甘油解法制备鱼油甘油二酯的研究.docx

1、甘油解法制备鱼油甘油二酯的研究酶法制备鱼油甘油二酯的研究童记强1 黄惠莉1 汪泳2 梁芮1（华侨大学化工学院1，厦门 361021）（惠安瑞芳食品有限公司2，泉州 362131）摘 要 以鱼油为原料，研究了各因素对甘油二酯含量的影响。在无溶剂体系中，采用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM甘油解法合成甘油二酯，考察反应温度、底物摩尔比(甘油:鱼油)、酶添加量、反应时间对甘油二酯含量的影响。通过响应面设计优化试验条件，确定最佳合成条件为：反应温度50 、酶添加量为底物总质量0.7%、底物摩尔比(甘油:鱼油)为2.3:1、反应时间6 h，甘油二酯质量分数达到48.07%。通过对比粗鱼油与甘油二

2、酯的脂肪酸含量及组成，发现鱼油甘油二酯既可以较好的保持鱼油脂肪酸的组成优势，又可同时具有甘油二酯的特殊营养学特性。关键词 鱼油 甘油二酯 甘油解法 脂肪酸中图分类号：TS255.6 文献标识码：A 文章编号：1003-0174( )Lipase-Catalyzed Synthesis of Diacylglycerol from Fish OilTong Ji-qiang1 Huang Hui-li1 Wang Yong2 Liang Rui1(1.College of Chemical Engineering, Huaqiao University1, Xiamen 361021)(2. H

3、uian Ruifang Food Corporation Limited2, Quanzhou 362131) Abstract The fish oil was used as material and the influence of various factors on the diacylglycerol content were investigated. An immobilized lipase Lipozyme RM IM was used to catalyze the preparation of diacylglycerol from the reaction in a

4、 solvent-free system. The influence of factors on reaction, such as reaction temperature, substrate molar ratio (glycerol: fish oil), enzyme dosage and reaction time were investigated. The optimal conditions were determined by response surface as follows: reaction temperature 50 , enzyme dosage 0.7%

5、, substrate molar ratio (glycerol: fish oil) 2.5:1, reaction time 6 h. Under these conditions, the diacylglycerol mass fraction was 48.07%. Fish oil diacylglycerol can maintain the fatty acid of the fish oil, but also has the special nutritional properties of the diacylglycerol to compare the fatty

6、acids between fish oil and diacylglycerol. Key words fish oil, diacylglycerol, glycerolysis, fatty acids甘油二酯(DAG)是一种新型的功能性油脂，具有防止肥胖、降低餐后血脂含量、防治高血脂、高血压、心脑血管病等多项生理活性和功能1, 2。甘油二酯与普通食用油在口感、外观以及脂肪酸组成上基本相同3, 4，富含甘油二酯的产品已被美国食品及药物管理局(FDA)批准为公认安全物质(GRAS)。甘油二酯作为一类多功能添加剂，在食品、医药和化工等领域有着广泛的应用5。目前市场上甘油二酯食用油主要是以菜籽

7、油、大豆油、棕榈油、橄榄油和花生油等甘油三酯(TAG)型油脂制备而来6-11，以鱼油为原料制备而成的甘油二酯还少有报道12-15。Kuroki等16研究表明，富含二十碳五烯酸 (EPA)的DAG能降低血糖水平，有可能作为防止与糖尿病相关的血管并发症的临床试剂；Tae-Kil Eom等17的研究发现富含n-3 多不饱和脂肪酸(PUFA)的DAG可以有效地防止小鼠增重。因此，富含n-3 PUFA的DAG同时具备甘油二酯与n-3 PUFA的有益之处，不仅可以替代TAG食用油作为健康人群的保健用油，也可以用于肥胖人群以及相关并发症人群的营养治疗15。目前甘油解反应合成甘油二酯所用催化剂一般有化学催化剂

8、(如：氢氧化钠、乙醇钠、氧化镁)和脂肪酶（常用的有Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM），采用化学催化剂的工艺简单，但是对环境不友好，而且副产物多，后期纯化成本高。利用酶催化制备甘油二酯，反应条件温和，能量消耗少，对环境友好，得到产物的颜色、风味、口感等均具有良好品质。本研究以粗鱼油为原料，用Lipozyme RM IM脂肪酶作为催化剂，在无溶剂体系中甘油解法合成甘油二酯，在分析各反应因素对甘油二酯含量影响的基础上，利用响应面试验设计获得甘油二酯最佳制备工艺条件，为提高鱼类加工副产品的附加值提供技术支撑。1材料与方法1.1材料和仪器粗鱼油：厦门台迈

9、生物科技有限公司提供；油酸甘油单酯标准品、油酸甘油二酯标准品、油酸甘油三酯标准品：美国SIGMA公司；固定化脂肪酶Lipozyme RM IM：丹麦诺维信公司。LC solution 15C高效液相色谱仪：日本岛津公司；RID检测器：色谱柱Sepax Bio-C18(4.6250 mm，5 m)；GCMC-QP 2010 Plus气相质谱联用仪：日本岛津公司。1.2试验方法1.2.1 固定化脂肪酶Lipozyme RM IM 催化鱼油甘油解反应准确称取一定底物摩尔比的甘油和鱼油于100 mL烧杯中，将烧杯置于恒温磁力搅拌器上预热到一定温度的水浴体系中，搅拌速度为150 r/min，并加入一定量

10、的固定化脂肪酶Lipozyme RM IM，反应一段时间后，将反应产物在8000 r/min下离心5 min，除去固定化脂肪酶，取上层油样低温保存备用。1.2.2 高效液相色谱法检测取30 mg甘油二酯样品，用1 mL乙腈:异丙醇(60:40，V/V)溶解，进行高效液相色谱检测其甘油二酯含量。色谱条件：流动相为乙腈:异丙醇(V/V)为60:40；采用等浓度梯度洗脱，柱温40 ,流速0.8 mL/min，洗脱时间为37 min；进样量20 L。以样品峰的保留时间与油酸甘油酯标准品的保留时间定性，按峰面积归一法计算甘油二酯和甘油三酯的含量。1.2.3 气质联用测脂肪酸组成样品甲酯化18：取2滴样品

11、于10 mL试管，加0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液1.0 mL，摇匀，在60 水浴中反应30 min。取出冷却至室温，加入3 mL 14% 硫酸-甲醇溶液，摇匀，60 水浴加热5 min，冷却至室温，加入3 mL正己烷提取上层溶液用于气相色谱分析。气相色谱条件：色谱柱为Rtx-5Ms，载气为高纯氦(He)，柱箱温度100 ，进样温度 260 ，柱流量2.05 mL/min，分流比30:1。质谱条件：电离方式EI，离子源温度230 ，接口温度250 ，质荷比范围：45.00400.00 m/z，检测器电压：1 kV。升温程序为：120 保持1 min，以10 /min升温到200 ，保持5

12、 min，再以10 /min升温到240 ，保持5 min。2、结果与讨论2.1 单因素试验2.1.1 酶解温度对甘油二酯的影响由于甘油很难溶解在油脂中，对合成甘油二酯的反应是不利的，为提高甘油与鱼油的互溶性，促进甘油解反应的进行，可以适当地提高反应温度。但温度过高，则会影响酶的空间结构和构象，从而降低酶活力，所以试验需控制适宜的反应温度。在底物摩尔比(甘油:粗鱼油)为1:1，加酶量为底物质量的1%，反应时间为10 h的条件下，调节反应温度分别为30、40、50、60、70 时进行试验，考察反应温度对甘油解反应中DAG含量及TAG含量的影响，试验结果如图1。图1 反应温度对DAG含量及TAG含

13、量的影响由图1可知，反应温度从30 50 时，产物中DAG的含量逐渐增加，TAG含量减少，这是由于升高温度促进了底物之间的互溶，促进甘油解程度的增大，合成产物甘油二酯含量随温度的升高而增大。从50 70 ，DAG的含量变化不大，从试验结果看出，当温度在70 ，脂肪酶的酶活力还没明显丧失，主要是由于在几乎没有水的反应体系中，由温度升高而引起的酶因受热失活在反应体系中被大大削弱了，这也是非水相酶催化反应的一个显著的优点19。随着温度的升高，甘油在反应体系中的溶解度会有很大提高，但是酶长时间处于较高温度下，容易达到酶变性的活化能，酶活性下降。综合考虑底物的互溶性以及酶的活性，故试验适宜反应温度选择为

14、50 。2.1.2 底物摩尔比对合成甘油二酯的影响在脂肪酶催化合成反应中，甘油与鱼油的比例是决定甘油解产物组成的重要因素，底物摩尔比的改变会影响体系的稳定性及产物的扩散速率与含量。在反应温度为40 ，加酶量为底物质量的1%，反应时间为10 h的条件下，调节底物摩尔比(甘油:粗鱼油)分别为1:2、1:1、2:1、3:1、4:1时进行试验，考察底物摩尔比对甘油解反应中 DAG含量以及TAG含量的影响，试验结果如图2所示。图2 底物摩尔比对DAG含量及TAG含量的影响在底物摩尔比(甘油:粗鱼油)为1:22:1范围内，随着底物摩尔比的增加，DAG的含量明显增加。说明当甘油的含量逐渐增加时，促进更多的鱼

15、油甘油解，过量的甘油增加酯化程度，使得反应平衡向产物甘油二酯的方向移动。当甘油和鱼油的摩尔比达到2:1以后，继续增加甘油含量，DAG含量没有明显变化。Tae-Kil Eom等17以研究发现，甘油和金枪鱼鱼油的最佳摩尔比为3:1，这与本文研究结果较为接近。在试验过程中，发现当底物摩尔比达到4:1时，明显有甘油剩余，因此继续增加的甘油没有参与反应，故最适的底物摩尔比(甘油:粗鱼油)选择2:1。2.1.3 加酶量对合成甘油二酯的影响在无溶剂体系中，脂肪酶的添加量是影响DAG合成率的一个因素。在反应温度为40 ，底物摩尔比(甘油:粗鱼油)为1:1，反应时间为10 h的条件下，调节固定化脂肪酶Lipoz

16、yme RM IM的添加量分别为底物总质量的0.1%、0.5%、1%、2%、3%进行试验，考察加酶量对甘油解反应中DAG含量以及TAG含量的影响，试验结果如图3所示。图3 加酶量对DAG含量及TAG含量的影响当加酶量从0.1%加到2%时，TAG质量分数从30.68%下降到了5%。当加酶量超过2%之后，DAG和TAG含量变化不明显。加酶量在0.1%0.5%范围内，甘油二酯的含量明显增加，这是因为随着脂肪酶用量的增加，甘油解的速度加快，因此甘油二酯含量增加。当加酶量超过1%后，产物中甘油二酯的含量却不断下降，Kristensen等20研究发现当加酶量过多时，DAG的含量反而下降，这是因为过量的酶的

17、降低了甘油解的程度，过量的酶可能会导致无规律的混合，从而增加对传质的限制。Zhang-Qun Duan等21认为过量的酶导致生物催化剂结块和可能存在扩散问题，因此酶过量会使得DAG含量下降。当加酶量为2%时，TAG含量最少，但此时的DAG含量却不是很高，综合考虑DAG含量以及经济问题，最适加酶量选择0.5%。2.1.4 酶解时间对合成甘油二酯的影响当体系反应时间不同时，底物的甘油解反应程度也不相同，因此反应时间也是影响DAG合成率的因素之一。在反应温度为40 ，底物摩尔比(甘油:粗鱼油)为1:1，加酶量为底物质量的1%，调节反应时间分别为2、4、6、8、10、12 h进行试验，考察酶解时间对甘

18、油解反应中 DAG含量以及TAG含量的影响，试验结果如图4所示。图4 反应时间对DAG含量及TAG含量的影响反应时间在26 h范围内，DAG的含量明显增加，TAG含量减少，DAG质量分数达到40.92%。当反应时间超过8 h后，整个反应趋于平衡，TAG的和DAG含量都没有明显变化。这是由于甘油解反应遵循化学平衡反应的规律，反应进行一定时间后将达到平衡，在反应体系达到平衡之后即使再增加反应时间，转化率也不会增加。当反应时间为6 h时，虽然DAG质量分数比较高，但此时TAG的质量分数比较高，含有16.06%；10 h时TAG质量分数最少，仅有8.02%。但是反应时间越长，试验的能耗越大，故在合理范

19、围内应尽量缩短反应时间。因此综合考虑DAG含量以及TAG的含量问题，故最适反应时间选择8 h。2.2 响应面设计方案及结果根据单因素试验的试验结果，选取反应时间、反应温度、底物摩尔比(甘油:鱼油)、加酶量4个影响因素为自变量，以反应产物中DAG的含量作为响应值，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，运用Design Expert 8.0进行响应面设计。+1、0、-1分别代表四因素的高、中、低水平，设计响应面因子及水平如表1所示，试验设计及试验结果如表2所示。表1 响应面因子和水平水平A 反应温度/B 反应时间/hC 底物摩尔比/(mol/mol)D 酶添加量/%-14561.50.3

20、05082.00.5155102.50.7表2 响应面设计及结果试验号ABCDDAG质量分数/%145.008.002.000.3038.08255.008.002.500.5040.44345.008.001.500.5035.13455.008.001.500.5039.37555.008.002.000.3038.89650.008.002.000.5044.92750.0010.002.500.5038.67850.006.002.500.5046.35955.006.002.000.5044.041045.0010.002.000.5041.041150.0010.002.000.3

21、040.821250.008.002.500.3039.921345.008.002.000.7045.321450.006.002.000.7046.121550.0010.001.500.5040.431645.006.002.000.5042.201750.008.002.500.7044.141845.008.002.500.5039.961950.006.001.500.5038.302050.0010.002.000.7040.942150.006.002.000.3038.092250.008.001.500.7042.002355.008.002.000.7044.022450

22、.008.002.000.5044.812550.008.002.000.5045.662655.0010.002.000.5039.702750.008.001.500.3037.06 对表2的试验数据进行回归分析，得DAG含量的二次回归方程为：Y(%)=45.13+0.39A-1.13B+1.43C+2.47D-0.79AB-0.94AC-0.53AD-2.45BC-1.98BD-0.18CD-2.42A2-1.35B2-3.22C2-1.52D2对回归方程进行方差分析，结果见表3。从表3可以看出，模型R2=0.936 3，校正R2Adj=0.861 9 ，P0.000 1，表明模型达到高

23、度显著水平，且失拟项P=0.130 10.05，即失拟项不显著，说明这个回归模型拟合的很好。因此，此模型建立成功，适合用于甘油解法合成鱼油甘油二酯的条件优化。其中B、C、D、BC、BD、A2、B2、C2、D2的P值均小于0.05，对甘油二酯的影响是显著的，按照模型的线性数值大小，可以得出对甘油二酯含量影响大小依次为：DCBA，即加酶量底物摩尔比反应时间温度。响应面试验结果表明，底物摩尔比和酶添加量对DAG的产率影响为极度显著，反应时间和底物摩尔比、反应时间和加酶量比的交互作用对 DAG 产率的影响较大。表3 回归模型方差分析表来源总平方和自由度平均平方F值PF模型228.341416.3112

24、.59 0.000 1显著A-温度1.8611.861.440.253 4B-时间15.19115.1911.720.005 0C-摩尔比24.62124.6219.010.000 9D-加酶量73.41173.4156.66 0.000 1AB2.5312.531.950.187 7AC3.5313.532.730.124 5AD1.1111.110.860.372 3BC24.06124.0618.570.001 0BD15.64115.6412.070.004 6CD0.1310.130.100.757 2A231.17131.1724.060.000 4B29.7719.777.540

25、.017 7C255.30155.3042.68 0.000 1D212.26112.269.460.009 6残差15.55121.30失拟项15.12101.517.080.130 1不显著纯误差0.4320.21总和243.8926R2=0.936 3R2Adj=0.861 92.3 最佳条件预测与验证根据BoxBehnken方法分析，得到甘油二酯含量最佳反应条件为：反应温度50.13 、脂肪酶添加量0.7%、底物摩尔比(甘油：鱼油)为2.29:1、时间6.00 h，此时DAG质量分数预测值为48.90%。将其最佳反应条件调整为：反应温度50 、脂肪酶添加量为0.7%、底物摩尔比(甘油:

26、鱼油)2.3:1、时间6 h，在此条件下进行三次平行试验，得到平均值为48.07%，与理论值接近。说明采用响应面优化得到的DAG含量数据可靠，具有预测使用价值。2.4 甘油酯脂肪酸分析粗鱼油以及合成后DAG的脂肪酸如表4所示。从表4可看出，鱼油的脂肪酸主要组分为棕榈酸、油酸和棕榈油酸。从粗鱼油与合成的DAG的脂肪酸组成及含量可以看出，二者的种类及含量几乎没有变化，说明通过本试验制备甘油二酯没有破坏其中脂肪酸的组成，合成的鱼油DAG能够保持鱼油原有的脂肪酸组成，这对鱼油DAG的营养价值有重要的意义。表4 粗鱼油及甘油二酯的脂肪酸组成序号脂肪酸名称粗鱼油中脂肪酸百分含量/%甘油二酯中脂肪酸百分含量

27、/%1月桂酸 C12:00.140.152肉豆蔻酸 C14:07.527.643十五烷酸 C15:00.480.494棕榈酸 C16:022.0722.735棕榈油酸 C16:118.2317.996十七酸 C17:00.160.167硬脂酸 C18:03.443.428油酸 C18:125.0924.909亚油酸 C18:22.782.6910二十碳烯酸 C20:18.688.5611二十碳四烯酸 C20:41.191.1612EPA C20:53.973.9313DHA C22:65.735.693、结论本研究在无溶剂体系中，采用甘油解法，用固定化脂肪酶Lipozyme RM IM催化鱼油

28、制备甘油二酯，所得产物采用高效液相分析其甘油二酯含量。通过对影响DAG产率反应温度、底物摩尔比、酶添加量、反应时间的单因素试验考察，结合BoxBehnken方法进行响应面试验设计，确立了甘油解法制备鱼油甘油二酯的最佳工艺条件：反应温度50 、时间6 h、脂肪酶添加量0.7%、底物摩尔比2.3:1，甘油二酯质量分数为48.27%。通过对比粗鱼油与甘油二酯的脂肪酸含量，发现脂肪酸含量及组成几乎没有变化，因此鱼油甘油二酯既可以较好的保持鱼油脂肪酸的组成优势，又可同时具有DAG的特殊营养学特性，为进一步研究鱼油甘油二酯提供理论依据，同时也可提供鱼油的附加值。参考文献 1 Saito S, Yamagu

29、chi T, Shoji K, et al. Effect of low concentration of diacylglycerol on mildly postprandial hypertriglyceridemiaJ. Atherosclerosis. 2010, 213(2): 539-544 2 Zheng M, Huang Q, Huang F, et al. Production of Novel “Functional Oil” Rich in Diglycerides and Phytosterol Esters with “One-Pot” Enzymatic TransesterificationJ. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2014, 62(22): 5142-5148 3 Morita O, Soni M G. Safety assessment of diacylglycerol oil as an edible oil: A review of the published literatureJ. Food and Chemic