下游技术期末总结.docx

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下游技术期末总结

第一章绪论

第二章发酵液预处理，细胞的分离、破碎

1、发酵液的性质：

①产物浓度较低、②悬浮颗粒小、③固体粒子可压缩性大、④粘度大、⑤性质不稳定

2、常用的发酵液预处理方法：

①降低液体的粘度：

水稀释法、加热法②调整pH值③凝聚和絮凝

3、凝聚：

在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，从而胶体体系不稳定。

絮凝：

在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。

包含体：

很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物不分泌到细胞外，而在细胞内凝聚成的无生物活性的固体颗粒。

过滤：

利用多孔性介质截留悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。

4、细胞破碎的流程图

5、细胞分离常用的方法？

方法：

重力沉降、离心沉降、过滤

A.重力沉降

絮凝剂：

高分子絮凝剂：

聚丙烯酰胺、聚乙烯酰胺等

无机的凝聚剂：

中性盐（硫酸铝、氯化钙等）

B.离心沉降

离心分离法：

差速离心、区带离心

低速离心，高速离心，超速离心

过滤式离心，沉降式离心

冷冻离心：

低温下操作

C.过滤

名解：

利用多孔性介质截留悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。

6、机械破碎法与化学破碎法的比较

机械破碎法

●优点：

处理量大、破碎效率高、速度快，适用于工业规模的细胞破碎。

●缺点：

由于操作条件比较剧烈，往往容易造成细胞的过度破碎，不利于后续处理

化学破碎法

●优点：

选择性高，胞内产物的总释放率低，料液粘度小，有利于后处理过程。

●缺点：

适用范围小，通用性差，破碎速度慢，处理时间长，破碎效率低，不适于大规模细胞破碎操作。

由以上比较可知，两种方法各有利弊，把二者结合起来使用，则可起到取长补短的作用，能够得到很好的破碎效果。

7、细胞破碎化学试剂处理：

增大细胞壁通透性

常用试剂：

表面活性剂、螯合剂、有机溶剂、变性剂

8、常用的细胞破碎方法有哪些？

一、机械破碎：

机械破碎的原理是细胞在机械作用力下受到压缩和剪切而破碎。

细胞越小，所需压缩或剪切力越大，越难破碎。

处理量大、效率高、速度快，是工业规模的主要手段

1.高压匀浆：

破碎原理：

主要利用细胞悬液在高压作用下液相剪切力以及细胞与固定表面的撞击力而使之破碎。

压力通常为20-70MPa

适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎

需冷却处理，以保护产物的生物活性

2.珠磨

破碎原理：

利用在高速搅拌作用下，细胞和微球相互磨擦碰撞而破碎。

细胞受研磨剪切和撞击而破碎

特点：

适用范围较广；但有效能量利用率很低，设计操作时应充分考虑冷却系统的热交换能力；影响破碎率的操作参数较多。

3.撞击破碎

细胞冷冻后成为刚性球体，再进行高速撞击而破碎

特点：

细胞破碎均匀；可通过调节载气压力控制细胞破碎程度；适用于细胞器（如线粒体、叶绿体）的回收。

4.超声波破碎

破碎原理：

超声波作用下液体发生空化作用，产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。

影响因素：

细胞种类、浓度和超声波的能量等。

特点：

适用范围广,适用于多数微生物细胞的破碎。

但有效能量利用率极低，操作中产生热，需在冰水或有外部冷却的容器中进行,故不易放大，多在实验室使用。

二、化学和生物化学法

1.酸碱处理

2.化学试剂处理：

增大细胞壁通透性

表面活性剂、螯合剂、有机溶剂、变性剂

3.酶溶：

利用溶解细胞壁的酶处理细胞

不同的细胞用不同的酶：

如溶菌酶适用于细菌；而酵母细胞的酶溶需用Zymolyase、-1,6-葡聚糖酶或甘露糖酶；破坏植物细胞则用纤维素酶。

4.自溶：

通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法。

三、物理渗透法

1.渗透压冲击法：

破碎原理：

细胞在高渗透压介质中平衡后，再突然将其转至低渗透压环境中，水会大量进入细胞，使细胞壁和膜胀破。

特点:

温和，适用于易于破碎的细胞（动物细胞和革兰氏阴性菌）

2.冻结-融化法

细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此操作反复进行多次，使细胞受到破坏。

第三章沉淀

1、什么是沉淀？

种类？

沉淀方法的分类？

沉淀：

利用沉淀剂使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。

种类：

盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀等

分类

有机溶剂沉淀的特点：

①分辨率高、②溶剂容易分离，并可回收使用、③产品洁净，无需脱盐等、④容易使蛋白质等生物大分子失活、⑤应注意在低温下操作（有机溶剂预冷）、⑥成本高

2、盐溶：

在低浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度增大的现象。

盐析：

在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。

3、盐析的原理？

A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；

B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。

4、影响盐析的因素

●盐的种类和浓度：

离子半径小,带电荷多的离子盐析效果好

●溶质种类的影响

●溶质浓度的影响：

样品溶度0.5-2%

蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；

蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；

5、常用的盐析用盐

●#硫酸铵：

溶解度大（767g/L）

●硫酸钠

●磷酸盐

●柠檬酸盐

6、常用的有机溶剂沉淀剂

●乙醇：

沉淀作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉淀

●丙酮：

沉淀作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广

●要求：

致变性作用要小，毒性要小、挥发性适中，水溶性要好

7、等电点沉淀法

●原理：

蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。

●概念：

调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。

8、热沉淀：

利用在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀的现象，分离纯化热稳定性高的目标蛋白的方法。

9、课后问答

●沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？

●沉淀的一般操作步骤是什么？

（1）在经过滤或离心后的样品液中加入沉淀剂；

（2）沉淀物的陈化；

（3）离心或过滤，收集沉淀物。

●有机溶剂沉淀法的原理是什么？

（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。

（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。

第四章萃取

1、什么是萃取？

原理？

过程？

特点？

分类？

原则？

（答案有点怪）

概念（过程）：

利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物）溶解度的不同，从而达到分离的目的。

把物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相。

原理：

利用溶剂对需分离组分有较高的溶解能力，分离过程纯属物理过程，不发生化学反应。

特点：

萃取可提取和增浓产物，并可除去部分杂质

分类：

物理萃取、化学萃取

原则：

●使溶质在萃取相中有最大的溶解度,有很大的萃取容量

●有良好的选择性，理想情况下只萃取所需产物

●与被萃取的液相互溶度小，黏度度小，有利于相的分散和两相分离

●易于回收

●稳定性好，无毒或毒性低

●价廉易得

2、单级萃取原理

使含溶质的溶液（h）和萃取剂（L）接触混合，静止后分成两层。

3、超临界流体萃取（名解、优缺点、怎么实现）

超临界流体：

当一种物质处于其临界点以上的温度和压力之下，则称之为超临界流体。

优点：

●临界条件温和：

临界压力易达到；操作温度接近于常温，对热敏性的物质无影响。

●可通过改变温度和压力实现选择性提取分离

●产品分离简单，步骤少，效率高：

萃取完成后，改变状态，可很容易脱除，无残留

缺点：

设备投资大

超临界流体萃取的流程

Ø等温变压法：

萃取了溶质的超临界流体通过膨胀阀进入分离槽，压力下降，密度也下降，溶质溶解度下降而析出。

Ø等压变温法：

萃取了溶质的超临界流体经加热器升温后在分离槽析出溶质。

Ø吸附法

萃取了溶质的超临界流体通过吸附分离器（内含只吸附溶质的吸附剂），使溶质与萃取剂分离。

4、双水相萃取（名解、构成体系、原理）

概念：

利用物质在不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取的方法。

原理：

依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相互作用：

氢键、电荷力、疏水作用、范德华力、构象效应

构成双水相的体系：

非离子型高聚物－非离子型高聚物

•PEG－Dextran：

上相富含PEG，下相富含Dex

非离子型高聚物－离子型高聚物

离子型高聚物－离子型高聚物

非离子型高聚物－相对低分子量化合物

•PEG－磷酸钾：

上相富含PEG，下相富含磷酸钾

5、反胶团：

表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”

优点：

Ø有很高的萃取率和选择性

Ø分离，浓缩可同时进行

Ø蛋白质不易失活

Ø表面活性剂可进行细胞破壁，可直接从细胞中提取活性物质

Ø

成本低，溶剂可反复使用

6、何谓萃取的分配系数？

衡量萃取体系是否合理的重要参数：

k

Y---平衡时溶质在轻相（即萃取液）中的浓度

X---平衡时溶质在重相（即萃余液）中的浓度

7、掌握单级萃取过程

特点：

只用一个混合器和一个澄清器；流程简单，但萃取效率不高，产物在水相中含量仍较高。

8、了解多级萃取过程

多级错流萃取

特点：

优点：

由几个单级萃取单元串联组成，萃取剂分别加入各萃取单元；萃取推动力较大，萃取效率较高；

缺点：

仍需加入大量萃取剂，因而产品浓度稀，需消耗较多能量回收萃取剂。

多级逆流萃取

特点：

亦由几个单级萃取单元串联组成，料液和萃取剂分别从两端连续加入，互成逆流接触；

在三种操作方式中，萃取效率最高，萃取剂用量最少，因而工业上普遍采用。

第五章膜分离

1、膜分离的概念：

利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。

2、厚度：

膜的厚度应在0.5mm以下，否则不能称其为膜。

3、比较

生物分离中最常用的膜分离技术是：

超滤、微滤和反渗透。

4、什么是浓差极化？

有什么危害？

怎么解决？

浓差极化:

在超滤过程中，由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增高．在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层。

解决：

为了减少浓差极化，通常采用错流操作。

使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流体的剪切作用将过滤介质表面的固体移走。

5、微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析等方法的原理

1.微滤（Microfiltration,MF）：

以多孔细小薄膜为过滤介质，压力为推动力，使不溶性物质得以分离的操作。

孔径分布范围在0.025~14μm之间，截留直径为0.02μm~10μm大小的粒子。

可应用于消毒、澄清、细胞收集等。

如培养基液菌体分离与浓缩，产品消毒。

2.超滤（Ultrafiltration,UF）：

▪分离介质同上，但孔径更小，为0.001-0.02μm，分离推动力仍为压力差，可分离分子量从300到1,000，000道尔顿的可溶性物质。

▪适合于酶、蛋白质等生物大分子物质的分离、浓缩，超滤亲和纯化，血浆分离，脱盐，去热原，在生物工程中应用最广。

3.反渗透（Reverseosmosis,RO）:

▪定义：

在溶质浓度高的一侧施加超过渗透压的压力，使溶剂透过膜的操作。

▪是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.1~1nm之间。

▪其基本原理为溶解扩散。

在高于溶液渗透压的压力作用下，只有溶液中的水透过膜，而所有溶液中的大分子、小分子有机物及无机物全被戳留住。

主要用于海水脱盐，纯水制造以及小分子产品如乙醇、糖及氨基酸浓缩等。

4.透析：

用具有一定孔径大小的、高分子溶质不能透过的亲水膜将溶质溶液与纯水分隔，在浓差的作用下，小分子溶质透向水侧，水透向溶液一侧。

▪透析膜：

孔径5-10nm,实验室中常用透析袋

▪应用：

脱盐，血液透析

5.电渗析：

以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作。

在直流电场的作用下，由于离子交换膜的阻隔作用，实现溶液的淡化和浓缩，分离推动力是静电引力。

6、各种膜分离技术的应用范围

7、膜污染的主要原因，膜清洗的方法和预防膜污染的措施

原因：

由于溶质与膜的相互作用而在膜表面和孔内吸附，或因浓差极化，溶质在膜表面产生沉淀或结晶，形成“凝胶层”引起膜性能变化的现象。

影响:

透过通量大幅度下降；降低目标产物的回收率。

膜污染是膜技术应用的最大限制因素。

膜的清洗方法:

膜污染造成膜透水量随运行时间增长而下降。

清洗的方法通常可分为物理方法与化学方法。

物理方法：

一般指用高速流水冲洗。

化学清洗：

通常是用化学清洗剂对膜迸行清洗。

防止或减轻膜污染的措施：

①对膜进行预处理；②对料液进行预处理。

第六章层析技术

1、层析的概念、原理、分类及分类依据。

概念：

利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离及测定的方法。

原理：

根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起溶质移动速度的不同而进行分离的方法。

分类：

⏹根据流动相的相状态分：

气相层析、液相层析、超临界流体层析

⏹根据固定相的形状分：

纸层析、薄层层析、柱层析

⏹根据压力分：

低压、中压、高压

⏹根据流动相的流动方式分：

轴向流层析、径向流层析

⏹根据洗脱时展开方式分：

洗脱展开、迎头分析（前沿分析）、顶替展开（置换展开）

⏹按机理分主要有：

吸附层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析

2、吸附层析的的概念、原理、操作、特点及应用

概念：

吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。

原理：

常见的吸附类型及其主要特点：

物理吸附：

吸附作用力为分子间引力，无选择性，吸附层可以是单层，也可以是多层，吸附和解吸附速度通常较快。

化学吸附：

吸附作用力为化学键合力，只能以单分子层吸附，选择性强，吸附和解吸附速度较慢。

⏹吸附剂通常应具备以下特征：

对被分离的物质具有较强的吸附能力、有较高的吸附选择性、机械强度高、再生容易、性能稳定、价格低廉。

常用的吸附剂：

氧化铝、硅胶、活性炭、纤维素、硅藻土

操作：

应用：

3、凝胶层析的概念、原理、操作、特点及应用

概念：

在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离。

原理：

是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

操作：

特点：

亲水性高，表面惰性，不与溶质发生作用

稳定性强，在较宽pH和离子强度范围内稳定，使用寿命长

具有一定的孔径分布范围

机械强度较高，允许较高的操作压力（流速）

应用：

①分离纯化

②脱盐

③相对分子质量的测定

在凝胶介质的分级范围内，蛋白质的洗脱体积与相对分子质量的对数成正比

对球形分子的测量精度高

4、亲和层析的概念、原理、操作、特点及应用

概念：

亲和层析分离是利用溶质和固定相之间特殊的生物化学作用，从而实现分离。

原理：

将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子（目标物质）容易从混合物中得到选择性分离纯化。

操作：

载体活化、配基连接、吸附、清洗、洗脱、再生

特点：

①效率高：

利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质。

②分离精度高：

可用于分离含量极低，结构相近的化合物

③但通用性较差，洗脱条件苛刻

应用：

第七章动物细胞大规模培养和专用生物反应器

1、根据动物细胞的类型，可采用贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等三种培养方法进行大规模培养。

2、动物细胞生长特性及培养温度

1.细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素

2.细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差

3.需氧少，不耐受强力通风与搅拌

4.群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）

5.培养过程产品分布细胞内外，成本高

6.原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡

3、依据在体外培养时对生长基质依赖性差异，动物细胞可分为两类：

●贴壁依赖型细胞：

需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。

●非贴壁依赖型细胞：

无需附着于固相表面即可生长，包括血液、淋巴组织细胞、许多肿瘤细胞及某些转化细胞。

4、贴壁培养：

是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。

5、悬浮培养（名解）：

是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。

6、固定化培养（名解）：

是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。

上述两大类细胞都适用，具有细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强等优点，细胞易于产物分开，有利于产物分离纯化。

制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微囊法等。

7、深层培养可分为：

分批式、流加式、半连续式、连续式、连续式和灌注式五种。

8、生物反应器（名解）：

生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统

9、膜生物反应器：

膜分离过程与生物反应过程耦合的生物反应装置。

第八章结晶

1、结晶：

溶液中的溶质在一定条件下，因分子有规则的排列而结合成晶体的过程。

2、晶体：

许多性质相同的粒子（分子、原子或离子）在三维空间中排列成的有规则的固态物质。

3、晶体的性质

⏹自范性（自限性）：

晶体具有自发地形成封闭的几何多面体外形的能力的性质。

⏹具有方向性：

同一晶体在不同方向上所测得的性质表现出差异。

⏹具有一定的对称性

⏹均匀性（均一性）：

晶体物质较纯（相同的粒子有规律地排列）

4、晶体的形成

⏹在饱和溶液中，晶核是处于一种形成—溶解—再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。

⏹结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。

5、结晶的步骤

⏹过饱和溶液的形成

⏹晶核的形成

⏹晶体生长

⏹溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。

6、常用的结晶方法

⏹热饱和溶液冷却（等溶剂结晶）

适用于溶解度随温度升高而增加的体系；同时，溶解度随温度变化的幅度要适中。

自然冷却、间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）、直接接触冷却（在溶液中通入冷却剂）

⏹部分溶剂蒸发法（等温结晶法）

适用于溶解度随温度降低变化不大的体系。

加压、减压或常压蒸馏

⏹真空蒸发冷却法

使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种结晶方法。

设备简单、操作稳定

⏹化学反应结晶

加入反应剂产生新物质，当该新物质的溶解度超过饱和溶解度时，即有晶体析出。

其方法的实质是利用化学反应，对待结晶的物质进行修饰，一方面可以调节其溶解特性，同时也可以进行适当的保护。

⏹盐析法：

硫酸铵、NaCl

⏹加有机溶剂法：

乙醇、甲醇、丙酮

7、何为重结晶？

重结晶是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。

8、常用的工业起晶方法：

自然起晶法、刺激起晶法、晶种起晶法

9、什么是结晶过程？

⏹过饱和溶液的形成

⏹晶核的形成

⏹晶体生长

⏹溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。

10、影响晶体生长速度的因素？

⏹杂质：

改变晶体和溶液之间界面的滞留层特性，影响溶质长入晶体、改变晶体外形、因杂质吸附导致的晶体生长缓慢。

⏹搅拌：

适当的搅拌可增加晶体与母液的接触机会，加速晶体生长；但过快，会增加溶质的溶解。

一般5-15r/min为宜。

⏹温度：

通常采用较高温度使溶质溶解，而后缓慢冷却获得结晶。

第九章蒸发与干燥

1、蒸发：

使含有不挥发溶质的溶液沸腾汽化并移出蒸汽，从而使溶液中溶质浓度提高的过程。

2、蒸发的操作方法

⏹根据操作压力的不同可分为：

常压蒸发和减压蒸发（真空蒸发）

⏹根据二次蒸汽是否来作为另一种蒸发器的加热蒸汽，可分为：

单效蒸发：

二次蒸气不利用或用于蒸发以外的用途

多效蒸发：

二次蒸气继续用于蒸发过程

3、蒸发工艺的确定

⏹蒸发方式的选择主要取决于在蒸发过程中料液主要成分（热敏性成分）的损失和蒸发的能耗等。

⏹措施：

⏹降低蒸发时料液的沸点

⏹降低料液在蒸发器中的停留时间

4、常用的干燥方法：

⏹导热干燥：

以传热壁作为介质传到热能，亦称间接加热干燥

⏹辐射干燥：

以电磁波作为传热形式

⏹介电加热干燥：

以高频电场的交变作用加热

⏹对流干燥：

通过对流给热方式加热物料

5、喷雾干燥

⏹原理：

依靠喷雾形成含产物的小液滴，在热气流中迅速干燥。

⏹设备：

喷雾干燥机

⏹特点：

干燥速度快，干燥过程中液滴的温度不高，部分生物活性物可以干燥。

⏹产品具有良好的分散性和溶解性，生产过程简化，操作控制方便，可大规模生产。

⏹缺点：

干燥能力小，占地面积大，产品密度低，粒度小，耗能高。

6、真空冷冻干燥

⏹原理：

在高真空度下加速固态水的挥发进行干燥

⏹设备：

真空冷冻干燥机

⏹特点：

①适合生物活性物质干燥；②产物不起泡，不粘结，蓬松，易溶；③活性收率高。

⏹缺点：

①耗能高，过程需控制严格；②操作复杂，设备投资高。

蛋白质含量和纯度测定方法

含量测定:

凯氏定氮法、TCA比浊法、双缩脲法、福林-酚法、紫外线法和考马斯亮兰法（Bradford法）。

纯度衡量:

电泳法、层析法、质谱法等。

一般应采用二种以上方法鉴定纯度，而且同一原理的方法不应该采用二次。

五种蛋白质测定方法比较

方法

灵敏度

时间

原理

干扰物质

说明

凯氏定氮法

灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为2％

费时

8～10小时

将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定

非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）

用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长

双缩脲法

灵敏度低

1～20mg

中速

20~30分钟

多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物

硫酸铵；

Tris缓冲液；

某些氨基酸

用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似

紫外吸收法

较为灵敏

50～100g

快速

5～10分钟

蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收

各种嘌吟和嘧啶；

各种核苷酸

用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正

Folin－酚试剂法

灵敏度高

～5g

慢速

40～60

分钟

双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原

硫酸铵；

Tris缓冲液；

甘氨酸；

各种硫醇

耗费时间长；操作要严格计时；

颜色深浅随不同蛋白质变化

考马斯亮蓝法

灵敏度最高

1～5g

快速

5～15分钟

考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm

强碱性缓冲液；

TritonX-100;

SDS

最好的方法；

干扰物质少；

颜色稳定；

颜色深浅随不同蛋白质变化