TLC法.docx

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TLC法

TLC

第二部分色谱分析

第一章薄层色谱法（TLC）

一薄层色谱法概述

薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。

与HPLC不同，TLC将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。

被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流动相（深度约5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。

被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。

薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。

二薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开

（一）薄层板

TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。

可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱分离的选择性。

此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对其色谱行为产生影响。

（1）载体对TLC载体的基本要求为：

机械强度好、化学惰性好（对溶剂、显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。

（2）固定相TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。

硅胶和氧化铝是最常用的两种未改性固定相。

（3）粘合剂在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。

常用的粘合剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。

（4）荧光指示剂荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点（无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。

加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。

（二）薄层板的涂铺

涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。

TLC固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。

薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。

（三）点样

点样是TLC分离和精确定量的关键。

不同种类的样品常需选用不同的配样溶剂，一般采用易挥发的非极性或弱极性溶剂配样。

离子型化合物样品，常需先衍生化成在挥发性强、极性小的溶剂中易溶解的样品衍生物。

最适合点样的样品浓度应为（1～5）μg·μL-1，点样体积视点样技术不同而异。

TLC定量分析时，样品量的适宜范围为最小检出量的几倍至几十倍。

样品原点一般在1mm左右为佳，原点过大或样品量过大，会导致分离变坏。

点样步骤一般占TLC全部分析时间的三分之一左右，所以使点样仪器化、自动化，既快又准，获得好的重复性，是TLC工作者所期盼的。

（四）展开

TLC展开就是流动相沿薄层（固定相）运动，以实现样品混合组分分离的过程。

这一过程需在具有一定形状的展开室中进行。

薄层展开有三种形式，直线式展开方式为实际应用中使用最普遍的展开方式。

三薄层色谱流动相与展开机制

（一）对流动相溶剂选择的基本考虑

薄层色谱溶剂的选择对分离的影响很大。

与HPLC同理，对复杂样品的分离能否得到理想的结果，流动相的选择是最重要的因素之一，不同溶质与流动相分子、固定相分子间的作用力不同，因此其移动速度也不同，最终导致样品中各组分的分离。

对流动相的选择不仅需考虑极性、选择性等因素，更基本的应注意以下因素的影响：

（1）溶剂纯度，含有杂质影响分离。

（2）溶剂吸收环境水分，会使极性等性质改变。

（3）存放条件不适宜或贮存时间过长，溶剂会变性。

（4）混合流动相之间发生作用会使溶剂性质改变。

溶剂极易挥发，流动相组成随时改变。

（二）几种常用薄层色谱分离模式的展开机制

1.液固吸附展开

在TLC分离中，液固展开是一种最经典的展开方式。

液固展开常用极性吸附硅胶、氧化铝作固定相。

流动相依其极性可在吸附剂表面形成单分子或双分子溶剂吸附层，展开过程中，组分的保留及分离选择性主要有以下三种因素决定：

a.溶剂对样品的溶解能力；

b.溶质和流动相分子对固定相表面活性吸附位点的竞争；

c.溶质分子与吸附剂表面上吸附中心间的特殊作用力。

2.液液分配展开

与液液分配柱色谱分配机理相同，组分在互不相溶的两液相中的溶解度不同，因此迁移速率存在差异，在迁移过程中得到分离。

除以上两种展开机制外，还有化学键合相展开和离子交换展开。

四薄层色谱吸附剂与载体的选择

1.薄层色谱对吸附剂的要求为：

1.具有大的表面积与足够的吸附能力；

2.对不同的组分有不同的吸附性，因而能较好的分离不同的化学组分；

3.在所用的溶剂和展开剂中不溶解；

4.不与试样中各组分、溶剂和展开剂起化学反应或破坏、分解作用

5.颗粒均匀、在使用过程中不会碎裂

6.具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解吸；

7.为便于观察分离结果，最好是白色固体。

2.分配色谱对所用载体的要求为：

a.表面积大；

b.在展开剂中不溶解，与展开剂和样品组成不起化学反应或分解作用；

c.对样品组分无吸附性或吸附性极弱；

d.对固体液是惰性的。

五薄层色谱扫描仪

（一）仪器结构

TLC扫描仪结构主要包括光学元件组合系统、电子元件组合系统及机械元件组合系统。

（二）主要功能

薄层色谱扫描仪主要用于TLC图被分离斑点和薄层空白的光学相应信号测

量。

要求仪器光源稳定，光波单色性能好，光波长在（200～800nm）检测器灵敏度高。

六薄层色谱定性定量方法

（一）斑点定位

斑点定位必须采用非破坏性方法。

当斑点紫外光显示时，可采用长波长和短波长紫外灯，使用方便、灵活。

采用化学试剂显色时，通过手动或电动喷雾器向展开好的薄层板喷洒显色试剂。

（二）定性方法

1.利用保留值定性

在特定的色谱系统中，化合物的Rf值一定，比较未知物和标准物的Rf值，能够作为鉴定未知物的依据。

Rf值的准确测定受多方面因素影响，为了增加Rf值定性的可靠性，必须通过改变色谱系统的选择性，重复测定同一化合物的Rf值。

如果在分离机理不同的色谱体系中，比较Rf值仍能得到肯定的结果，那么其可靠性将更大。

2.板上化学反应定性

板上化学反应定性主要有以下两种方式：

a.反应后生成特征颜色的化合物，借以鉴定反应物；

b.反应后生成复杂的、无法鉴定组分的混和物，但可根据生成物的“指纹”

特征加以鉴定；

c.除以上两种定性反方法外，还有板上光谱定性、TLC与其他联用技术间

接联用定性、薄层色谱－傅里叶变换红外光谱联用定性以及薄层色谱－质谱联用定性。

（三）定量方法

1.间接定量法

间接定量法就是将TLC已分离的物质斑点洗脱下来，再采用其他方法对该洗脱液进行定量分析。

TLC间接定量的关键是斑点组分的定量洗脱。

选用怎样的洗脱方法，取决于，组分和薄层吸附剂的性质。

用来洗脱组分斑点的溶剂，对下一步定量方法应无影响。

a.分光光度法将下来的洗脱液配制成标准体积，再同样条件下对样品和

标准液进行吸光值测量。

b.HPLC法以TLC法斑点洗脱液直接作HPLC分离和定量

c.GC法以TLC法斑点洗脱液直接作GC分离和定量。

d.质谱法采用组分质谱图中的特征离子峰可进行定量。

2.直接定量法

a.斑点面积测量法以半透明纸扫下TLC图上的斑点界限，然后测量其面

积。

将斑点面积同平行操作的标准样面积相比较进行定量。

b.目测法将被测样品和系列溶液点在同一薄层板上，展开后用适当方法

显色，可以得到系列斑点，将被测样品的斑点面积大小和颜色与标准系列的斑点相比较，可推测出样品的含量范围。

这种定量法非常适用于对常规大量样品的重复分析。

七应用实例—TLC测定黄曲霉毒素B1

（一）、原理

根据黄曲霉毒素B1能在波长365毫微米紫外光下产生蓝紫色荧光的特性，采取薄层层析法，将样品经提取、浓缩、薄层分离后，利用其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定其含量。

（二）、试剂

1.石油醚：

沸程30－60℃

2.正已烷

3.氯仿

4.苯

5.乙腈

6.甲醇

7.无水乙醚：

如不是无水乙醚，则应脱水后再用。

8.丙酮

9.无水硫酸钠

10.硅胶G：

薄层层析用

11.苯乙腈混合液：

取苯98毫升，乙腈2毫升，混匀冰箱存放备用。

12.三氟醋酸

13.黄曲霉毒素消毒剂：

5％次氯酸钠溶液，取100克漂粉精，加入500毫升水，搅匀，另溶解70克碳酸钠（Na2Co3、H2O）于500毫升温水中，溶后，倒入上述溶液中搅匀、澄清、过滤、备用。

14.黄曲霉毒素标准溶液

①标准储备液（1.02微克/毫升）：

GBW（E）090015严格控制、应加锁于冰箱中避光存放。

（每次记录用量、余量，以备复查）。

②稀释液Ⅰ（0.2微克/毫升）取储备液加苯乙腈混合液稀释。

③稀释液Ⅱ（0.04微克/毫升）取稀释液1毫升以苯乙腈混合液稀释。

（三）、仪器

1.小型粉碎机

2.分样筛一套

3.电动振荡器

4.电吹风机

5.薄层板涂布器（可以自制）

6.玻璃板：

5×20厘米

7.展开槽：

（层析）内长25厘米，宽6厘米，高4厘米

8.1－10毫升刻度吸管

9.紫外光灯：

365nm，220v，125w，启动电流1.8A

10.微量进样器：

20微升，10微升

11.分液漏斗：

125毫升

12.蒸发器：

60毫升

13.玻璃漏斗

14.样液瓶：

具塞2毫升

15.脱脂棉：

在索氏脂肪提取器以氯仿提取2小时挥干备用

16.电热恒温水浴

（四）、操作方法

1.提取

①适用于大米、玉米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。

称取经过粉碎（20目筛）的样品20克于250毫升具塞三角烧瓶中，加正已烷30毫升，甲醇水（55∶45）100毫升，加塞后加水少许，盖严防漏，振荡30分钟，静置片刻，以脱脂棉过滤于分液漏斗中，待分层，放出下层的甲醇水溶液20毫升（相当于样品4克）于另一分漏斗中，加氯仿20毫升，振摇二分钟，静止分层。

另备一漏斗底部铺脱脂棉少许，再加无水硫酸钠10克，下接60毫升蒸发皿，漏斗中的无水硫酸钠先用氯仿湿润。

将分层后的氯仿放入已备好的具有无水硫酸钠的漏斗中，过滤，再加5毫升氯仿于分液漏斗中，分层后一并滤于同一蒸发皿中，最后用少量氯仿洗涤滤器，洗液并入以上蒸发皿中。

将蒸发皿放入通风橱内于65℃水浴上通风挥干，然后放在水浴上冷却2－3分钟，准确加入苯乙腈1毫升。

用带橡皮头的滴管的尖端将残渣充分混合，若有结晶析出（苯），将蒸发皿从水浴上取下，继续溶解，混合，晶体消失，再用此管吸取上清液，转移于2毫升样液瓶中，若溶液不够澄清，应离心，或放置等候澄清，取上清液供薄层点板用。

［注］加入氯仿振摇2分钟如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层或用电吹风机吹热风促使分层。

含油脂较多的样品如花生等也可采用脱油提取，即称取粉碎样品20克移于滤纸筒内，筒内塞以少量脱脂棉，置于250毫升脂肪提取器内，在75－85℃水浴上以石油醚提取脱油8小时，然后将滤纸筒挥干。

将脱油后的样品移于250毫升具塞三角烧瓶内，进行检验。

如样品是玉米、大米、小麦时亦可采用下法提取：

称取粉碎过筛样品20克于250毫升具塞三角烧瓶内，用滴管滴加6毫升水，使样品湿润，并准确加入氯仿60毫升，振荡30分，加无水硫酸钠12克，振摇静止30分；以脱脂棉过滤取滤液12毫升（相当于样品4克）于蒸发皿，以下步骤与①同。

②适用于花生油、香油、芽籽油等。

称取样品4克于小烧杯中，用正已烷20毫升转移于125毫升分液漏斗中，再用甲醇水（55+45）20毫升分数次洗涤小烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇2分钟，静止分层后，将下层甲醇水溶液移于第二个分液漏斗中，原分液漏斗中再加甲醇水5毫升，振荡提取一次，甲醇水溶液一并移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入氯仿20毫升，振摇二分静止分层以后按①操作。

③适用于酱油、醋，方法有二：

第一法：

称取样品10克于小烧杯中，为防止提取时乳化，加氯化钠4克，移于分液漏斗中，烧杯用氯仿15毫升分次洗涤，洗液一并移于分液漏斗中，以下自振摇2分钟，静止分层后按第①操作。

最后加入2.5毫升苯乙腈溶解，此液每毫升相当于样品4克。

第二法：

称取样品10克移于分液漏斗中，加甲醇12毫升（以酱油代替水，故甲醇与水体积比仍约为55+45）加氯仿20毫升提取，以下自振摇2分钟起，按①操作，最后加苯乙腈2.5毫升，每毫升相当于样品4克。

④适用于酱类（包括豆乳制品）

称取样品20克于250毫升具塞三角烧瓶中，加正已烷20毫升与甲醇水50毫升，振荡30分钟，静止片刻，以脱脂棉过滤，滤液静止分层后，取甲醇水24毫升于分液漏斗中加入氯仿20毫升振荡2分静止分层下以按①操作，最后加入苯乙腈2毫升，每毫升相当于样品4克。

注：

以上检品极易乳化，实在分不开层时，可采用离心分层的办法。

⑤适用于发酵酒类

称取样品10克于小烧杯中，以氯仿15毫升分次洗于分液漏斗中，振摇2分钟，静置分层后按①操作，最后加入苯乙腈2.5毫升，此溶液每毫升相当于样品4克。

⑥适用发酵用曲种及菌株

称取样品10克于具塞三角烧瓶中，加入正已烷30毫升与甲醇水（55+45）80毫升，振荡半小时，用脱脂棉过滤于分液漏斗中，取出甲醇水溶液32毫升（相当于样品4克）于另一分液漏斗中，加入30毫升氯仿提取。

振摇2分静止分层。

以下按①操作。

2.薄层色谱分析和计算

（1）单向展开法

a.薄层板的制备：

一般现在用成品硅胶板。

如需自己制板，方法如下：

称取硅胶G约3克（或称取硅胶85克与石膏粉15克，充分混合均匀后称取3克）加相当于硅胶2－3倍的水在玻璃乳钵中研磨1－2分钟，至成均匀的糊状后立即倒入涂布器内，推成5×12厘米，厚约0.25毫米的薄层板3块。

在空气中干燥15分钟后，放入烘箱内100℃活化2小时取出放入干燥器内保存，一般在干燥器内可保存2－3天，若放置时间较长，则应重新活化。

b.点样

将薄层板边缘上附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3厘米的基线上，用进样器滴加样液，一块可以滴加四个点，点距边缘和点间距离约为1厘米，点直径应掌握在3毫米以内为好，在同一板上滴加的点应大小一致，在滴加样液的时候，可以吹风机吹冷风边吹边点。

滴加试样如下：

第一点：

黄曲霉毒素标准液（0.04微克/毫升）10微升。

第二点：

样液20微升（如样液8克/毫升）时也可点10微升。

第三点：

样液20微升加黄曲霉毒素B1标准液（0.04微克/毫升）10微升。

第四点：

样液20微升加黄曲霉毒素B1标准液（0.2微克/毫升）10微升。

C.展开与观察

在展开槽（层析槽）内加无水乙醚10毫升，予展12厘米，取出挥干，再于另一展开槽内加丙酮氯仿液（8+92）展开10－12厘米取出在紫外光（365毫微米）下观察，结果如下：

样液点上加黄曲霉毒素B1标准溶液，可使黄曲霉毒素B1标准点与样液中的黄曲霉毒素B1萤光点重叠。

如样液为阴性，薄层板上的第三点黄曲霉毒素B1为0.0004微克，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B1最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定位作用，薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1为0.002微克，主要起定位作用，若第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上，无蓝色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5微克/公斤以下，如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需要确证试验。

D.确证试验

为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，滴加三氟乙酸产生黄曲霉毒素B1的衍生物，展开后，这种衍生物的比移值，约在0.1左右。

其方法是：

在薄层板左边依次滴加两个点：

第一点：

样液20微升。

第二点：

黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2微克/毫升）10微升，以上两点各加三氟醋酸一小滴盖于样点上，反应五分钟后，用吹风机吹热风2分钟，使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃，再于薄层板上滴加2个点。

第三点：

样液20微升。

第四点：

黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2微克/毫升）10微升。

再展开同前，在紫外灯光下，观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1相同的衍生物，未加三氟乙酸与3、4两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。

E.稀释定量

样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量（0.0004微克）的荧光强度一致，则样品中的黄曲霉毒素定量即为5微克/公斤，如样品中的荧光强度比最低检量强，则根据强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后，再滴加不同的微升数，如10微升、15微升，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。

滴加试样如下：

第一点：

黄曲霉毒素标准液（0.04微克/毫升）

第二点

第三点根据情况滴加样液

第四点

（五）、结果计算

黄曲霉毒素B1（微克/公斤）

式中：

V1——加入苯乙腈混合液的毫升数，毫升；

V2——出现最低荧光时滴加样液的毫升数，毫升；

D1——样液的总稀释倍数；

W1——苯乙腈溶解时相当试样重量克数，克；

0.0004——黄曲霉毒素B1的最低检出量，微克。

如用单向展开法展开后，薄层板上由于杂质的干扰，掩盖了黄曲霉毒素B1的荧光强度时，需采用双向展开法。

薄层板先用无水乙醚作横向展开，把干扰的杂质推到样液点的旁边，而黄曲霉毒素B1不动，然后再用丙酮氯仿混合液进行纵展，这样试样里在黄曲霉毒素B1相应处的杂质的颜色将大量减少，因而就提高了方法的灵敏度，如用双向展开法中的滴加两点法展开后仍有杂质时则可改用滴加一点法，现将两种方法分别介绍于后面。

A.滴加两点法

首先是滴样，取薄层板三块，在距下端三厘米基线上滴加黄曲霉毒素B1标准溶液与样液，其具体作法是：

在三块板距左边缘0.8厘米处各滴加黄曲霉毒素B1标准溶液（0.04微克/毫升）10微升，在距左边缘2.8厘米各滴加样液20微升；然后在第二块板的样液点上加黄曲霉毒素B1标准溶液（0.04微克/毫升）10微升。

在第三块板的样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2微克/毫升）10微升。

第二步展开。

先进行横展，在展开槽内的长边置一玻璃支架，加无水乙醚10毫升，将点好的板靠标准点的长边置于层析槽内展开，展至板端后继续展开1分钟，取出挥干再进行纵展。

挥干的薄层板以丙酮氯仿（8+92）展开至12厘米为止（丙酮、氯仿比例也可根据不同条件自行调节）。

然后进行观察和评定结果。

在紫外灯光下，观察第一、二板，若第二板的第二点在B1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在第二板的相同位置上未出现荧光点，则试样中黄曲霉毒素B1含量在5微克/公斤以下。

若第一板与第二板的相同位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置的荧光点是与B1的标准重叠，如果重叠，再进行以下衍生物确证试验。

在具体测定中第一、二、三板可以同时作，亦可按照顺序作，当第一板出现阴性时第三板可以省略。

如第一板为阳性，第二板可省略，直接作第三板。

如果需要作确证试验，于第四、五两板距边缘0.8厘米处各滴加B1标准液（0.2微克/毫升）10微升，再于其上滴加三氟醋酸一小滴，距左边缘2.8厘米处，第四板滴加样液20微升，三氟醋酸一小滴，第五板滴加样液20微升，黄曲霉毒素标准溶液（0.2微克/毫升）10微升，三氟乙醋一小滴，产生衍生物的步骤同单相展开法。

再用双向展开法，展开后，观察样液点是否产生与B1标准点重叠的产物，观察时可将第一板作为样液的衍生物后的板。

如样液黄曲霉毒素B1含量高时，则将样液稀释后，按单向展开法D项作确证试验。

并按照单向展开法进行稀释定量，如含毒素低稀释倍数小，在定量的纵板上仍有干扰，并影响结果判断，可将板上需要判断的样液点再分别作双向展开观察，以确定含量，结果计算，同单向展开法。

B.滴加一点法（多用于杂质干扰严重的样液）

滴样：

取薄层板三块，在距下缘3厘米的基线上滴加黄曲霉毒素B1标准液与样液。

作法是在三块板的左边缘0.8厘米处各滴加样液20微升。

第二板的点上滴加黄曲霉毒素B1标准液（0.04微克/毫升）10微升，在第三板的点上滴加黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2微克/毫升）10微升。

展开：

同滴加两点中的横展和纵向展开。

观察与评定结果：

在紫外光灯下，观察一、二板，如第二板出现最低检出量的B1标准点，而第一板与其相同位置未出现荧光点，样品中黄曲霉毒素B1含量在5微克/公斤以下，如第一板在与第二板B1标点相同位置出现荧光点，则应将第一板与第二板比较，看第三板上与第一板相同位置的荧光点，是否与B1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。

滴加以下二板，距左边缘0.8厘米处第四板滴加样液20微升，三氟醋酸一小滴，第五板滴加样液20微升，黄曲霉毒素B1标准液（0.2微克/毫升）10微升及三氟醋酸一小滴，产生衍生物的步骤同单向展开法，再用双向展开法展开后，将以上两板在此外光灯下观察，以确定样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物，观察时可将第一板作为样液的衍生物空白板。

经过以上确证试验定为阳性后，再进行稀释定量。

如含黄曲霉毒素B1低不需稀释或稀释倍数小，杂质仍有严重干扰，可根据样液中黄曲霉毒素B1荧光的强弱，直接用双向展开法定量。

或者与单向展开法结合使用，方法同上。

其计算同单向展开法。

注意事项：

（1）黄曲霉菌所产生的代谢产物，具有较强毒性，自然界中易被污染的有玉米、花生等，其中以黄曲霉毒素B1最多，B2、G1、G2较少。

故我们一般仅作黄曲霉毒素B1测定。

在测定中黄曲霉毒素高的霉粒，一粒就可以左右测定结果，而有毒霉粒在整个检品中占比例是小的，而分布又不均匀，为避免采样带来的误差，取样量应尽量多一些，（1000克）并将取样充分均合尽多的粉碎，使尽量取得相对可靠一些的结果，因而在取样时应注意：

①根据规定检取有代表性样品。

②对局部霉变样，应单独取样检验。

③每份分析测定用样品，应将大样经粗碎后连续多次用四分法分样至1－2斤再全部粉碎粮食样品，通过20目筛，花生不易过筛。

但应磨到一定程度并充分混合均匀。

（2）据以上实验条件黄曲霉毒素B1的最低检出量是0.0004微克，方法的灵敏度为5微克/公斤，回收率约为75％以上。

（3）展开剂丙酮与氯仿比例可随比移值大小，与分离情况而调节，如果比移值太大，可减少丙酮体积反之则增加。

（4）对杂质少含毒量又高的样品可不予展，直接用丙氯液（8+92）展开。

（5）在气候潮湿的条件下，薄层板的活性容易降低，影响检出量，因此在使用薄层板时，当日活化为好，滴加样液和标准液时，可将板放在盛有干燥剂（硅胶）的层析槽内进行。

（6）玉米、大米、小麦、面粉、花生等试样按方法提取后，用上述单向展开法测定，薯干用双向展开法测定。

（7）在具体测定条件下，有时用无水乙醚作薄层板的横展后，标准B1点仍有稍微移动，这并不影响测定结果。

（8）在80－200目硅胶中加热盐酸水溶液（1+4）浸没硅胶，搅拌15分钟后，倾去上液，再用水洗至无氯离子为止，于100℃干燥，磨碎，过250目筛，此种硅胶的性能较为满意。

于空白样液点上滴加黄曲霉毒素B1最低检出量时，经展开后，能使黄曲霉毒素B1点与杂质分离，没有拖尾现象，而且在暗的条件下，其点形十几小时内不消失。