免疫印迹SOP.docx

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免疫印迹SOP

免疫印迹技术（Immunobloting）SOP

免疫印迹从早期用抗体直接“着染”聚丙烯酰胺凝胶内的蛋白（Burridge1976;Showe等1976）发展为现如今使用多样化复制技术的方法。

对于仅有50多年历史的分子生物学来说，30岁的免疫印迹，即“WesternBlot”可谓“古老”。

尽管它存在这样那样的问题，但仍然广泛应用于多种基因功能、转基因检测等实验中。

命名为“WesternBlot”，与“NorthernBlot”一样，完全源于科学家的幽默。

在一次鸡尾酒会上，某人（现在已无人考证）开了这样一个玩笑，所有人都笑了，这个命名就这样延续了下来。

咱们书归正传，下面让我们来介绍一下本实验室的WesternBlot的实验流程、注意事项以及一点点心得体会。

一、样品制备

（一）鱼血清样品制备

1.将冻存后的鱼血清4℃融化。

2.血清10000r/m，5min，离心，取上清和（2×）loadingbuffer等体积混匀。

3.沸水煮样，3-5min，10000r/m，5min，离心，取上清上样。

（二）细胞样品制备

1.取细胞3000r/m，5min，将细胞用PBS洗三遍。

2.将细胞样品和（2×）loadingbuffer等体积混匀。

3.沸水煮样，3-5min，10000r/m，5min，离心，取上清上样。

（三）组织样品制备

1.在组织块中加入少量的液氮，快速敲击，将组织研碎，少量液氮，反复几次。

2.边加液氮，边加（2×）loadingbuffer细胞裂解液，继续研磨，4℃放置一会,待buffer变回液体状，回收。

3.沸水煮样，3-5min，10000r/m，5min，离心，取上清上样。

（四）注意事项

1.由于日本七鳃鳗血清中含有大量的胶原蛋白，如果不将其去除会对后面的实验以及Co-IP都会产生很大的影响，所以在煮样前先将其10000r/m离心，取上清，去除胶原蛋白。

2.处理细胞时一定要将细胞清洗干净，因为用来培养细胞的培养基或是冻存液中含有非常丰富的BSA（牛血清白蛋白）之类的蛋白质，若直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在60-46kDa之间的时候；用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。

因为此区间蛋白（主要是BSA）浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。

3.样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。

这时候常规做法有:

①再煮5min。

②1ml用注射器反复吹打。

③再就是超声破碎，要注意超声破碎的条件，超声时间不易超过5min，停顿时间要长于超声时间，总的超声时间要依据样品量以及样品的粘稠程度而定，若不是很粘稠，1min即可。

（从经验看，超声的效果要好于注射器吹打的效果）

二、蛋白电泳

电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆，这里就不一一赘述。

本实验室采用

JM-250型蛋白电泳仪，浓缩胶采用86V，分离胶采用156V。

注意事项：

1.30%聚丙烯酰胺会降解，要4度避光保存。

2.配胶用玻璃板和边条应及时洗净。

玻板未洗净的坏处很多。

尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。

玻板没洗净的另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。

3.上样时，不要把tip深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶和玻板，样品会泄露。

4.增加上样量不一定会提高荧光信号强度。

增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。

因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，增强目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。

增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。

5.如果第二天实验时间比较紧张可提前将SDSPAGE胶配好，放于大的自封袋中，将空气赶出并封死，放于4℃过夜。

（关于这点，网上众说纷纭，也有说放于常温即可，4℃低温可能导SDS析出，不过经过实践检验，我们的做法并无大碍）

6.在跑长时间的电泳时，电泳往往会产生大量的热量，这时要想办法给胶散热，否则条带变形。

三、转印

转印可分为湿转和半干转，本实验室采用的是半干转，下面的描述主要是针对的是半干转

湿转只做简单的介绍。

（一）实验步骤（三明治法）

1.根据胶的大小，剪裁6张滤纸（上三层，下三层），裁一张PVDF膜。

原则：

保证胶最大，PVDF膜略小于胶，略大于滤纸。

2.将PVDF膜的左上角剪去，以便分清正反。

如图

3.将PVDF膜浸泡于甲醇溶液中，1-2min。

再浸泡于水中1-2min，然后再浸泡于膜转移缓冲液中1-2min。

4将滤纸和胶浸泡于膜转移缓冲液当中，7-8min。

5.按照下图方法在转膜仪中将滤纸、膜、胶叠加在一起。

5.转膜时间是，30min-1h

（二）注意事项

1.半干转和湿转

这两种转印方法各有优劣。

湿转适合所有的蛋白，转膜效率最佳，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转（下文会具体给出条件）；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。

蛋白分子大小如何界定呢？

习惯上认为150KDa以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，当然这只是一个相对标准。

因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转。

2.PVDF膜和NC膜

PVDF膜比NC膜对蛋白的截留更高（但NC带负电性，理论上它的吸附量应该更高，所以通常同样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜对小分子的截留明显不如NC膜，因此交联在预染marker上的颜料小分子很容易穿过PVDF膜，造成转膜过度的假象（除可考虑提升甲醇浓度至25%外，也可以考虑增加marker的上样量）；NC膜没有这种问题，不如PVDF膜的地方，是它的强度：

干燥的膜易碎。

此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22μm孔径的转印膜，但也不是一定必须。

我们采用的是0.45μm的PVDF膜。

3.预染的marker不仅作为一个分子量大小的指针，当然同时可确认之前的转膜操作无误（没有插反电极，放反膜），也可为后续抗体孵育操作时膜的正反面做必要的提示。

然而如上所述，如果预染marker中的小分子量蛋白穿过膜，透到滤纸上怎么办，这样便起不到指示的作用了。

我们可以在“三明治”制作的同时，在marker对应的膜的位置，用剪刀剪一个小口，这样就在膜上形成了由小口组成的“marker”。

（只是注意在制作“三明治”和转膜的时候胶的位置不发生偏移就行）

4.对于大蛋白转印，很多书本建议采用低浓度胶，如6%SDS-PAGE。

但实际操作发现，6%太软，制作转印三明治的操作非常麻烦。

个人认为，采用8%即可。

5.转膜最好在低温进行（高温会局部溶胶或降低转膜效率），尽管很多半干转仪没有具体要求，但用预冷过的电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。

因此，有条件建议湿转、半干转均在低温（4℃）进行。

6.制作转膜三明治的过程中，书中强调过滤纸、胶、膜的大小最好合适，否则没有胶、膜隔开部分的滤纸会因为直接接触而产生局部短路，降低内阻增加电（压）流，造成升温过快。

通常膜的大小会严格控制在与胶面积略小一点点。

操作时在保证每一层均无气泡的前提下，叠好后再碾压几个来回，力道要均匀、恰好；力量过大，胶会被拉伸，条带会扭曲、变形。

碾压的目的不是为了驱赶气泡（完全可以做到叠加的时候每一层都无任何气泡；诸如采用多层薄滤纸时可以一张张的叠加），更重要的作用是让膜和胶贴得更紧密。

可以理解的是，对于蛋白分子的大小而言，胶和膜之间的间距是数十万倍计的，因此更紧密的接触无疑是转膜成败的关键。

四、封闭

将转印完的膜，放于封闭液中，37℃摇床，1-2h。

如果封闭结束后想第二天再做，可以将膜放于封闭液中4℃过夜。

第二天开始，再37℃摇床，封闭1-2h。

注意事项：

1.封闭时间和封闭液的量都要充裕，否则最终结果有可能造成“黑板”，虽然有人在网上宣称封闭时间长短对结果没有太大影响，但是通过实践的检验，这还是会造成一定的影响的。

2.封闭液配好后一定要混得非常均匀，milk颗粒未完全溶解时，微小的颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。

3.封闭液的配方可以和抗体稀释液相同，也可以不同；通常封闭液是最简单（单方）的抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。

4.封闭液的选择

目前的封闭液，主要有milk，BSA和gelatin，milk和gelatin封闭效果不错且价格便宜，但milk容易发霉变质，且国产milk脱脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗体结合；BSA封闭效果不佳，且价格较昂贵，从本人经验来看，milk作为一般的WB的实验即可。

五、一抗孵育——WB真正的难点：

抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。

对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。

无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。

抗体稀释液选用一般与封闭液一致。

在WB实验中，往往一张膜要检测多种抗原，检测方法如下（如果在胶中为隔孔上样）

（一）实验步骤

1.剪膜

可以沿隔孔处的梳子，将膜剪开

2.区分小膜

在每张小膜的不同位置，开不同的口，以便区分，例如

①，上开口1②，上开口2

③，下开口1④，下开口2

3.抗体孵育，1-2h

根据膜的大小来决定最后加封闭液的多少

六、洗膜

将膜放于平皿，或塑料盒子中，倒入TBST（洗膜液），放于摇床上，进行洗膜，共洗5次，每次8min操作如下:

注意事项：

1.洗膜的步骤往往被初学者所忽视，其实这是比较关键的一个步骤，如果洗膜不充分，会导致最后背景非常高。

应保证每次洗膜时洗膜液是充裕的，在摇床中的晃动程度，依据膜在洗膜液中的晃动程度而定，一般至少要保证将膜在液体中晃动起来，个人认为只要保证洗膜液不洒出来，尽量的晃动已达到较好的洗膜效果。

2.当你的抗体标不到抗原时（白板），先弄出条带（黑板），再解决黑板（高背景）问题。

第一步应该是通过倍比降低一抗的稀释比（从1:

1K降到1:

500到1:

250到….），二抗稀释比不要轻易改变，增加二抗浓度对WB结果不会有太明显的改变，摸索到一个可以标出信号的条件。

此时，由于一抗浓度过高，背景可能非常高，但背景的问题可以再调整，有没有特异性条带却没办法改变；实在没有靶蛋白的信号，只能更换抗体。

七、二抗孵育

二抗稀释的比例一般为1:

5000，孵育时间为30min，其他步骤一抗孵育相同，这里不做赘述。

八、再次洗膜

同上

九、显影

目前国内一些实验室已经换用仪器扫描荧光信号，这里我们主要讨论的是常规的ECL底片显影。

（一）实验步骤

1.将膜晾干，至整个膜为惨白状为宜

2.在暗匣上面滴一点水，剪一张自封袋或保鲜膜，平铺在上面。

3.将膜放于暗匣上，最好放在一个角落（本人习惯与放在暗匣的左下角），这样便于最后比较marker，而且在发光时可以节省发光用的底片。

4.发光

将ECL的A液和B液等体积混合（我们目前用的是碧云天的ECL的显影液，感觉效果还不错），滴加在膜上，AB液的量按照膜的多少来定，一般一张膜（约和胶的大小一致），1ml的AB混合液即可。

再把上面的一层自封袋盖在膜上。

5.压片

将发光胶片，压于膜上，时间长短依据在暗室中膜上光的强度而定，一般是，如果一进暗室就能看见的那种光，基本上压1s即可。

如光不强，那就要加长压片的时间，具体就要依当时情况和操作人员的经验而定了。

6.显影和定影

①将压完的胶片浸没在显影液里30s左右。

②在水中清洗几下。

③再将胶片浸没在定影液里30s左右。

④再在水中清洗几下。

⑤晾干即可。

（二）注意事项

1.导致荧光淬灭的因素

①抗原浓度太高，荧光信号过强，快速淬灭。

在电泳的章节就曾提过，如果上样量太大，不仅条带会粘连、弯曲，更可能导致淬灭。

因为局部区域过多的HRP酶会快速消耗底物呈富氧态，条带出现烧灼样（取出膜会发现一条明显的暗黄色的带），荧光信号会闪灭或者条带空心（条带灰黑不实，则可能是显影液接近失效）。

②抗原浓度太低，荧光信号太弱，相对慢一点的淬灭。

可能第一次压片能够获得很弱的条带，随后都不可见。

③ECL试剂质量。

除过氧化物因接触空气被逐渐还原外，ECL的成分通常都不稳定。

如呈递电子跃迁能的中间递质其化学性质就不太稳定，因为它转换能量的特性决定其必是一个有中间态的化合物，长期接触空气会被逐渐氧化失效；luminol也有保质期。

④操作时间过长，膜逐渐彻底干掉。

商品化的ECL会出现波形渐变，开始信号逐渐增强，背景一起升高；随后荧光完全衰减淬灭。

⑤不良的实验习惯。

脏的显影夹主要有两种污染，铁锈和不慎沾染的显影液、定影液，前者造成闪灭（催化作用），后者可能直接导致无荧光；

⑥AB液互相污染。

这样会导致AB液最终的失效。

2.在正式发光之前，可以在放了膜的自封袋的左右两个下角分别粘上双面胶，这样在把另一面的自封袋放在膜上时，可以将两面的自封袋粘牢，这样做可以避免在放光的时候不小心错动了膜的位置。

附录1WesternBlot的各种原理

一、电泳的原理

几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。

最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。

变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。

在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。

样品和浓缩胶中含Tris-HCl（pH6.8），上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3），分离胶中含Tris-HCl（pH8.8）的。

系统中所有组分都含有0.1%的SDS（Laemmli,1970），样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。

从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。

这种方法分离效果极好，可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模，因为随着胶厚度的增加，电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。

二、转印的原理

Westernbloting首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到膜上，通常有两种方法：

1.毛细管印迹法和电泳印迹法。

毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。

缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到膜上，膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。

但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。

2.电泳印迹可以更快速有效的进行转移。

这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。

常用的电泳转移方法有湿转和半干转。

两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。

湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。

这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。

半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。

与湿转相比，这种方法要快（15-45分钟）。

三、抗体孵育以及发光的原理

转移后的膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。

印迹首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。

处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。

处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗。

印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。

在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。

碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。

另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。

四、PVDF膜

虽然上面已经提到PVDF膜，但是还是在这里把进行一下更详尽的论述。

与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能。

市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！

）。

但是PVDF膜最大的优点不仅于此：

更好的机械强度和化学耐受性使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，特别是需要做N端蛋白测序，在相当“严酷”的清洗条件下，当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。

所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。

但不适合荧光。

PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理（不过要真出现这种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢）。

PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。

卷膜经济实惠，裁剪剩下的边角料还可以用来做点杂交。

再次强调的是，疏水PVDF膜在用前必须经过50%或以上体积比的甲醇或者乙醇溶液处理几分钟，待膜变成半透明后用纯水漂洗一下，转入电泳缓冲液平衡才能用。

附录2WesternBlot液配方

1×TBST膜清洗液配方

⑴1mol（M）Tris-Hcl

（PH8.0）配制量200mL

配制方法1.称量下列试剂，置于500mL烧杯。

Tris

24.2g

2.120ml的dH2O溶解，用Hcl调节pH值至8.0，dH2O定容至200ml。

3.常温保存。

⑵10×TBST膜清洗液

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于1L烧杯。

Nacl

88g

1MTris-Hcl（PH8.0）

200mL

Tween20

5mL

2.dH2O定容至1L。

3.注：

吐温较为粘稠，用枪吸取时要多停留一会儿。

4.4℃保存。

⑶1×TBST膜清洗液

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于1L烧杯。

10×TBST

100mL

2.dH2O定容至1L。

3.4℃保存。

2、WesternBlot封闭液

（5%脱脂奶粉）配制量100mL

配制方法1.称量下列试剂，置于500mL烧杯。

脱脂奶粉

5g

2.1×TBST定容至100mL。

3.4℃保存。

3、膜转移缓冲液

配制量1L

配制方法1.称量下列试剂，置于1L烧杯。

Glycine

2.9g

Tris

5.8g

SDS

0.37g

甲醇

200mL

2.dH2O定容至1L。

3.常温保存。

4、显影液：

配制量688.5mL

配制方法1.称量下列试剂，置于1L烧杯。

A液

170mL

B液

9.25mL

C液

9.25mL

2.加dH2O500mL。

3.4℃避光保存。

5、定影液：

配制量696.75mL

配制方法1.称量下列试剂，置于1L烧杯。

A液

175mL

B液

21.75mL

2.加dH2O500mL。

3.4℃避光保存。

附录3试剂厂家

脱脂奶粉伊利高蛋白脱脂高钙奶粉

显影液海吉雅牌2×3.5加仑浓缩显影液

大连海峡感光材料有限公司

定影液海吉雅牌2×3.5加仑浓缩定影液

大连海峡感光材料有限公司

ECL发光试剂盒碧云天