克隆来完成同源重组片段的分子设计和构建[9]。

常用的环状质粒载体敲除策略有4种[12]：

a.非复制型质粒载体敲除法

对野生菌做基因敲除，可以先考虑用非复制型载体。

由于构建好的敲除载体在受体菌中是不复制的，因此转化之后，在选择压力下，未发生重组的转化子由于敲除载体不能复制随着菌体生长而被稀释。

b.不稳定型质粒载体敲除法

若受体菌感受态较难制备，可考虑采用不稳定型敲除载体。

这种质粒在受体菌中分配不稳定,在无压力选择或低磷条件下培养5～10代会出现很多质粒丢失的细胞。

因此转化后可先控制培养条件使敲除载体随细胞复制以增加转化子的数目，然后再在无压力选择或低磷条件下让质粒丢失，最后在选择压力下筛选敲除子。

c.温度敏感型（Ts型）质粒载体敲除法

1993年，Biswas等[13]利用Ts型质粒建立了革兰氏阳性菌高效的基因敲除系统。

Biswas所用质粒pG+host5在37℃时不复制，而28℃时以滚环模式进行复制。

因此转化后在选择压力下37℃培养会导致第一次同源重组sco（single-crossover），之后将温度降至28℃，会促使质粒发生滚环复制，这种复制机制会导致发生第二次dco（double-cross-over）。

重组后，目的基因或是被敲除，或是回复成野生型。

d.结合转化敲除法

如果要进行基因敲除的目标菌不易制备感受态或感受态效率很低，则可以通过寻找“中介菌”来完成基因转移的过程。

2.1.2利用随机插入突变进行基因敲除

大规模的随机插入突变理论上可实现在基因组范围内敲除任一基因。

这项技术具有效率高、基因完全失活以及容易分离鉴定等优点。

目前较为有效的方法是随机插入突变可以分为T-DNA插入突变和转座子插入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲除手段：

A．T-DNA插入失活技术是利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将一段带有报告基因的DNA序列标签整合到基因组DNA上。

可以直接在植物基因组DNA中产生稳定的插入突变，而且插人位点的随机性较强，但是只适用于那些容易被T-DNA转化的植物，且常常会引起染色体重排现象，使突变体表型与T-DNA插入无关而难以进行遗传学分析。

这种方法在拟南芥中可产生35％～40％的突变率，19％的突变体具有外观可察觉到的表型特征。

B．转座子插入突变是利用转座子在染色体上可移动的特点，当其跳跃插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。

植物特别适合于转位插入突变，因为获得的基因突变可以保留在杂合子的植株中，而通过Fl代植株自交产生的F2代植株中可获得纯合子的突变体植株。

利用转座子进行基因敲除具有很大便利，仅需已知外显子，载体构建简单，可携带多种不同抗性基因，同时处理多基因[14]。

转座子插入突变只适用于存在内源活性转位子的植物种类，但这样的植物并不多。

2.2新兴的基因敲除策略

2.2.1利用RNA干扰引起的基因敲除

RNA干扰（RNAInterference，RNAi）是指内源性或外源性双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）进入细胞后，在细胞内特异性降解与其同源的mRNA，从而抑制相应基因的表达，使细胞表现出特定基因缺失的表型，该现象也被称为基因沉默[15]。

dsRNA在Dicer酶的作用下可产生一系列长度为21～22nt的siRNA（smallinterfefenceRNA），siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等结合形成RNA诱导沉默复合物（RNA—inducedsilencingcomplex，RISC），RISC以ATP依赖的方式催化双链siRNA解旋，利用RISC内部的单链siRNA，通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，从而导致目的基因的沉默。

因此，通过将dsRNA分子导人细胞内，特异性地降解细胞内与其同源mRNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。

2.2.2锌指核酸酶基因打靶技术

锌指核酸酶基因打靶技术（Zincfingernucleases，ZFNs）的核心设计思想是将2个有特定功能的结构域，即特异性识别模块和功能模块融合，形成具有特定功能的蛋白[16]。

单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3～6个Cys2一His2锌指蛋白重复单位，能特异性识别1个三联体碱基。

与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当2个识别位点相距6～8bp距离时，2个单体ZFN相互作用产生酶切功。

在此特异位点产生1个DNA双链切口（Doublestrandsbreaks，DSB），然后利用细胞固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复，从而达到精确定点修饰的

目的。

图2-1ZFN结构示意图

Figure2-1ThestructureofZFN

2.2.3TALENs靶向基因敲除技术

TALENs（TranscriptionActivator—like（TAL）EffectorNucleases）靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，被认为是基因敲除技术发展的里程碑。

TALENs的设计和构建是基于植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）分泌的一种转

录激活子样效应因子（Transcriptionactivator—likeeffector，TALE）可以识别DNA序列的原理。

TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核苷酸序列有恒定的对应关系，由34个氨基酸重复序列组成一个单元，重复17～18次，34个氨基酸中的第12和13个氨基酸（RepeatVariantDi—residue，RVD）对应识别1个目标碱基。

。

利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块蛋白。

TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，在特异的位点打断目标基因，进而在该位点进行DNA操作，如敲入（Knock—in）、敲出（Knock—out）或点突变[17]。

TALENs成功解决了常规的ZENs方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有与ZENs相等或更好的活性，无基因序列、细胞、物种限制，试验设计简单准确，成本低，成功率几乎可达100％，毒性低，脱靶情况少，使基因操作变得更加简单、方便。

图2-2TALENs靶向基因敲除技术结构图

Figure2-2ThestructureofTALENs

2.2.4CRISPR/CAS9基因敲除技术

2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats（CRISPR）／CRISPR—associated（Cas）9出现，主要由细菌和古细菌通过一种不断进化适应的免疫防御系统改造而成，II型CRISPR/Cas9免疫系统依赖Cas9内切酶家族靶向和剪切外源DNA。

其特点是制作简单，成本低，作用高效[18]。

作为一种新的基因编辑技术，CRISPR/Cas9有靶向精确性高、试验周期短、无物种限制、具有好的活性等特点和优势。

不仅如此，CRISPR/Cas系统还可以同时针对同一细胞（ES）中的多个位点能实现多靶点同时酶切，人们运用该技术成功获得斑马鱼等模式动物基因敲除模型，使得多个基因敲除、敲入成为可能。

Cas9内切酶在crRNA（CRISPRRNA）和反式激活crRNA（trans-actingCRISPRRNA，tracrRNA）的复合物的指引下，识别保守的间隔相邻基序（protospaceradjacentmotifs，PAM），在PAM稍前几个碱基处切割，形成双链断裂的DNA，细胞启动同源重组和非同源末端连接修复机制，然后对修复位点进行修饰或插入新的遗传信息，导致基因失活。

CRISPR/Cas9技术是继ES细胞打靶、ZFN和TALEN等技术后可用于定点构建基因敲除动物的第四种方法。

该技术只需设计一个100bp左右的sgRNA就可实现特异性识别，而ZFN和TALEN则需要设计改变核酸酶前面的序列以针对不同的靶点。

TALEN技术可在几个月内得到基因敲除动物，而CRISPR/Cas9技术则更快，只需要3～4周。

最近Tsai等改进技术，将CRISPR/Cas9技术的靶向功能与FokI核酸内切酶结合，以二聚体的形式进行切割（图2-3），由于所切割的DNA长度比单独使用

CRISPR/Cas9技术增大了两倍，提高了基因组编辑的准确性，大大降低了脱靶效应[19]。

图2-3sgRNA介导的Cas9和FokI复合系统定向基因组修饰作用示意图

Figure2-3ThefunctionofsgRNAguidedCas9andFoKIcombinedsystem

第三章前景展望

综上所述，基因敲除技术从八十年代发展至今近三十年，从起始的经典基因敲除策略到如今研究火热的CRISPR/Cas9，基因敲除技术已经取得了巨大的发展。

尽管利用人工核酸酶ZFN、TALENs和细菌获得性免疫系统CRISPR目前还处于研究的初期阶段，其在基因敲除方面已表现出巨大的潜力和广阔的应用前景，被认为是靶向基因修饰的革新技术。

虽然这些新技术依然还有许多未知因素并没有研究透彻，但是可以相信其在微生物代谢工程以及动植物改造等方面将会发挥越来越重要的作用。

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致谢