酵母扩大培养过程关键控制点.doc

1、酵母扩大培养过程关键控制点金星集团信阳啤酒有限公司 黄华龙 465100啤酒工厂从单细胞分离得到一个酵母细胞，经过鉴定确认、生产试验，得到优良菌株，然后经过若干次扩大培养，最后制备成107108个细胞/ml后供发酵用，酵母扩大培养关键在于：第一，选择优良的单一细胞出芽菌株；第二，在整个扩大培养中保证酵母菌种的强壮、无污染。近代由于发酵规模越来越大，对接种酵母要求越来越严。各工厂扩大培养方式和顺序大致相同，而扩陪的结果得到种酵母的纯度、强壮情况、污染情况却差异很大，其原因在于是否有一个科学、无菌的扩培技术管理。一、 出芽菌株的选择作为扩大培养的出芽菌株，无论是实验室保藏菌株还是生产现场（主酵或酵

2、母泥）分离得到的菌株。一般均需进行单细胞分离，并通过一系列生理特性和生产性能测定，包括酿酒口味鉴评后，确认是工厂生产需要的优良纯种后才允许投入生产扩大培养。此单细胞分离和菌株鉴定，需要在有丰富微生物理论和实践经验的技术人员指导下进行。二、 扩陪过程的无菌操作扩大培养应严格建立在纯种的基础上，扩大培养过程的无菌技术是扩陪成败的关键。它包括：培养器皿、设备的无菌，移种操作的无菌，培养过程中通风调节温度的无菌。在汉生罐以后从麦汁进罐至移种结束，必须保证汉生罐处于正压状态，这是杜绝吸入有菌空气的先决条件。三、 优良的培养基麦汁是啤酒厂最方便的酵母培养基，但绝对不是“凡可以用来酿造啤酒的麦汁均是优良的培

3、养基”。许多工厂，常常从大生产麦汁中分割作为任何一级扩陪培养基，由于麦汁组成太差，会造成扩大培养失败。无论是哪级扩陪，培养基均需要有特殊要求的麦芽汁。 实验室（从试管至大锥形瓶）培养用麦汁，一般应有实验室自己制备，可按以下方式制备成10P全麦芽麦汁用于试管活化及菌种保藏。1. 麦汁制备:1) 称取优级麦芽约200g，除去铁屑、石粒等坚硬杂质，采用EBC 粉碎。2) 调EBC粉碎机的磨间距，使细粉颗粒直径为0.2。3) 料水比例：1：33.54) 称取细粉适量（准确至0.1g），于已知重量的糖化杯（500600ml专用金属杯中），加入46水200ml,在不断搅拌下于45水浴中保温30min。5)

4、 把温度数显表调至70，设定。使醪液以1/min的速度升温，在25min内升至70，此时于杯内加入70水100ml（加水时注意冲洗杯壁和搅拌棒）。6) 醪液在70下保温1hr，在保温10min时开始碘检，用玻璃棒取一滴麦汁，置于白瓷滴板上，冷却后加一滴碘溶液，混匀。观察碘液颜色变化，每隔5min重复一次试验，直至碘液呈黄色。7) 保温结束后，在1015min内用冰水迅速冷却至室温。8) 用水冲洗搅拌器，擦干糖化杯外壁，放置托盘天平上，加水使其内容物准确称量为450.0g9) 取干燥玻璃漏斗，内放入折叠好的中速滤纸，置于铁架台的固定铁环内，漏斗下用塑料杯连接。10) 将最初收集的约100ml滤液

5、返回重滤，收集滤液于平底烧瓶内。11) 把滤液置于甘油浴内煮沸40min后，或用电炉煮沸也可，用双层滤纸过滤至干燥杯中。滤液用冰水冷却至15，取一洁净、干燥、恒重的比重瓶，用滤好的麦汁入201的高精度恒温水浴中，待内容物温度达20时，用滤纸吸取溢出支管的水，盖上小帽，擦干瓶壁，立即在分析天平上称量（准确至0.0001g）12) 根据公式计算滤液的比重。（按常规麦汁检测方法操作）13) 然后从附录A中查出该比重所对应值，该值即为麦汁的浓度。要求浓度为110.2P，如达不到，则重做。2. 麦汁培养基的制备1) 澄清(1)按0.51L使用一个鸡蛋清的比例，取若干个鸡蛋，收集蛋清于一洁净的烧杯中用搅棒

6、把蛋清打成泡沫儿。(2)将麦汁加热至452，加入打成泡沫的蛋清，在不断搅拌下保温30min然后升温煮沸30min。(3)煮沸后的麦汁用水浴冷却至8090，用双层中速滤纸过滤。2) 调糖度 ：将麦汁用蒸馏水调糖度至110.2P。3) 用1N的磷酸调PH5.45.8，（检测方法同糖化检测醪液PH），即制成了麦汁液体培养基。4) 分 装 ：准备18180的试管10支，每只试管各加10ml液体培养基 。5) 灭 菌 ：将分装好的培养基放入高压蒸汽锅灭均，0.05Mpa 40min。放入无菌室备用。3. 蛋清的制备取10个新鲜鸡蛋，收集蛋清，把蛋清打成泡沫儿，备用。4. 液体培养基的制备取约10升大生产

7、用的糖化麦汁，用滤布过滤后，加热至40，加入事先已准备好的蛋清煮至沸腾后，开始计时，再煮沸20分钟，加适量蒸馏水补充到麦汁浓度要控制在1011之间，再煮沸至沸腾后，放凉、过滤。用1N的磷酸调pH 5.45.8，备用。5. 液体培养基的分装在20200的试管中，加入10毫升液体培养基在250毫升锥形瓶中，加入150毫升液体培养基在3000毫升锥形瓶中，加入1500毫升液体培养基分装完毕后，试管和锥形瓶分别用牛皮纸包扎好。准备灭菌。6. 液体培养基的灭菌将上述制备好的液体培养基放入高压蒸气灭菌，0.05MPa，灭菌40分钟。放无菌室备用。7. 固体培养基的制备：1) 制备：取上述已处理过的澄清自制

8、麦汁200毫升加入4克营养琼脂后，加热溶解后备用。2) 分装：在18180的试管中，加入10毫升固体培养基，用牛皮纸包扎好，准备灭菌。3) 灭菌；将上述制备好的固体培养基放入高压蒸气灭菌，0.05MPa，灭菌40分钟。放无菌室备用。8. 卡氏罐麦汁的制备：取大生产糖化麦汁16升，用四层滤布过滤，分装入两个体积15升的卡氏罐，每只卡氏罐大约装7.5升麦汁。盖好盖子，塞上棉塞，用牛皮纸好。高压蒸气灭菌。0.05MPa，60分钟。放无菌室备用。从卡氏罐至各级扩大培养，由于培养基用量太大，一般由生产车间制备，但此麦汁也应是专供培养酵母用的，剩余麦汁可供啤酒生产用。要求辅料比例不要太高，麦汁澄清透明。现

9、在，许多啤酒厂生产的麦汁a-N偏低，核苷酸、泛酸、肌醇不足，导致扩大培养中酵母营养不良，影响增殖。四、 恰当的扩大比例 在逐级扩大培养过程中，不同的扩大比，会影响到起始细胞浓度、扩陪时间、酵母菌龄一致性以及在扩大培养中抵抗杂菌污染的能力。扩大比遵循的原则如下:在汉生罐以前各级，由于采用较高培养温度（2527C），酵母倍增时间短，无菌操作条件好，可采用1:1020；反之，汉生罐以后各级，采用低温培养（不大于13C），酵母倍增时间长，杂菌污染机会多，扩大比宜小，一般1:45。五、 恰当的移种时间酵母在一次培养基中培养，将经历滞缓期、对数生长期、稳定期、死亡期等阶段。我们都清楚在对数期移种，可获得出

10、芽最多、死亡率最低、最强壮的种细胞，而滞缓期最短，增殖最旺盛。困难在于如何判别接种后的对数期。1) 培养时间估算法 在优良麦汁培养基中，正确的扩大培养，酵母饱和期细胞数可达到9.012.0107个/ml，在对数后期移种浓度一般在7.07.5107个/ml。培养温度（C）36332818121086培养时间（h）3.81.82.43.7692440 若采用10C培养，世代时间为9h，接种后细胞浓度为1.5107个/ml，规定移种细胞浓度为7.5107个/ml。酵母在对数增殖期遵循如下公式：2n.a0=A;式中n-增殖次数；A-移种细胞浓度；a0-起始增殖细胞浓度，不等于起始细胞浓度，一般接种后仅

11、有50%以下细胞能出芽增殖，余下细胞虽然可能是活细胞，但不出芽。)设a0=1.510750%，则培养时间t=t0+ntm式中t0-滞缓期时间（h），和培养温度有关，10C培养一般为113h，取8h；n-增殖次数；t m-酵母在培养温度下倍增时间（h）。则t=8+3.32229.0=37.9h，若采用12C培养，则t0=6h，t m=6h，t=6+3.22226h；由上计算，如在10C培养需38h，如12C培养培养26h移种。2) 降糖判别法啤酒酵母在11-12P麦汁中通风培养，当酵母使麦汁还原糖降至1/3-2/5时，酵母增殖曲线一般在对数的中期或中偏后，此时外观泡沫最高并开始下降。结合镜检，汉

12、生罐出芽率4550%、细胞数经通风搅拌后约6.57.5107个/ml，死亡率在01%。增殖罐出芽率在3545%，细胞数在5.06.5107个/ml，死亡率在0.51.0%。对于凝聚性好的酵母，必须经通风搅拌后取样检测细胞数。 移种太早，虽然出芽率高，但细胞太嫩，不但会延迟下一级扩大培养时间，而且会增加下一级酵母的死亡率；移种太迟，虽然细胞数多，但出芽率低，下一级培养后酵母形态大小差异大。六、 严格控制培养条件1. 无菌室的消毒与灭菌：1) 每月一次酵母无菌室应经常保持清洁，无灰尘，在使用前一个星期用甲醛和高锰酸钾熏蒸灭菌。方法是按甲醛用量的 一半称取高锰酸钾于一瓷碗或玻璃容器内，再量取定量的甲

13、醛溶液，室内准备妥当后，甲醛液倒在盛有高锰酸钾的器皿内，立即关门。几秒钟后、甲醛溶液即沸腾而挥发。高锰酸钾是一种强氧化剂，当它与一部分甲醛液作用时，由氧化作用产生的热可使 其余的甲醛液挥发为气体。2) 每周一次另一种方法是用硫磺熏蒸，硫的杀菌作用要通过燃烧氧化后才得以实现，硫燃烧产生SO2，与水作用生成亚硫酸，它可以附着在菌体细胞上，夺取菌体的氧形成硫酸，同时使微生物脱氧，造成死亡。燃烧硫磺的方法是将硫磺粉放在小铁合内，倒入少量酒精，然后点火燃烧，此时SO2气体散布于空气中。二氧化硫具有强烈的刺激性，使用时应注意安全，防止中毒。3) 接种前，每天一次紫外线照射法：紫外线是位于可见光紫光区以外的

14、，波长为136390纳米的不可见光，其中波长为260纳米的紫外线杀菌力最强，人工制做的紫外线灯发出253.7纳米的紫外线杀菌力强且稳定。另一方面，空气在紫外线照射下，可产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用。接种室常用紫外灯光作空气除菌，为了加强紫外线灭菌效果，在开灯以前，可以的接种室内喷洒石炭酸溶液，一方面使空气中附着微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。接种室内的桌面、凳子等可用23%的来苏儿水擦洗，然后再开紫外灯照射30分钟左右。为了检验紫外线灭菌的效果，可以在灭菌后接种室内桌上和桌下（或屋内四个角及中央）各放一套已倾入营养琼脂培养基的平皿，把皿盖打开15分钟，盖上，至于37培养，如

15、果每个平皿的菌落不超过4个，则可认为灭菌效果良好，若菌落很多，则需延长照射时间或同时加强其它措施。注意事项：紫外线对人体有伤害作用，尤其人的眼睛，所以不能直视开着的紫外灯，也不能在开着灯的情况下工作。4) 对生化培养箱用75%酒精棉球檫拭一遍，放入打开的平皿放置5分钟，盖上平皿培养24小时，菌落不超过5个，否则认为灭菌不良，重新进行灭菌。2. 培养温度现在诸多啤酒厂使用上面酵母菌，其最适生长温度在2030C，实际生产扩大培养过程中，还需要考虑到减少酵母的死亡率、减少杂菌的可能及让酵母逐步适应发酵温度。因此，酵母扩大培养采用逐级递减温度培养法。如下：a) 试管培养：培养温度：250.5，培养时间：24小时。每隔4小时摇匀一次。白班摇4次，上午下午各两次。以下类同。b) 小三角瓶培养；培养温度：230.5，培养时间：24小时。每隔4小时摇匀一次。c) 大三角瓶培养:培养温度：210.5，培养时间：24小时。每隔4小时摇匀一次。d) 卡氏罐培养: 培养温度：170.5，培养时间：24小时左右。每隔2小时摇匀一次。e) 汉生罐培养：培养温度：151，