甘油解法制备鱼油甘油二酯的研究.docx
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甘油解法制备鱼油甘油二酯的研究
酶法制备鱼油甘油二酯的研究
童记强1黄惠莉1汪泳2梁芮1
（华侨大学化工学院1，厦门361021）
（惠安瑞芳食品有限公司2，泉州362131）
摘要以鱼油为原料，研究了各因素对甘油二酯含量的影响。
在无溶剂体系中，采用固定化脂肪酶LipozymeRMIM甘油解法合成甘油二酯，考察反应温度、底物摩尔比（甘油:
鱼油）、酶添加量、反应时间对甘油二酯含量的影响。
通过响应面设计优化试验条件，确定最佳合成条件为：
反应温度50℃、酶添加量为底物总质量0.7%、底物摩尔比（甘油:
鱼油）为2.3:
1、反应时间6h，甘油二酯质量分数达到48.07%。
通过对比粗鱼油与甘油二酯的脂肪酸含量及组成，发现鱼油甘油二酯既可以较好的保持鱼油脂肪酸的组成优势，又可同时具有甘油二酯的特殊营养学特性。
关键词鱼油甘油二酯甘油解法脂肪酸
中图分类号：
TS255.6文献标识码：
A文章编号：
1003-0174（）
Lipase-CatalyzedSynthesisofDiacylglycerolfromFishOil
TongJi-qiang1HuangHui-li1WangYong2LiangRui1
（1.CollegeofChemicalEngineering,HuaqiaoUniversity1,Xiamen361021）
（2.HuianRuifangFoodCorporationLimited2,Quanzhou362131）
AbstractThefishoilwasusedasmaterialandtheinfluenceofvariousfactorsonthediacylglycerolcontentwereinvestigated.AnimmobilizedlipaseLipozymeRMIMwasusedtocatalyzethepreparationofdiacylglycerolfromthereactioninasolvent-freesystem.Theinfluenceoffactorsonreaction,suchasreactiontemperature,substratemolarratio（glycerol:
fishoil）,enzymedosageandreactiontimewereinvestigated.Theoptimalconditionsweredeterminedbyresponsesurfaceasfollows:
reactiontemperature50℃,enzymedosage0.7%,substratemolarratio（glycerol:
fishoil）2.5:
1,reactiontime6h.Undertheseconditions,thediacylglycerolmassfractionwas48.07%.Fishoildiacylglycerolcanmaintainthefattyacidofthefishoil,butalsohasthespecialnutritionalpropertiesofthediacylglyceroltocomparethefattyacidsbetweenfishoilanddiacylglycerol.
Keywordsfishoil,diacylglycerol,glycerolysis,fattyacids
甘油二酯（DAG）是一种新型的功能性油脂，具有防止肥胖、降低餐后血脂含量、防治高血脂、高血压、心脑血管病等多项生理活性和功能[1,2]。
甘油二酯与普通食用油在口感、外观以及脂肪酸组成上基本相同[3,4]，富含甘油二酯的产品已被美国食品及药物管理局（FDA）批准为公认安全物质（GRAS）。
甘油二酯作为一类多功能添加剂，在食品、医药和化工等领域有着广泛的应用[5]。
目前市场上甘油二酯食用油主要是以菜籽油、大豆油、棕榈油、橄榄油和花生油等甘油三酯（TAG）型油脂制备而来[6-11]，以鱼油为原料制备而成的甘油二酯还少有报道[12-15]。
Kuroki等[16]研究表明，富含二十碳五烯酸（EPA）的DAG能降低血糖水平，有可能作为防止与糖尿病相关的血管并发症的临床试剂；Tae-KilEom等[17]的研究发现富含n-3多不饱和脂肪酸（PUFA）的DAG可以有效地防止小鼠增重。
因此，富含n-3PUFA的DAG同时具备甘油二酯与n-3PUFA的有益之处，不仅可以替代TAG食用油作为健康人群的保健用油，也可以用于肥胖人群以及相关并发症人群的营养治疗[15]。
目前甘油解反应合成甘油二酯所用催化剂一般有化学催化剂（如：
氢氧化钠、乙醇钠、氧化镁）和脂肪酶（常用的有Novozym435、LipozymeRMIM、LipozymeTLIM），采用化学催化剂的工艺简单，但是对环境不友好，而且副产物多，后期纯化成本高。
利用酶催化制备甘油二酯，反应条件温和，能量消耗少，对环境友好，得到产物的颜色、风味、口感等均具有良好品质。
本研究以粗鱼油为原料，用LipozymeRMIM脂肪酶作为催化剂，在无溶剂体系中甘油解法合成甘油二酯，在分析各反应因素对甘油二酯含量影响的基础上，利用响应面试验设计获得甘油二酯最佳制备工艺条件，为提高鱼类加工副产品的附加值提供技术支撑。
1材料与方法
1.1材料和仪器
粗鱼油：
厦门台迈生物科技有限公司提供；油酸甘油单酯标准品、油酸甘油二酯标准品、油酸甘油三酯标准品：
美国SIGMA公司；固定化脂肪酶LipozymeRMIM：
丹麦诺维信公司。
LCsolution15C高效液相色谱仪：
日本岛津公司；RID检测器：
色谱柱SepaxBio-C18（4.6×250mm，5μm）；GCMC-QP2010Plus气相质谱联用仪：
日本岛津公司。
1.2试验方法
1.2.1固定化脂肪酶LipozymeRMIM催化鱼油甘油解反应
准确称取一定底物摩尔比的甘油和鱼油于100mL烧杯中，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上预热到一定温度的水浴体系中，搅拌速度为150r/min，并加入一定量的固定化脂肪酶LipozymeRMIM，反应一段时间后，将反应产物在8000r/min下离心5min，除去固定化脂肪酶，取上层油样低温保存备用。
1.2.2高效液相色谱法检测
取30mg甘油二酯样品，用1mL乙腈:
异丙醇（60:
40，V/V）溶解，进行高效液相色谱检测其甘油二酯含量。
色谱条件：
流动相为乙腈:
异丙醇（V/V）为60:
40；采用等浓度梯度洗脱，柱温40℃,流速0.8mL/min，洗脱时间为37min；进样量20μL。
以样品峰的保留时间与油酸甘油酯标准品的保留时间定性，按峰面积归一法计算甘油二酯和甘油三酯的含量。
1.2.3气质联用测脂肪酸组成
样品甲酯化[18]：
取2滴样品于10mL试管，加0.5mol/L氢氧化钾-甲醇溶液1.0mL，摇匀，在60℃水浴中反应30min。
取出冷却至室温，加入3mL14%硫酸-甲醇溶液，摇匀，60℃水浴加热5min，冷却至室温，加入3mL正己烷提取上层溶液用于气相色谱分析。
气相色谱条件：
色谱柱为Rtx-5Ms，载气为高纯氦（He），柱箱温度100℃，进样温度260℃，柱流量2.05mL/min，分流比30:
1。
质谱条件：
电离方式EI，离子源温度230℃，接口温度250℃，质荷比范围：
45.00~400.00m/z，检测器电压：
1kV。
升温程序为：
120℃保持1min，以10℃/min升温到200℃，保持5min，再以10℃/min升温到240℃，保持5min。
2、结果与讨论
2.1单因素试验
2.1.1酶解温度对甘油二酯的影响
由于甘油很难溶解在油脂中，对合成甘油二酯的反应是不利的，为提高甘油与鱼油的互溶性，促进甘油解反应的进行，可以适当地提高反应温度。
但温度过高，则会影响酶的空间结构和构象，从而降低酶活力，所以试验需控制适宜的反应温度。
在底物摩尔比（甘油:
粗鱼油）为1:
1，加酶量为底物质量的1%，反应时间为10h的条件下，调节反应温度分别为30、40、50、60、70℃时进行试验，考察反应温度对甘油解反应中DAG含量及TAG含量的影响，试验结果如图1。
图1反应温度对DAG含量及TAG含量的影响
由图1可知，反应温度从30~50℃时，产物中DAG的含量逐渐增加，TAG含量减少，这是由于升高温度促进了底物之间的互溶，促进甘油解程度的增大，合成产物甘油二酯含量随温度的升高而增大。
从50~70℃，DAG的含量变化不大，从试验结果看出，当温度在70℃，脂肪酶的酶活力还没明显丧失，主要是由于在几乎没有水的反应体系中，由温度升高而引起的酶因受热失活在反应体系中被大大削弱了，这也是非水相酶催化反应的一个显著的优点[19]。
随着温度的升高，甘油在反应体系中的溶解度会有很大提高，但是酶长时间处于较高温度下，容易达到酶变性的活化能，酶活性下降。
综合考虑底物的互溶性以及酶的活性，故试验适宜反应温度选择为50℃。
2.1.2底物摩尔比对合成甘油二酯的影响
在脂肪酶催化合成反应中，甘油与鱼油的比例是决定甘油解产物组成的重要因素，底物摩尔比的改变会影响体系的稳定性及产物的扩散速率与含量。
在反应温度为40℃，加酶量为底物质量的1%，反应时间为10h的条件下，调节底物摩尔比（甘油:
粗鱼油）分别为1:
2、1:
1、2:
1、3:
1、4:
1时进行试验，考察底物摩尔比对甘油解反应中DAG含量以及TAG含量的影响，试验结果如图2所示。
图2底物摩尔比对DAG含量及TAG含量的影响
在底物摩尔比（甘油:
粗鱼油）为1:
2~2:
1范围内，随着底物摩尔比的增加，DAG的含量明显增加。
说明当甘油的含量逐渐增加时，促进更多的鱼油甘油解，过量的甘油增加酯化程度，使得反应平衡向产物甘油二酯的方向移动。
当甘油和鱼油的摩尔比达到2:
1以后，继续增加甘油含量，DAG含量没有明显变化。
Tae-KilEom等[17]以研究发现，甘油和金枪鱼鱼油的最佳摩尔比为3:
1，这与本文研究结果较为接近。
在试验过程中，发现当底物摩尔比达到4:
1时，明显有甘油剩余，因此继续增加的甘油没有参与反应，故最适的底物摩尔比（甘油:
粗鱼油）选择2:
1。
2.1.3加酶量对合成甘油二酯的影响
在无溶剂体系中，脂肪酶的添加量是影响DAG合成率的一个因素。
在反应温度为40℃，底物摩尔比（甘油:
粗鱼油）为1:
1，反应时间为10h的条件下，调节固定化脂肪酶LipozymeRMIM的添加量分别为底物总质量的0.1%、0.5%、1%、2%、3%进行试验，考察加酶量对甘油解反应中DAG含量以及TAG含量的影响，试验结果如图3所示。
图3加酶量对DAG含量及TAG含量的影响
当加酶量从0.1%加到2%时，TAG质量分数从30.68%下降到了5%。
当加酶量超过2%之后，DAG和TAG含量变化不明显。
加酶量在0.1%~0.5%范围内，甘油二酯的含量明显增加，这是因为随着脂肪酶用量的增加，甘油解的速度加快，因此甘油二酯含量增加。
当加酶量超过1%后，产物中甘油二酯的含量却不断下降，Kristensen等[20]研究发现当加酶量过多时，DAG的含量反而下降，这是因为过量的酶的降低了甘油解的程度，过量的酶可能会导致无规律的混合，从而增加对传质的限制。
Zhang-QunDuan等[21]认为过量的酶导致生物催化剂结块和可能存在扩散问题，因此酶过量会使得DAG含量下降。
当加酶量为2%时，TAG含量最少，但此时的DAG含量却不是很高，综合考虑DAG含量以及经济问题，最适加酶量选择0.5%。
2.1.4酶解时间对合成甘油二酯的影响
当体系反应时间不同时，底物的甘油解反应程度也不相同，因此反应时间也是影响DAG合成率的因素之一。
在反应温度为40℃，底物摩尔比（甘油:
粗鱼油）为1:
1，加酶量为底物质量的1%，调节反应时间分别为2、4、6、8、10、12h进行试验，考察酶解时间对甘油解反应中DAG含量以及TAG含量的影响，试验结果如图4所示。
图4反应时间对DAG含量及TAG含量的影响
反应时间在2~6h范围内，DAG的含量明显增加，TAG含量减少，DAG质量分数达到40.92%。
当反应时间超过8h后，整个反应趋于平衡，TAG的和DAG含量都没有明显变化。
这是由于甘油解反应遵循化学平衡反应的规律，反应进行一定时间后将达到平衡，在反应体系达到平衡之后即使再增加反应时间，转化率也不会增加。
当反应时间为6h时，虽然DAG质量分数比较高，但此时TAG的质量分数比较高，含有16.06%；10h时TAG质量分数最少，仅有8.02%。
但是反应时间越长，试验的能耗越大，故在合理范围内应尽量缩短反应时间。
因此综合考虑DAG含量以及TAG的含量问题，故最适反应时间选择8h。
2.2响应面设计方案及结果
根据单因素试验的试验结果，选取反应时间、反应温度、底物摩尔比（甘油:
鱼油）、加酶量4个影响因素为自变量，以反应产物中DAG的含量作为响应值，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，运用DesignExpert8.0进行响应面设计。
+1、0、-1分别代表四因素的高、中、低水平，设计响应面因子及水平如表1所示，试验设计及试验结果如表2所示。
表1响应面因子和水平
水平
A反应温度
/℃
B反应时间
/h
C底物摩尔比
/（mol/mol）
D酶添加量
/%
-1
45
6
1.5
0.3
0
50
8
2.0
0.5
1
55
10
2.5
0.7
表2响应面设计及结果
试验号
A
B
C
D
DAG质量分数/%
1
45.00
8.00
2.00
0.30
38.08
2
55.00
8.00
2.50
0.50
40.44
3
45.00
8.00
1.50
0.50
35.13
4
55.00
8.00
1.50
0.50
39.37
5
55.00
8.00
2.00
0.30
38.89
6
50.00
8.00
2.00
0.50
44.92
7
50.00
10.00
2.50
0.50
38.67
8
50.00
6.00
2.50
0.50
46.35
9
55.00
6.00
2.00
0.50
44.04
10
45.00
10.00
2.00
0.50
41.04
11
50.00
10.00
2.00
0.30
40.82
12
50.00
8.00
2.50
0.30
39.92
13
45.00
8.00
2.00
0.70
45.32
14
50.00
6.00
2.00
0.70
46.12
15
50.00
10.00
1.50
0.50
40.43
16
45.00
6.00
2.00
0.50
42.20
17
50.00
8.00
2.50
0.70
44.14
18
45.00
8.00
2.50
0.50
39.96
19
50.00
6.00
1.50
0.50
38.30
20
50.00
10.00
2.00
0.70
40.94
21
50.00
6.00
2.00
0.30
38.09
22
50.00
8.00
1.50
0.70
42.00
23
55.00
8.00
2.00
0.70
44.02
24
50.00
8.00
2.00
0.50
44.81
25
50.00
8.00
2.00
0.50
45.66
26
55.00
10.00
2.00
0.50
39.70
27
50.00
8.00
1.50
0.30
37.06
对表2的试验数据进行回归分析，得DAG含量的二次回归方程为：
Y（%）=45.13+0.39A-1.13B+1.43C+2.47D-0.79AB-0.94AC-0.53AD-2.45BC-1.98BD-0.18CD-2.42A2-1.35B2-3.22C2-1.52D2
对回归方程进行方差分析，结果见表3。
从表3可以看出，模型R2=0.9363，校正R2Adj=0.8619，P＜0.0001，表明模型达到高度显著水平，且失拟项P=0.1301＞0.05，即失拟项不显著，说明这个回归模型拟合的很好。
因此，此模型建立成功，适合用于甘油解法合成鱼油甘油二酯的条件优化。
其中B、C、D、BC、BD、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.05，对甘油二酯的影响是显著的，按照模型的线性数值大小，可以得出对甘油二酯含量影响大小依次为：
D>C>B>A，即加酶量>底物摩尔比>反应时间>温度。
响应面试验结果表明，底物摩尔比和酶添加量对DAG的产率影响为极度显著，反应时间和底物摩尔比、反应时间和加酶量比的交互作用对DAG产率的影响较大。
表3回归模型方差分析表
来源
总平方和
自由度
平均平方
F值
P>F
模型
228.34
14
16.31
12.59
<0.0001
显著
A-温度
1.86
1
1.86
1.44
0.2534
B-时间
15.19
1
15.19
11.72
0.0050
C-摩尔比
24.62
1
24.62
19.01
0.0009
D-加酶量
73.41
1
73.41
56.66
<0.0001
AB
2.53
1
2.53
1.95
0.1877
AC
3.53
1
3.53
2.73
0.1245
AD
1.11
1
1.11
0.86
0.3723
BC
24.06
1
24.06
18.57
0.0010
BD
15.64
1
15.64
12.07
0.0046
CD
0.13
1
0.13
0.10
0.7572
A2
31.17
1
31.17
24.06
0.0004
B2
9.77
1
9.77
7.54
0.0177
C2
55.30
1
55.30
42.68
<0.0001
D2
12.26
1
12.26
9.46
0.0096
残差
15.55
12
1.30
失拟项
15.12
10
1.51
7.08
0.1301
不显著
纯误差
0.43
2
0.21
总和
243.89
26
R2=0.9363
R2Adj=0.8619
2.3最佳条件预测与验证
根据Box–Behnken方法分析，得到甘油二酯含量最佳反应条件为：
反应温度50.13℃、脂肪酶添加量0.7%、底物摩尔比（甘油：
鱼油）为2.29:
1、时间6.00h，此时DAG质量分数预测值为48.90%。
将其最佳反应条件调整为：
反应温度50℃、脂肪酶添加量为0.7%、底物摩尔比（甘油:
鱼油）2.3:
1、时间6h，在此条件下进行三次平行试验，得到平均值为48.07%，与理论值接近。
说明采用响应面优化得到的DAG含量数据可靠，具有预测使用价值。
2.4甘油酯脂肪酸分析
粗鱼油以及合成后DAG的脂肪酸如表4所示。
从表4可看出，鱼油的脂肪酸主要组分为棕榈酸、油酸和棕榈油酸。
从粗鱼油与合成的DAG的脂肪酸组成及含量可以看出，二者的种类及含量几乎没有变化，说明通过本试验制备甘油二酯没有破坏其中脂肪酸的组成，合成的鱼油DAG能够保持鱼油原有的脂肪酸组成，这对鱼油DAG的营养价值有重要的意义。
表4粗鱼油及甘油二酯的脂肪酸组成
序号
脂肪酸名称
粗鱼油中脂肪酸百分含量/%
甘油二酯中脂肪酸百分含量/%
1
月桂酸C12:
0
0.14
0.15
2
肉豆蔻酸C14:
0
7.52
7.64
3
十五烷酸C15:
0
0.48
0.49
4
棕榈酸C16:
0
22.07
22.73
5
棕榈油酸C16:
1
18.23
17.99
6
十七酸C17:
0
0.16
0.16
7
硬脂酸C18:
0
3.44
3.42
8
油酸C18:
1
25.09
24.90
9
亚油酸C18:
2
2.78
2.69
10
二十碳烯酸C20:
1
8.68
8.56
11
二十碳四烯酸C20:
4
1.19
1.16
12
EPAC20:
5
3.97
3.93
13
DHAC22:
6
5.73
5.69
3、结论
本研究在无溶剂体系中，采用甘油解法，用固定化脂肪酶LipozymeRMIM催化鱼油制备甘油二酯，所得产物采用高效液相分析其甘油二酯含量。
通过对影响DAG产率反应温度、底物摩尔比、酶添加量、反应时间的单因素试验考察，结合Box–Behnken方法进行响应面试验设计，确立了甘油解法制备鱼油甘油二酯的最佳工艺条件：
反应温度50℃、时间6h、脂肪酶添加量0.7%、底物摩尔比2.3:
1，甘油二酯质量分数为48.27%。
通过对比粗鱼油与甘油二酯的脂肪酸含量，发现脂肪酸含量及组成几乎没有变化，因此鱼油甘油二酯既可以较好的保持鱼油脂肪酸的组成优势，又可同时具有DAG的特殊营养学特性，为进一步研究鱼油甘油二酯提供理论依据，同时也可提供鱼油的附加值。
参考文献
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