124微生物限度检查法标准操作规程.docx
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124微生物限度检查法标准操作规程
****制药厂
操作标准----质量管理
文件名称
微生物限度检查法
标准操作规程
编码
SOP-QC-124-00
页数
34-1
实施日期
制订人
审核人
批准人
制订日期
审核日期
批准日期
制订部门
质管部
分发部门
检验室
目 的：
制订微生物限度检查法的标准操作规程。
适用范围：
微生物限度检查。
责 任：
微生物限度检查操作人员按本规程操作，检验室主任监督本规程的实施。
程 序：
1.简述
细菌、霉菌、酵母菌计数是检测规定企业单位内的非灭菌制剂污染的活菌数量，是判定药品受到微生物污染程度的重要指标，也是对生产企业的药品、原料、辅料、设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。
细菌、霉菌、酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。
该方法以在琼脂平板上，每个细菌（营养琼脂）、霉菌（玫瑰红钠琼脂）、酵母菌（玫瑰红钠琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂）形成一个独立可见的菌落为计数依据。
测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（一群在营养琼脂上发育的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。
不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。
一个细菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一个或多个菌细胞形成。
因此供试品中所测的菌落数实际为菌落形成单位数（colonyformingunitg，CFU），而不应理解为细菌、霉菌、酵母菌的个数。
在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。
2.设备、仪器及用具
2.1设备
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操作标准----质量管理
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微生物限度检查法
标准操作规程
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SOP-QC-107-00
页数
34-2
2.1.1无菌室
2.1.1.1结构和要求 无菌室应采光良好、避免潮湿、无离厕所及污染区（面积不超过10m2，高度不超过2.4m）由缓冲间（2个）、操作间组成。
操作间与缓冲间之间应有样品传递箱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。
无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。
墙与地面及墙壁、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。
操作间内不应安装下水道。
无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。
缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯（2～2.5W/m3），紫外杀菌灯距实验台面高度不超过1m，并应定期检查辐射强度，不得低于70μW.cm-2（1m距离）。
不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。
2.1.1.2温度、湿度 无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯杀菌效果，故温度应控制在18～26℃，相对湿度40～60%。
操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压、不低于4.9Pa。
2.1.1.3操作间，操作间应安装空气除菌过滤层流装置。
洁净度不应低于10000级，局部净化度为100级，或放置同等级净化工作台，并准备药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉，大、小橡皮乳头等。
2.1.1.4缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。
缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。
2.1.1.5洁净级别及检查方法通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。
洁净级别
尘粒数/m3
活微生数（个）/m3
≥0.5
≥5
100级
≤3，500
≤0
≤5
10000级
≤350，000
≤2000
≤100
100000级
（GB/T16294－1996）
≤3，500，000
≤20，000
≤500
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34-3
洁净级别
个/（∮90mm.0.5h）
100级
≤1
1000级
≤3
100000级
≤10
2.1.1.5.1浮游菌数测试方法（参照中华人民共和国国家标准GB/T16293-1996）
2.1.1.5.2沉降菌数测定（Ⅱ法）
无菌室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～35C预培养48h，证明无菌落生长）。
以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。
在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取出检查。
3个平板生长的平均菌落数不超过1个。
无菌操作台或净化工作台要定期检测其洁净度，应达到100级。
净化工作台中的高效及中效过滤器应根据检测情况，必要时予以更换处理。
2.1.1.6消毒处理无菌室应在每次操作前、后均用0.1％苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。
开动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。
2.1.2其他设备净化工怍台、恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（25～28℃），微波炉（或其他适宜加热装置）、康氏振荡器、匀浆仪（3000～8000r/min）、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。
2.2仪器及器皿
2.2.1菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平或药物天平（感量0．1g），pH系列比色计。
2.2.2玻璃器皿锥形肌（250～300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（陶瓷制，直径10～12cm）、培养皿（9cm）、量筒（100ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1m1分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20或30ml）、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃
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消毒缸（带盖）。
玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。
吸管口上端距0.5cm处塞人约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。
锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。
玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽12l℃灭菌30min，烘干备用。
2.3用具
2.3.1大、小橡皮乳头（放于净带盖的容器中，并应定期用70%～75%乙醇溶液浸泡）。
2.3.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。
也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。
2.3.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径4～5mm、长度6～10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。
3.试液
3.1消毒液
3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。
3.1.2 5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可选用其他适宜消毒液。
3.1.3 75%乙醇溶液
3.1.4 碘酊或碘伏溶液
3.2 稀释剂和试剂
3.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液 （附录3.1）
3.2.2 无菌聚山梨酯—80
3.2.3 无菌聚山梨酯—80氯化钠溶液（附录3.2）
3.2.4 无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）（附录3.3）
3.2.5 无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）（附录2.15）
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4.培养基
4.1营养琼脂培养基（附录5.2）
4.1玫瑰红钠琼脂培养基（附录5.3）
4.3酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基（附录5.4）
培养基制备应注意：
4.3.1采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基PH值进行校验。
若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。
试剂规格应为化学纯以上。
4.3.2配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。
4.3.3培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。
包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。
4.3.4培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。
4.3.5灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，以免水分散失及染菌。
已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。
4.3.6勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏。
应用水浴或微波炉加热。
5.供试品抽样、保存及检验量
5.1抽样
5.1.1一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量（以备复试）。
5.1.2抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。
5.1.3凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。
5.2保存
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5.2.1供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。
5.2.2供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。
包装已开启的样品不得作为供试品。
5.3检验量
5.3.1所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药蜜丸、膜剂，需取自4丸、4片以上）。
5.3.2固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。
5.3.3液体制剂检验量为10ml。
5.3.4膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为30～50cm2，化学药及生化药膜剂检验量为10cm2。
5.3.5特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。
除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。
6.操作方法
6.1试验前准备
6.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1m1、10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内。
每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。
6.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。
6.1.3操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。
再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
6.1.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。
6.2供试液的制备
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6.2.1液体供试品取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，摇匀，作为1：
10供试液。
含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。
6.2.2固体、半固体或粘稠供试品称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入100ml0.9%无菌氯化钠溶液，用匀浆仪（3000～5000r/，2～4min），振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。
胃溶胶囊加稀释剂后置45℃土1℃水浴中振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后先打碎再置45℃土1℃水浴振摇溶解。
6.2.3非水溶性供试品 软膏剂、乳膏剂称供试品5g（5ml），加入含已灭菌溶化并保温45℃左右的司盘—805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯—8010g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌均匀后，慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶液85ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1：
20）。
油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯—805～8ml，摇匀，再加入稀释剂至100ml。
栓剂称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45℃水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯—805～8ml，振摇使之乳化，再加稀释剂（稀释剂和聚山梨酯—80总量为100ml），摇匀。
6.2.4气雾剂将供试品置冰箱（4—8℃）1h，取出，刚碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品开启部位周围，然后以无菌钢锥仔细钻孔并插入容器中，勿移出钢锥，以转动方式使容器内抛射剂全部抛出。
以无菌注射器吸出全部药液，按标示量补加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯—80液）此液即为供试品原液。
6.2.5膜剂中药膜剂一般取30～50cm2，将药膜剪成碎片，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，于45℃土1℃水浴中保温，振摇使溶。
西药药膜一般取样为10cm2，制备供试液方法同上。
6.2.6茶剂取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇30s，以灭菌
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纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：
10加稀释剂，浸泡30min）。
以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂，制成1：
20～1：
100供试液。
6.3供试液的释稀（10倍递增稀释法）
6.3.1取2～3支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂（此时操作一般为：
左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10ml吸管吸量，注意：
勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）。
加完稀释剂后，试管塞应立即塞上。
6.3.2另取1支1m1灭菌吸管吸1：
10均匀供试液lml，加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中混匀，即为1：
100供试液。
以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至l：
102、1：
103、1：
104等适宜稀释级（至少共3级）。
每递增1稀释级，必须另换一支吸管。
在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。
吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第2级稀释管的内壁靠近液面（勿接触液面）缓慢地吹出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。
6.4注平皿在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取各级稀释液各lml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管），每一稀释级注2～3个平皿（此时，一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注平皿时，将lml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。
同时作阴性对照（待各级稀释液注皿完毕后，用1支lml吸管吸取稀释剂各1m1，分别注入4个平皿中。
其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另用YPD琼脂测定酵母菌数时，则再增加2个平皿作酵母菌数阴性对照）。
6.5倾注培养基将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂，含蜂蜜、王浆液体制剂另加用YPD琼脂）熔化，冷至约45℃时，倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿混匀，注意，
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混匀时切勿将培养基溅到皿边及皿盖上，置操作台上待凝。
6.6培养细菌计数平板倒置于30～35℃培养箱中培养48h。
霉菌、酵母菌计数平板于25～28℃培养箱中培养72h。
6.7菌落计数
6.7.1一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。
勿漏计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。
注意细菌落与霉菌菌落和酵母菌菌落以及它们与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡等的鉴别。
必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。
6.7.2供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。
排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。
6.7.3供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多且难与菌落肉眼相鉴别的有形物。
为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液多增加注皿（1～2个平皿），注皿后不经培养而放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。
或刚0.001%TTC营养琼脂注皿，经培养后可将细菌菌落与其他有形物区别开来。
有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001%TTC营养琼脂注皿，经培养后生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计。
6.7.4若干板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界线，一条链作为—个菌落计，但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。
6.7.5记录各稀释级平板的菌落数，求出各稀释级2或3个平板菌落的平均数。
当菌落数在15以上的同稀释级二平板菌落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数
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34-10
依据；当2个平板菌落数均在15（含15）以下时，两个平板菌落数的差值允许范围为0～4，1～7，2～9，3～10，4～12，5～14，6～15。
超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。
6.7.6在下列情况下、点计菌落时间需提前或延长培养时间：
6.7.6.1菌落生长呈蔓延趋势者，细菌点计需在24h，霉菌点计需在48h作初步点计（点计霉菌菌落时，动作宜轻，勿反复翻转平板或造成震动，使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，导致计数误差）。
6.7.6.2在48h点计细菌，72h点计霉菌时，菌落极小不易辨认，需延长培养时间4～7天，再点计菌落数。
6.7.6.3对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。
6.7.7供试品按营养琼脂平板点计细菌菌落数；固体供试品按玫瑰红钠琼脂干板点计霉菌数，一般液体供试品按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌及酵母菌总数；含蜂蜜及王浆的合剂按玫瑰红钠琼脂平板点计霉菌菌落数，按YPD琼脂平板点计酵母菌菌落数，二者合并为霉菌及酵母菌数。
6.8菌数报告规则
6.8.1细菌数选取平均菌落数在30～300之间的稀释级，霉菌、酵母菌数选取平均菌落数在30～100之间的稀释级作为报告菌数的依据。
如只有1个稀释级平均菌落数在30～300（30～100）之间，则将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告（见附表例6.8.1）
6.8.2如有2个相邻稀释级平均菌落数在30～300（30～100）时，则按比值计算。
当比值≤2时，则以2个稀释级的平均菌落数均值报告。
当比值>2时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表附6.8.2）。
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6.8.3如有3个稀释级平均菌落数均在30～300（30～100）之间时，则以后2个稀释级计算级间比值报告（同6.8.2），（见附表例6.8.3）。
6.8.4如各稀释级平均菌落数均在300（100）以上，则按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表6.8.4）。
6.8.5如各稀释级平均菌落数均不在30～300（30～100）之间，则以最接近30或300（100）的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告（见附表6.8.5）。
6.8.6如各稀释级的平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数小于1时，应报告菌数为<10个/g或m1（见附表例6.8.6）。
如供试品原液平板均未生长霉菌及酵母菌，报告未检出霉菌及酵母菌/ml。
6.5.7当各稀释级平均菌落数均小于30时，如高稀释级平均菌落数大于或等于低稀释级平均菌落数时，应以培养基稀释法重新测定，按测定结果报告菌数（见附表例6.8.7）。
附表：
细菌数报告规则举例
规则
原液
各稀释级菌落数
比值
菌落数
报告数
1：
10 1：
102 1：
103
6.8.1
1365
164
20
－
16400
16000
6.8.2
2760
295
46
1.6
37750
38000
6.8.2
2890
271
60
2.2
27100
27000
6.8.3
239
202
35
1.7
27600
28000
6.8.3
236
196
42
2.1
19600
2000
6.8.4
不可计
4650
513
－
513000
510000
6.8.4
24
19
12
－
240
240
6.8.5
不可计
305
12
－
30500
30000
6.8.6
0.5
0
0
－
5
<10
6.8.7
22
27
0
*
*培养基稀释法测定
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标准操作规程
编码
SOP-QC-107-00
页数
34-12
培养基稀秆法：
取低稀释级供试液（原液或1：
10供试液）3份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或<0．2ml），每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，
混匀，凝固后，倒置培养，计数。
5个或5个以上平板点计的菌落之和，即为每1ml菌落数，共得3组数据。
以3份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告。
6.9结果报告
6.9.1菌落数在100以内时，按实有数据报告。
6.9.2菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。
6.10复试供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中任一项—次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。
7.注意事项
7.1供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。
使用灭菌用具时，不能接触可能污染的任何器物，灭菌吸管不得用口吹吸。
7.2从供试品稀释至倾注琼脂培养基操作应在1h内完成，避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。
7.3供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液，以免造成实验误差。
7.4为避免细菌菌落蔓延生长，宜采取下列方法处理：
7.4.1开盖干燥，将
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