添加剂的通用名称功能分类用量和使用范围.docx

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添加剂的通用名称功能分类用量和使用范围

2.添加剂的通用名称、功能分类、用量和使用范围

2.1通用名称

磷酸二酯酶Ι（来源于传统的薄粘束梗菌Leptographiumprocerum）能够催化核糖核酸（RNA）或寡核苷酸分子上的3’碳原子羟基与磷酸之间形成的二酯键之间的水解反应。

-系统名：

寡核苷酸5'-脱氧核糖核酸酶

-常用名：

磷酸二酯酶Ι

-其他名称：

核酸酶、5'-核酸外切酶、5'-核苷酸磷酸二酯酶、碱性磷酸二酯酶Ι、核酸外切酶I

-商品名称：

FDase

-IUPAC/IUBMB编号：

3.1.4.1

-CAS编号：

9025-82-5

磷酸二酯酶Ι属于磷酸二酯水解酶家族，是一种作用于酯键的水解酶。

2.2功能分类

在GB2760中，磷酸二酯酶Ι属于食品加工助剂。

2.3用量和使用范围

可在各类食品中按生产需要适量使用。

3.证明技术上确有必要和使用效果的资料或者文件

磷酸二酯酶Ι裂解来自核糖核酸（RNA）的寡核苷酸生成5’-核苷酸，包括5’-腺苷酸（5’-AMP），5’-鸟苷酸（5’-GMP），5’-尿苷酸（5’-UMP）和5’-胞苷酸（5’-CMP）。

5’-核苷酸如5’-GMP和5’-IMP可提升和改善食物的味觉。

因此，该磷酸二酯酶Ι在食品中的技术必要性可被描述为：

可以从天然存在的酵母核糖核酸（RNA）中释放反应产物5’-GMP，该反应产物不仅可以增加食品的鲜味，还可以掩盖食品的苦味等，使食品获得更加温和丰满的口感，因此可以用来生产有丰富鲜味的食品配料，例如酵母加工产品、调味品等。

此申报资料中描述的磷酸二酯酶Ι专门应用于生产有提升香味品质作用的酵母提取物或酵母自溶产物，可总体上提升食品可口的味道和口感。

使用磷酸二酯酶Ι生产的酵母提取物或自溶产物广泛用于生产风味食品，例如肉汤块或粉、汤或酱料、肉汁、点心、半成品餐、加工奶酪、调料和抹酱、香味和佐料。

改善核苷酸水平的酵母提取物对味道和口感的影响详细描述参见文献（Noordam,B.andMeijer,F.R.,2007【1】）。

该磷酸二酯酶Ι可在酵母提取物或自溶酵母的生产过程中用于酵母自溶。

酶的平均剂量取决于处理条件和酵母产品所需性质。

通常使用水平是每公斤干酵母使用1单位的磷酸二酯酶Ι，或在像在本资料中描述的一样每kg干酵母使用1.6–41g的磷酸二酯酶Ι制剂。

在酵母寡核苷酸转化后，酵母提取物或自溶产物采用超高温（UHT）加热。

磷酸二酯酶Ι在65°C开始失活，在更高温度的条件下及超高温（UHT）条件下使酶完全灭活。

4.食品添加剂的质量规格要求、生产使用工艺和检验方法，食品中该添加剂的检验方法或者相关情况说明

4.1质量规格要求及检验方法

符合《GB25594-2010食品安全国家标准食品工业用酶制剂》，具体标准文本见下页：

4.2生产使用工艺

酵母抽提物生产工艺

4.3食品中该添加剂的检验方法或者相关情况说明

DSM研发了一种简单、精确和可重复的方法来测定以3’GMP作为底物的磷酸二酯酶Ι制剂中的酶活性，该方法同样用于标准化酶制备过程。

分析方法

编号：

2484

版本：

3

部门：

DFS/R&D/分析

以2’（3’）-磷酸鸟嘌呤核苷（2’（3’）-GMP）为底物用分光光度法测定磷酸二酯酶Ι的活性（相对法）

发布日期：

产品：

磷酸二酯酶Ι发酵液/磷酸二酯酶Ι浓缩液/成品

编辑：

A.Vriend

日期：

验证方法

是

检查专家：

J.Godefrooij

日期：

批准的分析专家：

M.M.Immerzeel

日期：

批准QA/QC：

M.Steenbeek

日期：

1.安全性与环境

在有关化学品的管理、贮存和使用、危险物质的处理及ML-1实验室标准规则的工作指导中提到了与化学品和ML-1样品同时应用的有关限制。

这些限制也适用于与ML-1样品接触的材料。

当操作使用强酸、碱、致癌物质和毒性物质等时，必须采取一切必要的预防措施。

当操作使用高浓缩的酶制剂时，必须采取一切必要的预防措施。

避免吸入尘粒和/或与无防护的皮肤长时间接触。

异丙醇是一种挥发性有机溶剂。

必须在通风橱中进行操作处理。

2.原理

2.1应用

本方法适用于测定发酵样品（发酵液、上清液、滤液）、下游加工样品（匀浆、滤液馏分、颗粒）和终产品（浓缩物）中磷酸二酯酶Ι的活性。

2.2方法介绍

本方法使用2’（3’）-磷酸鸟嘌呤核苷（2’（3’）-GMP）为底物，该底物可被磷酸二酯酶Ι水解为鸟嘌呤核苷和定量磷酸。

然后加入钼酸/钒酸试剂和酶水解释放的定量的磷酸反应生成黄色的钒酸钼酸-磷化合物，在405nm波长下测定该化合物的吸光度可以计算出磷酸二酯酶Ι的活性，该检测通过Konelab全自动生化分析仪完成。

2.3单位定义

活性以5’FDU表示（磷酸二酯酶Ι单位）。

一个5’FDU定义为每分钟从3’GMP释放1微摩尔磷酸所需要的活性（pH5.6，65°C）。

2.4测定范围

本方法的测定范围为0.20–1.605’FDU/mL。

2.5概要验证报告

不适用。

3.仪器与条件

3.1仪器

-天平，精密到0.0001g：

MettlerAE100

-天平，精密到0.001g：

MettlerPM400

-天平，精密到0.01g：

Sartoriusmodel2004MP

-稀释器，规格为0.5和5.0mL的圆筒状容器：

HamiltonMicrolabs

-pH计：

测定仪PHM83

-涡旋器：

Genie-2,ScientificIndustries

-折叠式过滤器：

5951/2，S&S

-磁力搅拌器：

Variomag，multipointHP15

-全自动生化分析仪：

KonelabArena30analyzer，Thermo

-移液管：

一次性5、10mL移液管

-一次性培养管（玻璃16×150mm）：

Corning

或等效仪器

3.2条件

不适用

4.材料

4.1化学试剂

-100%醋酸，p.a.：

Merck，1.00063

-醋酸钠3H2O，p.a.：

Merck，1.06267

-硫酸锌7H2O，p.a：

Merck，1.08883

-2’（3’）-磷酸鸟嘌呤核苷：

Sigma，G8002

-气溶胶22：

Sigma，A9753

-氢氧化钠颗粒：

Merck，1.06462

-七价钼酸铝4H2O，p.a.：

RiedeldeHaen，31402

-钒酸铝p.a.：

Merck，1.01226

-25%氨水：

Merck，1.05432

-65%硝酸：

Merck，1.00456

4.2参比物质、标准品与对照品

4.2.1标准品及对照品

使用一种官方指定活性（以5’FDU/g表示）的标准品和对照品，请冰箱保存。

4.3试剂

-水：

超高质量水，电导率≤0.10μS.cm

-缓冲液0.1mol/L，pH5.60的硫酸锌-醋酸缓冲液

在含有约800mL水、0.6g100%醋酸和12.25g醋酸钠.3H2O和0.288g的硫酸锌.7H2O的1000mL容量瓶中连续溶解，加水定容，混匀。

pH须在5.55～5.65。

-底物溶液：

称取0.1816g的2’（3’）-磷酸鸟嘌呤核苷，加至50ml含有约40ml上述缓冲液的容量瓶中，如有必要，用0.1M的醋酸或醋酸钠调整pH至5.60±0.05，加缓冲液定容，并混匀。

将底物溶液转移到20ml容量的Konelab分析仪专用器皿中。

-100g/l的气溶胶22：

溶解10.0g的气溶胶，加至100ml含有约60ml水的容量瓶中，定容，混匀，室温下可保存14天。

-硫酸锌醋酸缓冲液/气溶胶溶液：

在1000ml的硫酸锌醋酸缓冲液中加入2.0ml气溶胶22溶液，混匀，pH须为5.60.

-23%的硝酸溶液

缓慢将70ml65%的硝酸溶液加入到130ml水中，混匀。

-钒酸铝贮存液

将2.35g钒酸铝转移入装有400ml60°C的水的烧杯中，在冷却至室温的过程中持续搅拌2小时，完全溶解避免沉淀，搅拌时缓慢加入20ml的23%的硝酸溶液。

将上述溶液转移至1000ml的容量瓶中，定容。

该溶液室温避光，可保存4周。

-七价钼酸铝贮存液

将100g七价钼酸铝4H2O转移入装有800ml水的1000ml的容量瓶中，加入10ml25%的氨水溶液，定容。

-酶反应终止液

将25.0ml钒酸铝贮存液、25.0ml的七价钼酸铝贮存液和16.0ml的65%的硝酸溶液转移入100ml的容量瓶，冷却至室温定容。

将上述转移到20ml容量的Konelab分析仪专用器皿中。

5.步骤

5.1配制

不适用。

5.2预处理参比物

不适用。

5.3预处理标准品

准确称取0.1mg左右的5000单位的标准酶转移入50ml的容量瓶，加入40ml左右的硫酸锌醋酸缓冲溶液，定容。

在磁力搅拌器上搅拌20mins溶解，按照下表稀释标准品溶液，并将系列标准品溶液放置冰浴中。

表1磷酸二酯酶Ι标准品的稀释范围

标准品

活性（5FDU/ml）

标准品体积（ml）

加入的缓冲液体积

（ml）

稀释的标准溶液（ml）

加入的缓冲液体积

（ml）

总稀释因子

S1

0.20

0.500

4.500

0.100

4.900

25000

S2

0.40

0.500

4.500

0.200

4.800

12500

S3

0.60

0.500

4.500

0.300

4.700

8333

S4

1.00

0.500

4.500

0.500

4.500

5000

S5

1.43

0.500

4.500

0.500

4.500

3500

S6

1.67

0.500

4.500

0.500

4.500

3000

5.4预处理对照品

使对照样品达到室温。

精确称取两份5000单位左右的对照样品，加入至50ml容量瓶中，并用硫酸锌醋酸缓冲液定容。

在室温下搅拌20min，将0.300ml的上述溶液用4.700ml的硫酸锌醋酸缓冲液稀释，将0.500ml的上述溶液用4.500ml的硫酸锌醋酸缓冲液稀释。

上述稀释溶液冰浴放置。

5.5预处理样品

5.5.1液体样品

按照上面表格用缓冲液将液体样品稀释在酶活在0.20～1.60单位之间，冰浴放置。

5.5.2称重样品

精确称取1g左右的样品，用缓冲液将样品稀释在酶活在0.20～1.60单位之间，冰浴放置。

5.5.3发酵样品

精确称取2g左右的样品，溶解在80ml左右的缓冲液，并定容至100ml。

S&S滤纸过滤，缓冲液稀释至最终酶活在0.6个单位，冰浴放置。

5.5.4液体浓缩液

精确称取两份约1g的样品，加入至100ml容量瓶中，并用硫酸锌醋酸缓冲液定容。

在室温下搅拌20min，将0.100ml的上述溶液用4.900ml的硫酸锌醋酸缓冲液稀释。

上述稀释溶液冰浴放置。

5.6制剂的测定

取1mL左右的最终样品，放置入Konelab全自动分析仪样品盘中。

5.7测定

使用KonelabArena30全自动分析仪

具体测定程序及操作、清洗、归位步骤略。

6.计算

Konelab全自动分析仪会自动计算，计算原理为做一条吸光度差和每ml标准品酶活之间的标准曲线，未知的酶活浓度通过吸光度差在曲线上计算。