酵母扩大培养过程关键控制点.doc

酵母扩大培养过程关键控制点.doc

《酵母扩大培养过程关键控制点.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酵母扩大培养过程关键控制点.doc（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

酵母扩大培养过程关键控制点

金星集团信阳啤酒有限公司黄华龙465100

啤酒工厂从单细胞分离得到一个酵母细胞，经过鉴定确认、生产试验，得到优良菌株，然后经过若干次扩大培养，最后制备成107～108个细胞/ml后供发酵用，酵母扩大培养关键在于：

第一，选择优良的单一细胞出芽菌株；第二，在整个扩大培养中保证酵母菌种的强壮、无污染。

近代由于发酵规模越来越大，对接种酵母要求越来越严。

各工厂扩大培养方式和顺序大致相同，而扩陪的结果得到种酵母的纯度、强壮情况、污染情况却差异很大，其原因在于是否有一个科学、无菌的扩培技术管理。

一、出芽菌株的选择

作为扩大培养的出芽菌株，，无论是实验室保藏菌株还是生产现场（主酵或酵母泥）分离得到的菌株。

一般均需进行单细胞分离，并通过一系列生理特性和生产性能测定，包括酿酒口味鉴评后，确认是工厂生产需要的优良纯种后才允许投入生产扩大培养。

此单细胞分离和菌株鉴定，需要在有丰富微生物理论和实践经验的技术人员指导下进行。

二、扩陪过程的无菌操作

扩大培养应严格建立在纯种的基础上，扩大培养过程的无菌技术

是扩陪成败的关键。

它包括：

培养器皿、设备的无菌，移种操作的无菌，培养过程中通风调节温度的无菌。

在汉生罐以后从麦汁进罐至移种结束，必须保证汉生罐处于正压状态，这是杜绝吸入有菌空气的先决条件。

三、优良的培养基

麦汁是啤酒厂最方便的酵母培养基，但绝对不是“凡可以用来酿

造啤酒的麦汁均是优良的培养基”。

许多工厂，常常从大生产麦汁中分割作为任何一级扩陪培养基，由于麦汁组成太差，会造成扩大培养失败。

无论是哪级扩陪，培养基均需要有特殊要求的麦芽汁。

实验室（从试管至大锥形瓶）培养用麦汁，一般应有实验室自己制备，可按以下方式制备成10°P全麦芽麦汁用于试管活化及菌种保藏。

1.麦汁制备:

1）称取优级麦芽约200g，除去铁屑、石粒等坚硬杂质，采用EBC粉碎。

2）调EBC粉碎机的磨间距，使细粉颗粒直径为0.2㎜。

3）料水比例：

1：

3～3.5

4）称取细粉适量（准确至0.1g），于已知重量的糖化杯（500～600ml专用金属杯中），加入46℃水200ml,在不断搅拌下于45℃水浴中保温30min。

5）把温度数显表调至70℃，设定。

使醪液以1℃/min的速度升温，在25min内升至70℃，此时于杯内加入70℃水100ml（加水时注意冲洗杯壁和搅拌棒）。

6）醪液在70℃下保温1hr，在保温10min时开始碘检，用玻璃棒取一滴麦汁，置于白瓷滴板上，冷却后加一滴碘溶液，混匀。

观察碘液颜色变化，每隔5min重复一次试验，直至碘液呈黄色。

7）保温结束后，在10～15min内用冰水迅速冷却至室温。

8）用水冲洗搅拌器，擦干糖化杯外壁，放置托盘天平上，加水使其内容物准确称量为450.0g

9）取干燥玻璃漏斗，内放入折叠好的中速滤纸，置于铁架台的固定铁环内，漏斗下用塑料杯连接。

10）将最初收集的约100ml滤液返回重滤，收集滤液于平底烧瓶内。

11） 把滤液置于甘油浴内煮沸40min后，或用电炉煮沸也可，用双层滤纸过滤至干燥杯中。

滤液用冰水冷却至15℃，取一洁净、干燥、恒重的比重瓶，用滤好的麦汁入20±1℃的高精度恒温水浴中，待内容物温度达20℃时，用滤纸吸取溢出支管的水，盖上小帽，擦干瓶壁，立即在分析天平上称量（准确至0.0001g）

12）根据公式计算滤液的比重。

（按常规麦汁检测方法操作）

13）然后从附录A中查出该比重所对应值，该值即为麦汁的浓度。

要求浓度为11±0.2°P，如达不到，则重做。

2.麦汁培养基的制备

1）澄清

（1） 按0.5—1L使用一个鸡蛋清的比例，取若干个鸡蛋，收集蛋清于一洁净的烧杯中用搅棒把蛋清打成泡沫儿。

（2） 将麦汁加热至45±2℃，加入打成泡沫的蛋清，在不断搅拌下保温30min然后升温煮沸30min。

（3） 煮沸后的麦汁用水浴冷却至80—90℃，用双层中速滤纸过滤。

2）调糖度：

将麦汁用蒸馏水调糖度至11±0.2°P。

3）用1N的磷酸调PH5.4～5.8，（检测方法同糖化检测醪液PH），即制成了麦汁液体培养基。

4）分装：

准备18×180的试管10支，每只试管各加10ml液体培养基。

5）灭菌：

将分装好的培养基放入高压蒸汽锅灭均，0.05Mpa40min。

放入无菌室备用。

3.蛋清的制备

取10个新鲜鸡蛋，收集蛋清，把蛋清打成泡沫儿，备用。

4.液体培养基的制备

取约10升大生产用的糖化麦汁，用滤布过滤后，加热至40℃，加入事先已准备好的蛋清煮至沸腾后，开始计时，再煮沸20分钟，加适量蒸馏水补充到麦汁浓度要控制在10℃～11℃之间，再煮沸至沸腾后，放凉、过滤。

用1N的磷酸调pH5.4~5.8，备用。

5.液体培养基的分装

⑴ 在20×200的试管中，加入10毫升液体培养基

⑵ 在250毫升锥形瓶中，加入150毫升液体培养基

⑶ 在3000毫升锥形瓶中，加入1500毫升液体培养基

⑷ 分装完毕后，试管和锥形瓶分别用牛皮纸包扎好。

准备灭菌。

6.液体培养基的灭菌

将上述制备好的液体培养基放入高压蒸气灭菌，0.05MPa，灭菌40分钟。

放无菌室备用。

7.固体培养基的制备：

1）制备：

取上述已处理过的澄清自制麦汁200毫升加入4克营养琼脂后，加热溶解后备用。

2）分装：

在18×180的试管中，加入10毫升固体培养基，用牛皮纸包扎好，准备灭菌。

3）灭菌；将上述制备好的固体培养基放入高压蒸气灭菌，0.05MPa，灭菌40分钟。

放无菌室备用。

8.卡氏罐麦汁的制备：

取大生产糖化麦汁16升，用四层滤布过滤，分装入两个体积15升的卡氏罐，每只卡氏罐大约装7.5升麦汁。

盖好盖子，塞上棉塞，用牛皮纸好。

高压蒸气灭菌。

0.05MPa，60分钟。

放无菌室备用。

从卡氏罐至各级扩大培养，由于培养基用量太大，一般由生产车间制备，但此麦汁也应是专供培养酵母用的，剩余麦汁可供啤酒生产用。

要求辅料比例不要太高，麦汁澄清透明。

现在，许多啤酒厂生产的麦汁a-N偏低，核苷酸、泛酸、肌醇不足，导致扩大培养中酵母营养不良，影响增殖。

四、恰当的扩大比例

在逐级扩大培养过程中，不同的扩大比，会影响到起始细胞浓度、扩陪时间、酵母菌龄一致性以及在扩大培养中抵抗杂菌污染的能力。

扩大比遵循的原则如下:

在汉生罐以前各级，由于采用较高培养温度（25～27°C），酵母倍增时间短，无菌操作条件好，可采用1:

10～20；反之，汉生罐以后各级，采用低温培养（不大于13°C），酵母倍增时间长，杂菌污染机会多，扩大比宜小，一般1:

4～5。

五、恰当的移种时间

酵母在一次培养基中培养，将经历滞缓期、对数生长期、稳定期、

死亡期等阶段。

我们都清楚在对数期移种，可获得出芽最多、死亡率最低、最强壮的种细胞，而滞缓期最短，增殖最旺盛。

困难在于如何判别接种后的对数期。

1）培养时间估算法

在优良麦汁培养基中，正确的扩大培养，酵母饱和期细胞数可达到9.0～12.0×107个/ml，在对数后期移种浓度一般在7.0～7.5×107个/ml。

培养温度（°C）

36

33

28

18

12

10

8

6

培养时间（h）

3.8

1.8

2.4

3.7

6

9

24

40

若采用10°C培养，世代时间为9h，接种后细胞浓度为1.5×107个/ml，规定移种细胞浓度为7.5×107个/ml。

酵母在对数增殖期遵循如下公式：

2n.a0=A;式中n-增殖次数；A-移种细胞浓度；a0-起始增殖细胞浓度，不等于起始细胞浓度，一般接种后仅有50%以下细胞能出芽增殖，余下细胞虽然可能是活细胞，但不出芽。

）设a0=1.5×107×50%，则培养时间t=t0+ntm式中t0-滞缓期时间（h），和培养温度有关，10°C培养一般为1～13h，取8h；n-增殖次数；tm-酵母在培养温度下倍增时间（h）。

则t=8+3.3222×9.0=37.9h，若采用12°C培养，则t0=6h，tm=6h，t=6+3.2222×6h；由上计算，如在10°C培养需38h，如12°C培养培养26h移种。

2）降糖判别法

啤酒酵母在11-12°P麦汁中通风培养，当酵母使麦汁还原糖降至

1/3-2/5时，酵母增殖曲线一般在对数的中期或中偏后，，此时外观泡沫最高并开始下降。

结合镜检，汉生罐出芽率45～50%、细胞数经通风搅拌后约6.5～7.5×107个/ml，死亡率在0～1%。

增殖罐出芽率在35～45%，细胞数在5.0～6.5×107个/ml，死亡率在0.5～1.0%。

对于凝聚性好的酵母，必须经通风搅拌后取样检测细胞数。

移种太早，虽然出芽率高，但细胞太嫩，不但会延迟下一级扩大培养时间，而且会增加下一级酵母的死亡率；移种太迟，虽然细胞数多，但出芽率低，下一级培养后酵母形态大小差异大。

六、严格控制培养条件

1.无菌室的消毒与灭菌：

1）每月一次

酵母无菌室应经常保持清洁，无灰尘，在使用前一个星期用甲醛和高锰酸钾熏蒸灭菌。

方法是按甲醛用量的一半称取高锰酸钾于一瓷碗或玻璃容器内，再量取定量的甲醛溶液，室内准备妥当后，甲醛液倒在盛有高锰酸钾的器皿内，立即关门。

几秒钟后、甲醛溶液即沸腾而挥发。

高锰酸钾是一种强氧化剂，当它与一部分甲醛液作用时，由氧化作用产生的热可使其余的甲醛液挥发为气体。

2）每周一次

另一种方法是用硫磺熏蒸，硫的杀菌作用要通过燃烧氧化后才得以实现，硫燃烧产生SO2，与水作用生成亚硫酸，它可以附着在菌体细胞上，夺取菌体的氧形成硫酸，同时使微生物脱氧，造成死亡。

燃烧硫磺的方法是将硫磺粉放在小铁合内，倒入少量酒精，然后点火燃烧，此时SO2气体散布于空气中。

二氧化硫具有强烈的刺激性，使用时应注意安全，防止中毒。

3）接种前，每天一次

紫外线照射法：

紫外线是位于可见光紫光区以外的，波长为136～390纳米的不可见光，其中波长为260纳米的紫外线杀菌力最强，人工制做的紫外线灯发出253.7纳米的紫外线杀菌力强且稳定。

另一方面，空气在紫外线照射下，可产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用。

接种室常用紫外灯光作空气除菌，为了加强紫外线灭菌效果，在开灯以前，可以的接种室内喷洒石炭酸溶液，一方面使空气中附着微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。

接种室内的桌面、凳子等可用2～3%的来苏儿水擦洗，然后再开紫外灯照射30分钟左右。

为了检验紫外线灭菌的效果，可以在灭菌后接种室内桌上和桌下（或屋内四个角及中央）各放一套已倾入营养琼脂培养基的平皿，把皿盖打开15分钟，盖上，至于37℃培养，如果每个平皿的菌落不超过4个，则可认为灭菌效果良好，若菌落很多，则需延长照射时间或同时加强其它措施。

注意事项：

紫外线对人体有伤害作用，尤其人的眼睛，所以不能直视开着的紫外灯，也不能在开着灯的情况下工作。

4）对生化培养箱用75%酒精棉球檫拭一遍，放入打开的平皿放置5

分钟，盖上平皿培养24小时，菌落不超过5个，否则认为灭菌不良，重新进行灭菌。

2.培养温度

现在诸多啤酒厂使用上面酵母菌，其最适生长温度在20～30°C，

实际生产扩大培养过程中，还需要考虑到减少酵母的死亡率、减少杂菌的可能及让酵母逐步适应发酵温度。

因此，酵母扩大培养采用逐级递减温度培养法。

如下：

a）试管培养：

培养温度：

25±0.5℃，培养时间：

24小时。

每隔4小时摇匀一次。

白班摇4次，上午下午各两次。

以下类同。

b）小三角瓶培养；培养温度：

23±0.5℃，培养时间：

24小时。

每隔4小时摇匀一次。

c）大三角瓶培养:

培养温度：

21±0.5℃，培养时间：

24小时。

每隔4小时摇匀一次。

d）卡氏罐培养:

培养温度：

17±0.5℃，培养时间：

24小时左右。

每隔2小时摇匀一次。

e）汉生罐培养：

培养温度：

15±1℃，