浅论2.docx

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浅论2

浅论2

【摘要】目的：

探讨2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉（2-BFI）对星形胶质细胞糖氧剥夺（oxygen-glucosedeprivation，OGD）损伤的保护作用及脂质过氧化的影响。

方法：

制成星形胶质细胞糖氧剥夺损伤模型，分为正常对照组、OGD组、OGD+2-BFI干预组（浓度分别为、、3、6和12μg/mL），测定星形胶质细胞存活率，选出抗OGD损伤最佳浓度，以该浓度进一步观察2-BFI对脂质过氧化产物丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量的影响。

结果：

星形胶质细胞在OGD损伤后，不同浓度的2-BFI均能提高细胞存活率，其中μg/mL的效果最佳;予μg/mL2-BFI干预OGD组能显着降低MDA含量，增加GSH含量。

结论：

2-BFI能保护星形胶质细胞OGD损伤，且有抑制脂质过氧化的作用。

【关键词】咪唑啉受体;2-BFI;糖氧剥夺;脂质过氧化;大鼠

　Abstract:

Objective:

Toexploretheneuroprotectiveeffectsandlipidperoxidationof2-（2-benzonfuranyl）-2-imidazolineonoxygen-glucosedeprivationofculturedratcorticalastrocytes.Methods:

Themodelofoxygen-glucosedeprivationofculturedratcorticalastrocyteswas　weredesignedintothreegroups:

normalcontrolgroup，oxygen-glucosedeprivation（OGD）groupandoxygen-glucosedeprivation+2-BFIinterventiongroup（the　　concentrationofdrugwas，，3，6and12μg/mL），todeterminethecellsurvivalrate　　ofastrocytes，thebestdrugconcentrationwaschosen，thenthebestdrugdensitywasusedto　measurethecontentofmalondialdehyde（MDA）andreducedglutathione（GSH）.Results:

When　astrocytesweredeprivedofoxygenandglucose，differentconcentrationof2-BFIcouldsignificantlyraisedthecellsurvivalrate，andtheeffectofμg/mLwasthebest;μ　　g/mL2-BFIinterventiongroupcouldsignificantlyreducedMDAlevel，andraisedthecontentof　　reducedglutathione.Conclusion:

2-BFIcaneffectivelyprotectastrocyteinjuryafteroxygen-glucosedeprivation，andinhibitlipidperoxidation.

　　Keywords:

imidazolinereceptors;2-BFI;oxygen-glucosedeprivation;lipidperoxidation;rats

　　1984年Bousquet首次提出咪唑啉受体（imida-zolinereceptors，IR）概念，迄今的研究认为该受体有两种亚型，一种是与可乐定有高亲和力的咪唑啉I1受体（I1R），主要存在于延髓头端腹外侧，与血压的调节有关;另一种是与咪唑克生有高亲和力的咪唑啉I2受体（I2R），在人体广泛存在于神经系统、心血管系统、肾脏等组织。

2-（2-苯并呋喃基）-2-咪唑啉〔2-（2-benzofu-ranyl）-2-imidazoline，2-BFI〕是近年来才新发现的高亲和力I2R配体。

我们的前期研究发现2-BFI能够缩减大鼠脑缺血再灌注损伤后的梗死体积，降低神经功能损伤评分，抑制缺血半影区神经细胞凋亡[1]。

以往的基于[H3]-咪唑克生放射性配体定位研究认为中枢神经系统I2R主要位于星形胶质细胞的线粒体外膜上。

然而，2-BFI对缺血性损伤的星形胶质细胞是否具有保护作用及相关机制尚不清楚。

本实验采用体外培养的星形胶质细胞糖氧剥夺（oxygen-glucosedeprivation，OGD）模型，从抗脂质过氧化角度探讨2-BFI对星形胶质细胞是否有保护作用及机制。

　　1材料和方法

　　实验动物

　　出生24h内的SD大鼠，雌雄不限，SPF级，体重8～10g，购于温州医学院实验动物中心。

　　药品与主要试剂

　　DMEM/F12（1:

1）培养液（GIBCO），胎牛血清（杭州四季青），胰酶（GIBCO），2-BFI（美国Tocris公司），D-Hanks液、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体、异硫氰酸荧光黄（fluoresceinisothiocyan，FITC）标记的羊抗兔IgG（北京中衫金桥生物技术有限公司），碘化丙啶（propidiumiodide，PI）细胞核荧光、丙二醛（MDA）含量（碧云天），还原型谷胱甘肽（南京建成生物工程研究所），cck-8测定试剂盒（Dojindo公司）

　　星型胶质细胞的原代培养、鉴定

　　本研究参照以往的一些方法，取出生后24h内SD大鼠大脑皮质进行星形胶质细胞体外分离培养和纯化，进行星形胶质细胞原代、传代培养，用GFAP免疫荧光染色方法鉴定细胞纯度。

　　星形胶质细胞OGD损伤模型的建立及实验分组

　　无糖型DMEM，通入5%CO2、10%H2、85%N2混合气体，饱和15min即制成OGD的DMEM液（OGD基础培养液）。

取培养第四代的星形胶质细胞，依据Chavez等报道的方法进行如下处理：

弃培养基，用PBS冲洗3次，留少许PBS浸润细胞表面;将OGD组细胞置于厌氧罐内，弃残余PBS，加入OGD基础培养液，排尽厌氧罐内的空气，通入5%CO2、10%H2和85%N2的混合气体，进行低氧缺糖培养6h。

实验分组：

①正常对照组：

即阴性对照组，细胞不作任何处理;②OGD损伤组：

单纯OGD损伤组中的细胞，不加2-BFI干预，仅在密闭容器内低氧6h;③药物组：

在进行OGD损伤处理前24h和处理过程中，加入2-BFI孵育，终浓度分别为、、、和12μg/mL。

　　星形胶质细胞细胞活性测定

　　采用CellCount-ingKit28Assay（CCK-8）试剂盒。

简要操作步骤：

①制备好单细胞悬液，细胞按1×104个/孔接种于6个96孔培养板内（弃周围一圈，改加PBS，防止水分丢失）每孔100μL，重复九孔，每组均设一个空白或药物对照孔（只加药物或培养基，没有细胞）。

②37℃孵箱中培养24h待细胞贴壁后，弃掉原培养基，向每孔加入含药培养基100μL，置37℃、5%CO2培养箱内培养24h。

③作用24h后，正常组不动，模型组和药物组分别放入密闭的无氧罐内，细胞低氧5h后，分别取出加入10μL的CCK-8，再在厌氧罐内培养60min后，在酶标仪450nm波长处测定吸光度值，实验重复3次。

细胞存活率（%）=（待测孔吸光度值/对照组吸光度值）×100%。

　　MDA含量的测定

　　采用硫代巴比妥酸（TBA）法，各试剂按说明书配制，并将各试剂按要求量加好，旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后3500r/min，离心10min，取上清，532nm处，1m光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。

MDA含量=（测定管吸光度-测定空白管吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光度）×标准浓度（10nmol/mL）。

　　GSH含量的测定

　　各试剂按说明书配制好，取待测样本mL，加试剂一应用液2mL混匀，3500r/min，离心10min，取上清液1mL进行显色反应，混匀，静置5min，在420nm处测吸光度。

GSH含量（gGSH/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准管浓度（20mol/L）×GSH分子量（307）×稀释倍数。

　　统计学处理方法

　　组间比较采用单因素方差分析。

　　2结果

　　大鼠皮层星形胶质细胞原代培养及细胞鉴定

　　星形胶质细胞在培养第9天分化成熟，形成密集的神经细胞网络，可见胞体较大、扁平、形状多样、折光性低。

GFAP免疫荧光染色，胞质呈绿色，胞核呈红色，胞质呈绿色的即为GFAP阳性的细胞，仅有极少数的细胞仅胞核着色为GFAP阴性的细胞。

从图1可见本实验中纯化得到的多为原浆型星胶质细胞，且纯度95%。

　　2-BFI对OGD损伤后星形胶质细胞存活率的影响

　　OGD组细胞活力较正常组显着下降（P　）。

各种浓度的2-BFI组对OGD引起的损伤有保护作用，与OGD组比较细胞活力增加明显（P），但并不呈现剂量依赖性。

见表1。

　　2-BFI对星形胶质OGD剥夺损伤后MDA含量的影响

　　与正常组比较，OGD损伤增加细胞内MDA的含量（P），用2-BFI干预后，细胞内MDA含量下降，结果见表3。

　　2-BFI对星形胶质细胞OGD损伤后总GSH含量的影响

　　实验结果显示，GSH的含量在OGD和OGD+2-BFI组均明显低于正常对照组（P），OGD组GSH的含量最低;OGD+2-BFI组较OGD组明显升高（P）。

见表4。

　　3讨论

　　脑卒中是危害人类健康最重要的疾病之一，其中缺血性卒中占60%～80%。

尽管发病后3～h内，通过重组人组织型纤溶酶原激活剂（r-tPA）溶解血栓，可以获得良好的治疗效果，但由于治疗时间窗过短及潜在的出血并发症风险极大限制了其在临床治疗中的广泛应用，因此，通过干预脑组织缺血低氧所引起的一系列生理生化及病理反应，保护缺血引起的神经组织损伤（即神经保护治疗），对于缺血性卒中的治疗具有极其重要的意义。

咪唑I2R广泛存在于神经系统，尤其是在星形胶质细胞的线粒体外膜上分布广泛。

近年来，有关研究结果证明I2R的部分配体（如咪唑克生）与I2R结合后对缺血性卒中具有神经保护作用[6-9]。

2-BFI是近年来才发现的与I2R有更高亲和力的配体。

前期我们通过动物实验发现证实了2-BFI对大脑中动脉闭塞（MCAO）引起的局灶性脑缺血具有神经保护作用[1]。

本研究采用体外培养的星形胶质细胞OGD模型来模拟缺血性星形胶质细胞损伤，深入探讨2-BFI的神经保护作用和机制，结果发现不同浓度的2-BFI都能提高OGD后星形胶质细胞的存活率，这提示2-BFI对星形胶质细胞OGD损伤具有保护作用，另外从细胞存活率我们发现μg/mL的2-BFI给药后细胞活力最强，随着药物浓度的增加细胞活力反而相应的降低，因此我们推测剂量太小或太大效果都会减弱。

剂量越小效果减弱，说明2-BFI的神经保护作用存在量效关系;同时，发现当剂量超过μg/mL时，其神经保护作用反而下降，推测随剂量增大，神经保护的效果固然　　可以增强，但药物其他方面的副作用也可能增加，这样会抵消其正效应。

因此，我们推测2-BFI的神经保护作用存在一个最佳的药物浓度。

　　在缺血低氧损伤的过程中，有大量的氧自由基产生，自由基易引发富含磷脂的细胞膜　　及线粒体膜的脂质过氧化，使细胞膜及线粒体受损，发生功能障碍。

因此细胞内脂质过氧化　　水平是衡量自由基损伤的一个重要指标[10]。

其中MDA是脂质过氧化反应的最终产物，测定MDA的含量可反映组织中自由基的含量和脂质过氧化的程度，而GSH是体内主要的抗氧化剂，测定GSH的含量可反映机体的抗氧化能力。

本研究采用体外培养的星形胶质细胞OGD模型，从抗脂质过氧化角度探讨2-BFI对星形胶质细胞是否有保护作用及机制，由实验结果可以看出，培养的星形胶质细胞OGD损伤后，MDA含量增高，GSH含量下降，而2-BFI给药后MDA含量下降，GSH含量上升。

因此，我们推测OGD损伤后由于氧自由基的大量产生，超过了正常的清除能力，导致脂质过氧化，细胞损伤，而用2-BFI干预后脂质氧化水平明显降低，提示2-BFI有很好的抗脂质氧化的作用。

　　综上所述，I2R高亲合力配体2-BFI对星形胶质细胞OGD损伤具有保护作用，抑制脂质过　　氧化可能是其保护机制之一。

【参考文献】

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　　ChavezJC,BaranovaO,LinJ,et　transcriptionalacti-vatorhypoxiainduciblefactor2（HIF-2/EPAS-1）regulatestheoxygen-dependentexpressionoferythropoietinincor-ticalastrocytes[J].Neurosci,2006,26（37）:

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　　[10]YoshidaH,YanaiH,NamikiY,etal.Neuroprotectiveef-fectsofedaravone:

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（1）:

9-20.