费氏中华根瘤菌内源质粒的不相容性及其在质粒消除中的应用.docx

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费氏中华根瘤菌内源质粒的不相容性及其在质粒消除中的应用

费氏中华根瘤菌内源质粒的不相容性及其在质粒消除中的应用

41卷4期Vol.41No.4微生物学报2001年8月ActaMicrobiologicaSinicaAugust2001

费氏中华根瘤菌内源质粒的不相容性

3及其在质粒消除中的应用

33缪礼鸿周俊初

（）农业部农业微生物重点实验室华中农业大学武汉430070

（）摘要:

用Tn52Mob2sacB转座子标记费氏中华根瘤菌SinorhizobiumfrediiHN01和WWG18的内源质粒;在含有10%蔗糖的TY培养基上进行了质粒消除试验以鉴定其功能。

将HN01的标记共生质粒pSymHN01b转入费氏中华根瘤菌WWG18SR和C361SR中,质粒快速检测、质粒消除和植物盆栽结瘤试验结果证明:

HN01的共生质粒与WWG18SR的共生质粒具有不相容性,但能与其非共生质粒相容。

相反,HN01的共生质粒可与C361SR的共生质粒相容,但与其中一个非共生质粒具有不相容性。

利用费氏中华根瘤菌不同菌株质粒间的不相容性,本研究成功地消除了WWG18SR的共生质粒和C361SR的一个非共生质粒。

关键词:

费氏中华根瘤菌,质粒,不相容性

（）文章编号:

00012620920010420432208中图分类号:

Q939.11文献标识码:

A

快生根瘤菌一般含有一到多个内源大质粒,其与豆科植物共生结瘤、固氮有关的基因1,2（）多定位于一个称为共生质粒pSym的大质粒上;其余为非共生质粒。

鉴定根瘤菌质粒

功能的方法主要是消除该质粒和将其转移到其他菌株中去以考察其性状的改变。

由于大

多数根瘤菌质粒十分稳定且难于消除,并且只有极少数质粒具有自我转移功能,所以迄今

有关根瘤菌非共生质粒的功能所知甚少。

已有的研究结果表明,根瘤菌的某些非共生质

3,7粒与菌株的结瘤竞争能力、固氮效率、胞外多糖产生以及对抗生素降解等有关。

某些根瘤菌的内源质粒,包括共生质粒和非共生质粒可以在不同种属的根瘤菌之间、

8,13根瘤菌与土壤杆菌之间以一定的频率进行自我转移或诱动转移与表达,一些研究者

14已经观察到不同根瘤菌质粒之间的不亲和性现象。

根瘤菌与土壤杆菌质粒之间的不

15相容特性已被用来消除土壤杆菌的某些用常规方法难已消除的内源质粒。

本文报道了3株费氏中华根瘤菌质粒间的不相容性及在质粒消除研究中的应用。

1材料和方法

1.1材料

（）1.1.1菌株及质粒见表1。

1.1.2培养基与培养条件:

大肠杆菌用LB培养基、于37?

下培养;根瘤菌和土壤杆菌用

TY培养基、于28?

下培养;根瘤菌菌落形态比较用YMA培养基;根瘤菌蔗糖敏感性验证

3本研究受欧盟INCO2DC合作研究计划ERBIC18CT970191课题经费资助33联系作者

（）作者简介:

缪礼鸿1965-,男,安徽巢湖人,讲师,在职博士生,从事固氮遗传研究。

收稿日期:

2000208207,修回日期:

2001202214

16与质粒消除用TY加10%蔗糖培养基;根瘤菌质粒快速检测用PA培养基。

（）μ（）1.1.3抗生素与浓度:

供试抗生素与使用浓度为:

卡那霉素Km50gΠmL;链霉素Smμ（）μ（）μ（）μ200gΠmL;四环素Tc20gΠmL;利福平Rif20gΠmL;壮观霉素Spe10gΠmL;萘啶酮酸（）μNal20gΠmL。

表1供试菌株和质粒

Table1Strainsandplasmidstested

StrainsRelevantcharacteristicsReferenceorsource

Sinorhizobiumfredii

HN01Wildtype,isolatedfromnoduleofAijiaozaoThislab.

WWG18Wildtype,isolatedfromnoduleofWilliamsThislab.

C361Wildtype,isolatedfromnoduleofHouzimao17]

HNT28Thiswork2Mob2sacBDerivativeofHN01,pHN01clabeledwithTn5

HNT29DerivativeofHN01,pSymHN01blabeledwithTn52Mob2sacBThiswork

WTG14DerivativeofWWG18,pWG18clabeledwithTn52Mob2sacBThiswork

WGT29ThisworkDerivativeofWWG18,pWG18dlabeledwithTn52Mob2sacB

HND28ThiswordHN01curedofpHN01c

HND29ThiswordHN01curedofpSymHN01brrHN01SRThisworkSpontaneousSmandRifmutantofHN01rrWWG18SRThisworkSpontaneousSmandRifmutantofWWG18rrC361SRThisworkSpontaneousSmandRifmutantofC361

WG18SRD2ThisworkWWG18SRcuredofpSymWG18b

C361SRD1ThisworkC361SRcuredofpC361c

C361SRD2（）ThisworkC361SRpSymHN01bdeletedofpSymHN01b

WWG18SRN1ThisworkDerivativeofWWG18SRhaboringdeletedpSymHN01b

WWG18SRN2DerivativeofWWG18SRhaboringpSymHN01bThiswork

C361SRNDerivativeofC361SRhaboringpSymHN01bThisworkAgrobaceriumtumefaciersrrGMI9023Thislab.Aplasmid2freestrainSm,Rif

E.coliS1721rrs（）pMH1701MM29416]HaboringpMH1701,Tc,Km,Nalr（）pRK2073ThisworkHaboringpRK2073,Spe

PlasmidrpMH170116]CarriedTn52Mob2sacB,Tc,Km+rpRK2073Thislab.HelperplasmidTra,Spe

1.2方法

1.2.1带有Tnt2Mob2sacB的根瘤菌转座突变株的筛选:

将分别培养至对数期的供体菌

（）（）S1721pMH1701、协助菌MM294pRK2073和受体菌HN01或C361SR的培养液各取

μ015mL混合后离心,收集菌体悬浮于80LTY液体中,滴加于TY平板上的灭菌微孔滤膜

0-1上,28?

培养1d后。

用2mL无菌水将滤膜上的菌体制成菌悬液,取10和10涂布TY含

Nal和Km平板,28?

培养3,4d,待平板上长出单菌落后,从每个受体根瘤菌株的接合转移平板上随机挑取60,80个单菌落,于TY含Nal和Km平板再划线分离纯化一次后编号保存备用。

由于根瘤菌对Km敏感,S1721和MM294对Nal敏感,因此,在TY含Nal和Km平板生长、但在含有10%蔗糖的培养基上不生长的菌株为带有Tn52Mob2sacB转座子的根瘤菌突变株。

微生物学报41卷434

1.2.2质粒上带有Tn52Mob2sacB标记菌株的筛选与标记质粒的消除:

在辅助菌MM294（）（）pRK2073的协助下,将上面获得的根瘤菌转座突变株供体分别与无质粒的根癌土壤

）（杆菌GMI902受体进行三亲本接合转移,在TY含Sm、Rif和Km平板上筛选土壤杆菌接合子。

质粒检测时与供体菌的质粒带型比较以确定供体根瘤菌的哪一条质粒带转入了土

16壤杆菌。

用TY培养液分别将上述转座突变株培养至对数期并涂布于TY加10%蔗糖

平板,28?

培养4,5d,每一菌株用灭菌牙签挑取10个单菌落分别点种于TY及TY含Km

平板,28?

培养后,选取失去Km抗性的菌落作质粒检测,确证是否有质粒被消除。

1.2.3根瘤菌抗药性自发突变株的筛选:

用TY液体培养根瘤菌至对数后期,取011mL菌液涂布于含有Sm的TY平板,28?

培养3,4d。

挑单菌落转接于TY加Sm液体培养基中摇床培养1d,取菌液再涂布在含有Sm和Rif的TY平板上培养。

挑取长出的单菌落于TY含Sm和Rif平板纯化后,获得带有Sm和Rif对抗标记的自发突变株,经结瘤试验确证其共生固氮性能与出发菌株相同后,供质粒接合转移用。

1.2.4根瘤菌之间质粒的诱动转移与转移接合子的质粒消除:

以质粒上带有Tn52Mob2sacB标记的根瘤菌转座突变株为供体,带有Sm和Rif双抗药性自发突变的根瘤菌为受体,在辅助质粒pRK2073协助下进行三亲接合转移。

在TY含Sm、Rif和Km选择平板上长出的单菌落经纯化一次后,经测定其对蔗糖的敏感性和质粒带型分析,以确定是否为真正的转移接合子。

转移接合子的质粒消除方法同1.2.2。

1.2.5根瘤菌质粒的快速检测:

见文献18。

1.2.6植物盆栽结瘤试验:

见文献19。

（）（）供试大豆品种矮脚早Aijiaozao和猴子毛Houzimao由中国农业科学院武汉油料作

（（）物研究所大豆研究室提供;黑农33Heinong33由新疆农业科学院提供;威廉姆斯Wil2

）liams由西班牙Sevilla大学提供。

2结果和讨论

2.1HN01和WWG18菌株内源质粒的标记、消除与共生固氮能力测定

菌株HN01含有分子量分别为490、275和201MDa的内源大质粒,其共生固氮基因定

20位于第二大质粒上pSymHN01b。

WWG18含有5条内源大质粒,其中第二大质粒的分子

（）量大小与pSymHN01b相近见图1。

将HN01的70个转座突变株分别与土壤杆菌GMI9023进行三亲本接合转移,获得了2个土壤杆菌转移接合子。

质粒带检测结果表明均含有HN01的