版双氯芬酸钠栓微生物限度检查检验方法验证方案.docx
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版双氯芬酸钠栓微生物限度检查检验方法验证方案
1.概述
1.1双氯芬酸钠栓是药典品种，批准文号：
国药准字H42020485，其处方由双氯芬酸钠组成，辅料为：
混合脂肪酸甘油酯。
具有消炎镇痛的作用，用于类风湿性关节炎，手术后疼痛及各种原因所致的发热。
有效期：
24个月。
1.2根据剂型与产品处方判断，双氯芬酸钠栓的微生物限度检查内容应包括需氧
菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查；根据双氯芬酸钠栓的成分和历史验证数据分析，该品种对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌有轻微的抑菌，对枯草芽胞杆菌有明显的抑菌活性，拟采用“薄膜过滤法”进行微生物限度检查，采用“常规法”进行控制菌检查。
2.目的
确认所采用的方法适用于该产品的微生物计数，以确保测定方法的可靠性，确保检验结果的准确可靠。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
3.依据
《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查：
微生物计数法”、“非
无菌产品微生物限度检查：
控制菌检查法”、“非无菌产品微生物限度标准”。
4.范围
本验证方案适用于公司六味地黄丸微生物限度检查检验方法的适用性试验。
5.职责
5.1验证领导小组
5.1.1负责验证方案的审批。
5.1.2负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。
5.1.3负责验证数据及结果的审核。
5.1.4负责验证报告的审批。
5.1.5负责发放验证证书。
5.2质量部
5.2.1负责验证所需的培养基、样品、菌液、缓冲液等的准备。
5.2.2负责取样及对样品的检验。
5.3项目验证小组
5.3.1负责拟订验证方案。
5.3.2负责验证方案的实施和收集各项验证试验记录，并对试验结果进行分析后，起草验证报告，报验证领导小组。
6.验证实施条件
6.1验证方案培训：
在验证实施前，应对参与验证的人员进行验证方案以及与验证相关的文件进行培训，确保相关人员掌握了验证的相关要求与知识。
相关的培训记录（见附件10）应附于报告中。
6.2微生物限度检测室：
检验所使用的检测室应经过HVAC系统确认，并符合要求。
6.3检验用水：
验证过程使用的纯化水其制备系统应经过确认并符合要求，纯化水质量应经过检验并符合《中国药典》2015年版二部的要求。
6.4检验仪器设备：
验证涉及的检验仪器（设备）与检验方法，应经过技术监督局校验合格或者公司确认/验证合格。
6.5培养基：
验证所使用的培养基应经过培养基的适用性检查，其结果符合《中国药典》的相关要求。
见附件2:
培养基确认。
6.6验证菌种：
验证所使用的菌种，其种类与传代次数应符合《中国药典》的相关要求。
菌种情况见附件3:
菌种确认。
7.合格标准
7.1在需氧菌、霉菌及酵母菌计数的三次独立平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
7.2在控制菌检查的试验中试验组应检出试验菌，阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组不得检出试验菌。
8.验证方法
8.1菌液制备：
8.1.1取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物各1ml,分别加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，10倍递增稀释至10-5-10-7。
取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
8.1.2取1ml上述制备的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液分别注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
8.1.3、取1ml上述制备白色念珠菌、黑曲霉菌液注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。
8.1.4结果：
见附件4:
菌液浓度确定。
8.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验
8.2.1、供试液制备：
称取供试品10g,加少量无菌聚山梨脂80充分混匀，用胰酪大豆胨液体培养基稀释至100ml，制成1:
10供试液。
8.2.2试验组：
吸取1:
10的供试液9.9ml，过滤，加0.1%无菌蛋白胨水溶液200ml分两次冲洗，每次100ml；再将加有0.1ml的试验菌悬液的0.1%无菌蛋白胨水溶液的冲洗液100ml冲洗，冲洗后，将滤膜正贴于胰酪大豆胨固体培养基平板上培养，每株试验菌平行制备2个平皿（其中，白色念珠菌制备4张滤膜，其中2张正贴于胰酪大豆胨固体培养基平板上，2张正贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上），按平皿法测定其菌数。
8.2.3菌液对照品：
吸取稀释液胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，过滤，其他同试验组。
8.2.4供试品对照组：
吸取1:
10的供试液9.9ml，过滤，加0.1%无菌蛋白胨水溶液300ml分三次冲洗，每次100ml；冲洗后，将滤膜正贴于胰酪大豆胨固体培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基上，每种培养基平行制备2个平皿。
按平皿法测定其菌数。
8.2.5阴性对照组：
取胰酪大豆胨液体培养基10ml，过滤，加0.1%无菌蛋白胨水溶液300ml分三次冲洗，每次100ml；冲洗后，将滤膜正贴于胰酪大豆胨固体培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基上，每种培养基平行制备2个平皿。
按平皿法测定其菌数。
8.2.6将以上平皿分别置30～35℃或20～25℃培养，需氧菌培养不超过3天，真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。
8.2.7、计算公式：
8.2.8、试验结果：
8.2.8.1见附件5:
需氧菌总数计数方法适用性检查结果
8.2.8.2附件6:
霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果
8.3控制菌检查
8.3.1金黄色葡萄球菌
8.3.1.1供试液制备：
同“需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验：
供试液制备。
8.3.1.2试验组：
8.3.1.2.1取1：
10供试液10ml和≤100cfu金黄色葡萄球菌菌液加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，30-35℃培养18-24h。
8.3.1.2.2取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30-35℃培养18h。
8.3.1.3阳性对照：
取≤100cfu金黄色葡萄球菌菌液加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，其他同试验组。
8.3.1.4阴性对照：
取100ml胰酪大豆胨液体培养基，30-35℃培养18-24h。
其他同试验组。
8.3.1.5结果：
见附件6:
金黄色葡萄球菌方法适用性检查结果
8.3.2铜绿假单胞菌
8.3.2.1供试液制备：
同“需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验：
供试液制备。
8.3.2.2试验组：
8.3.2.2.1取1：
10供试液10ml和≤100cfu铜绿假单胞菌菌液加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中。
30-35℃培养18-24h。
8.3.2.2.2取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30-35℃培养18-72h。
8.3.2.3阳性对照：
取≤100cfu铜绿假单胞菌菌液加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，其他同试验组。
8.3.2.4阴性对照：
取100ml胰酪大豆胨液体培养基，30-35℃培养18-24h。
其他同试验组。
8.3.2.5结果：
见附件7:
铜绿假单胞菌方法适用性检查结果
9.异常情况与偏差处理：
当出现偏差时，应按《偏差处理管理规程》进行处理。
10.验证结果评定、结论与建议
验证小组组长负责收集各项验证、试验记录，根据验证、试验结果对验证效果进行综合评审，起草验证报告、做出验证结论。
对验证结果的评审应包括一下内容：
10.1验证试验是否有遗漏？
10.2验证实施过程中对验证方案有无修改？
修改原因、依据以及是否经过批准？
10.3验证记录是否完整？
10.4验证试验结果是否符合标准要求？
偏差及对偏差的说明是否合理？
是否需要进一步补充试验？
11.附件
11.1附件1:
验证实施条件确认
11.2附件2:
培养基确认
11.3附件3:
菌种确认
11.4附件4:
菌液浓度确定
11.5附件5:
需氧菌总数计数方法适用性检查结果
11.6附件6:
霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果
11.7附件7:
金黄色葡萄球菌方法适用性检查结果
11.8附件8:
铜绿假单胞菌方法适用性检查结果
11.9附件9:
验证结果审批表
11.10附件10:
人员培训记录
附件1：
设施设备验证确认
设施设备名称
验证报告编号
验证结果
实验室HVAC系统
纯化水系统
LDZX-40A型立式自控电热压力蒸汽灭菌器
PSH-500A型生化培养箱
303AS-2型电热恒温隔水式培养箱
SW-CJ-1C型双人净化工作台
确认结论：
确认人：
确认日期：
附件2：
培养基确认
培养基名称
来源
批号
适用性检查结果
胰酪大豆胨琼脂培养基
胰酪大豆胨液体培养基
沙氏葡萄糖琼脂培养基
胰酪大豆胨琼脂对照培养基
/
胰酪大豆胨液体对照培养基
/
沙氏葡萄糖琼脂对照培养基
/
甘露醇氯化钠琼脂培养基
甘露醇氯化钠琼脂对照培养基
/
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
溴化十六烷基三甲铵琼脂对照培养基
/
确认结论：
确认人：
确认日期：
附件3：
菌种确认
培养基名称
来源
批号
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]
枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]
白色念珠菌[CMCC（F）98001]
大肠埃希菌[CMCC（B）44102]
黑曲霉[CMCC（B）98003]
确认结论：
确认人：
确认日期：
附件4：
菌液浓度确定
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
Ι
П
Ш
Ι
П
Ш
Ι
П
Ш
Ι
П
Ш
Ι
П
Ш
铜绿假单胞菌
皿1
皿2
金黄色葡萄球菌
皿1
皿2
大肠埃希菌
皿1
皿2
枯草芽孢杆菌
皿1
皿2
白色念珠菌
皿1
皿2
白色念珠菌（沙氏）
皿1
皿2
黑曲霉
皿1
皿2
黑曲霉（沙氏）
皿1
皿2
结论：
根据要求，菌数要控制在每1ml中含菌数在≤100cfu，因此，我们确定菌液制备：
铜绿假单胞菌：
稀释金黄色葡萄球菌:
稀释大肠埃希菌：
稀释
枯草芽孢杆菌:
稀释白色念珠菌（胰酪）:
稀释白色念珠菌（沙氏）:
稀释
黑曲霉（胰酪）：
稀释黑曲霉（沙氏）：
稀释
检验人
检验时间
年月日-年月日
复核人
复核时间
年月日
附件5:
需氧菌总数计数方法适用性检查结果
样品批号：
菌种
菌液对照组
试验组
稀释度：
1:
10
比值
（0.5-2）
3天
5天
3天
5天
3天
5天
金黄色葡萄球菌
/
/
/
铜绿假单胞菌
/
/
/
枯草芽孢杆菌
/
/
/
白色念珠菌
黑曲霉
供试品对照组：
胰酪大豆胨琼脂培养基：
（）CFU/平皿1，（）CFU/平皿2
阴性对照组：
胰酪大豆胨琼脂培养基：
（）CFU/平皿1，（）CFU/平皿2
检验人
检验时间
年月日-年月日
复核人
复核时间
年月日
附件6:
霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果
样品批号：
菌种
菌液对照组
试验组
比值
（0.5-2）
3天
5天
3天
5天
3天
5天
白色念珠菌
黑曲霉
供试品对照组：
沙氏葡萄糖琼脂培养基：
（）CFU/平皿1，（）CFU/平皿2
阴性对照组：
沙氏葡萄糖琼脂培养基：
（）CFU/平皿1，（）CFU/平皿2
检验人
检验时间
年月日-年月日
复核人
复核时间
年月日
附件7:
金黄色葡萄球菌方法适用性检查结果
样品批号：
次数
甘露醇氯化钠琼脂培养基
检验结果
试验组
1
2
3
阳性对照组
1
2
3
阴性对照组
1
2
3
附件8:
铜绿假单胞菌方法适用性检查结果
样品批号：
次数
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
检验结果
试验组
1
2
3
阳性对照组
1
2
3
阴性对照组
1
2
3
附件9:
验证结果审批表
验证对象
验证开始日期
验证结束日期
评审意见（在方框中打√）
1、验证实验有否遗漏□遗漏□未遗漏
2、验证实施过程中对验证方案有无修改□有修改□无修改
3、方案修改的原因□经过批准□未经批准
4、验证记录是否完整□完整□不完整
5、是否出现偏差□出现偏差□未出现偏差
6、对偏差的说明是否合理□合理□不合理
7、是否需要作进一步的试验□是□否
验证项目小组组长
年月日
验证领导小组组长
年月日
附件9：
人员培训记录
培训主题
双氯芬酸钠栓微生物限度检查方法适用性试验验证方案
主讲人/主持人
培训部门
质量管理部
培训日期
培训方式
理论培训
培训地点
质检中心办公室
培训内容：
非无菌产品微生物限度检查用培养基适用性检查验证文件
序号
部门/工序
姓名
职务
个人培训情况
备注
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
升级会员 