仪器分析论文1.docx

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仪器分析论文1

高效液相色谱仪器在化工生产中的应用

摘要:

高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的，已在药品检验中获得广泛应用,发挥巨大作用。

本文介绍了高效液相色谱仪器的有关知识、新方法和技术：

综述高效液相色谱仪器的分析原理和特点，简介高效液相色谱仪器的基本构造，评述高效液相色谱法在食品分析中的应用研究进展，并对其应用前景进行了展一种色谱方法,以及在药品检验中的应用。

关键词:

高效液相色谱仪;药品检验;综述，食品分析；应用，中药指纹图谱

高效液相色谱法:

自20世纪60年代崛起,经过数十年的发展,在

理论和实践方面日趋完善,应用范围已涉及食品，医药、环保、生命

科学、石油化工等几乎所有基础与应用领域。

在药品和食品检验中

的应用尤其广泛,发展尤其快速。

高效液相色谱法自1985年

版5中国药典6收载以来,在药品检验中应用增加迅速,在药品

质量控制中的作用日益明显,已经成为一种主流的色谱分析

方法。

高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上发展起来的

一种色谱方法,与经典的液相色谱法相比,高效液相色谱

法具有下列主要优点:

应用了颗粒极细（一般为10Lm以下）、

规则均匀的固定相,传质阻抗小,分离效率高;采用高压输液

泵输送流动相,分析时间短;广泛使用了高灵敏检测器,大大

提高了检测灵敏度。

目前,已经获得广泛使用的不同种类的

固定相、众多的分离模式与检测器以及自动化程度。

1HPLC在药品检验中的应用

高效液相色谱法在1985年版5中_______国药典6中收载后,为药

品检验工作更高效、灵敏、准确地进行药物质量控制奠定了基

础,并迅速成为药品检验采用的主流分析方法之一。

使用高

效液相色谱法的标准品种从1985年版药典的7种,增加至

2005年的1327种,在2010年版5中国药典6更是增加至约

2000种;其在药品检验领域中的作用日益显著。

1.1鉴别中的应用在HPLC法中,保留时间与组分的结构

和性质有关,是定性的参数之一,可用于药物的鉴别。

如5中

国药典6收载的头孢羟氨苄的鉴别项下规定:

在含量测定项下

记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的

保留时间一致。

通常药典在用HPLC法进行含量测定的同时

也以此法进行鉴别[4]。

另外,中药的指纹图谱鉴别中HPLC

也有很好的表现,相关研究已有大量文献报道[5~9]。

高效液

相色谱-质谱联用（LC-MS）技术成功地结合了色谱技术的

高分离能力与质谱技术的解析能力,已经广泛应用于药品定

性研究领域。

5美国药典6（31）中,加压素（Vasopressin）的鉴

别采用了该技术,通过对比供试品与对照品的离子峰质荷比

的一致性,从而达到鉴别的目的,方法专属性强。

1.2有关物质检查中的应用药品检验中需对某些药品的

有关物质含量进行控制。

药品的质量不仅与药品主成分的含

量有关,还与药品中除主成分之外的其他成分有关,杂质的存

在与多少对药品的安全性影响至关重要。

在药品质量标准的

制定中,有关物质检查项是重要的组成部分。

因HPLC法具有

简便、快捷、专属、准确等优势,其已成为检测有关物质的主流

方法,

5中国药典62010年版（二部）,有关物质检查广泛采用了

HPLC法进行测定,由2005年版的142个增加至707个。

2005

年版（二部）乳糖酸红霉素中有关物质的检查采用TLC法,操

作复杂,重现性差,2010年版改用HPLC法,不仅较好地解决

了薄层色谱法检验中虽能检出杂质斑点,但无法准确定量的

问题,而且同时可以准确定量红霉素A、B、C组分及其有关物

质。

1.3含量测定中的应用HPLC法具有分辩率高、分析速度

快,重复性好、样品用量低、自动化程度高等优点,在定量测定

时极具优势,5中国药典62010年版（二部）含量测定采用高效

液相色谱法的标准由2005年版的359个增加至694个,其中

大部分是反相色谱,也有吸附色谱、离子交换色谱等。

5美国

药典6第19版（1975年）首次收载HPLC作为法定分析方法时

只有六个项目,第20版收载了80项,第21版增至418项,

第22版增至1441项,目前收载的项目已超过2000项。

1995年版5中国药典6中诺氟沙星胶囊的含量测定用非水滴

定法,检验中发现,用该方法检验合格的样品,用HPLC法复检

时含量仅20%~30%,经调查系造假所致,所以自2000年版

改用HPLC法后,杜绝了该违法行为,HPLC具有准确定量、同

时定性的优势。

1.4中药成分检验中药是一个多成分的复杂体系,通过各

成分之间的配伍组合,达到最佳治疗效果。

由于成分多样和

复杂,成分分析较为困难。

HPLC法可以将各成分或待测成

分与其他杂质进行有效的分离,达到进行鉴别、检查、含量测

定的目的。

近几年,HPLC法在中药检验中,应用越来越广泛,

5中国药典62010年版（一部）收载的含量测定方法以HPLC

法为主。

HPLC法作为现代药物分析中最高效、快捷的方法之

一,在中药检验领域的广泛应用大大促进了中药质量的标准

化与规范化的进程。

1.5手性药物分析由于药物对映体的物理化学性质相同,

常规HPLC方法分离它们比较困难,如大多数氨基酸都有右

旋体和左旋体,但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物

（消旋体）。

手性药物往往具有一种对映体具有强的生物活性

和药效,而另一种却无效甚至有毒性的现象。

近年来,手性药

物的拆分定量分析、深入研究的报道亦明显增多。

手性色谱法有间接法和直接法。

直接法不需要作衍生化

反应,直接利用手性色谱柱或手性流动相进行分离。

间接法

为手性固定相引入不对称（即手性）环境,使欲拆分的对映体__（样品）、手性作用物（比如固定相）和手性源形成一个非对映

异构分子的络合物。

常用的手性固定相有以下几种:

¹Pirkle

型手性固定相,由美国学者Pirkle主持研制的,在分离的过程

中,化合物与固定相之间发生P-P电荷转移相互作用,此类

固定相为电荷转移型手性固定相;º蛋白质类手性固定相,蛋

白质是由手性亚基团氨基酸组成的大分子物质,蛋白质类手

性固定相是将蛋白质通过氨基酸键合到硅胶上而制成;»多

糖类手性固定相,如环糊精,可根据分子中葡萄糖单元的个数

不同分为A、B、C三类,分别由6、7、8个D-吡喃葡萄糖组成,

将环糊精分别通过硅烷链连接在硅胶表面构成手性固定相;

¼冠醚类手性固定相等。

手性流动相可分为¹配体交换型手

性添加剂,由手性配基和含二价金属离子的盐组成。

手性配

基多为具有光学活性的氨基酸及其衍生物,他们和二价金属

离子螯合,分布于流动相中,遇到待分离的对映异构体时,即

形成配合物,再在流动相和固定相之间分配而实现分离;º环

糊精添加剂;»手性离子对添加剂,如（+）10-樟脑磺酸、奎

宁等。

2HPLC新技术及其应用

2.1高效液相色谱-质谱联用技术（LC-MS,简称为液-质

联用技术）液-质联用技术将色谱技术的高分离能力与质

谱技术的高灵敏和结构解析能力成功结合,成为应用广泛的

分离检测技术。

液-质联用技术目前已广泛应用于药物鉴

定、中药化学成分分析、有关物质定性研究、药物代谢研究等

领域。

近年来,关于中药中非法添加化学药品检验方法的研

究逐步增多,已有薄层色谱法、高效液相色谱法、检测试剂盒、

气-质联用、液-质联用等方法应用的实例。

其中,液-质联

用方法被公认为筛选速度快、准确性高的方法。

到目前为止,

国家食品药品监督管理局颁布的6类检测中成药中非法添加

化学药品的补充检验方法,采用的均是液-质联用方法。

目

前,已有大量相关研究的文献报道[10~14],其中董宇[10]等建立

了采用液相色谱-离子阱质谱联用法检测中药降糖制剂中非

法掺入的苯乙双胍和格列本脲的专属性方法。

通过与对照品

的色谱及质谱行为对照比较,确定了非法掺入的化学成分。

结果4种中药降糖制剂中,确定了2种被掺有苯乙双胍和格

列本脲,1种掺有格列本脲。

该方法专属性强,灵敏度高,成为

打击非法中药降糖制剂的有效方法。

胡青等[11]建立了液相-

离子阱质谱联用法检测抗高血压类中药及保健品中15种非

法掺加化学药品的专属性方法。

通过与标准谱库中保留时间

和多级质谱图的双重对比,对样品中非法掺加的化学药品进

行定性鉴别。

2.2高效液相色谱-蒸发光检测技术（HPLC-ELSD）5中

国药典62010年版中,蒸发光散射检测器（ELSD）作为除紫外

检测器（UVD）使用频率最高的检测器,获得推广应用。

UVD

因其高灵敏度和稳定性,在药品检验中广泛应用,但它所能检

测的物质必须具有紫外吸收,而相应的流动相在检测条件下

则应无吸收。

该特性限制了其检测范围和一些溶剂的使用。

示差折光检测器（RID）是一种通用的检测器,它基于色谱柱流

出物光折射率的变化来连续测定样品浓度,但对工作环境要

求苛刻,要求恒温、恒流速,且无法采用梯度洗脱,其检测灵敏

度也不够高。

ELSD的出现,在一定程度上弥补了传统检测器

的不足,特别是对无紫外或紫外末端吸收的某些有机化合物

的检测,显示出极大的优越性[15]。

ELSD是一种通用型检测

器,几乎对所有不挥发性溶质均有响应。

灵敏度高,检出限达

到10ng,不受溶剂成分及温度波动的影响,可用于梯度洗脱,

目前已广泛应用于药品检验。

ELSD在5中国药典62010年版

中主要应用于UVD不适用的品种,如妥布霉素、小诺霉素、西

索米星等化药品种以及黄芪、银杏叶等中药品种。

相关文献

报道很多[16~27]。

虽然ELSD在方法的重现性、稳定性、精密

度等方面目前还达不到UVD水平,但仍可以视为UVD的有力

补充。

2.3快速高效液相色谱技术（UPLC/RRLC/UFLC）近年来,

快速高效液相色谱技术的发展与应用有效的弥补了传统高效

液相色谱技术在分析中的不足,使药物分析进入了高效、高通

量的阶段。

该技术的主要特色是通过优化色谱分离参数,增

加柱效,同时使分析时间大为缩短,节省溶剂,减少污染。

与

传统HPLC相比,UPLC/RRLC/UFLC解决了系统整体的耐压

问题,具有极高的柱效,带来了超高速度、超高分离度、超高灵

敏度等明显优势;不但节省溶剂,还是质谱分析的最佳入口,

与单级及串联四级杆质谱、TOF（飞行时间质谱）、Q-TOF（四

级杆飞行时间质谱）等的联用具有明显的优势[28~32]。

近年来,快速高效液相在化学药品分析、中药分析、药物

代谢研究等领域的实践应用表明,该技术相比于传统的HPLC

在分离度、柱效、以及分析时间方面均具有明显的优势[30~41]。

陈肖家等[42]分别用高效液相色谱（HPLC）、超高效液相色谱

（UPLC）、毛细管区带电泳（CZE）对淫羊藿中15种黄酮类成

分进行含量测定,并比较3种方法的分离情况、线性、灵敏度、

精密度、重复性、加样回收率和样品测定结果。

结果分析时间

依次为UPLC

且线性范围较窄;UPLC、CZE的灵敏度高于HPLC;3种方法的

精密度、重复性和加样回收率无显著性差异;样品的测定结果

HPLC与UPLC相近,CZE明显偏高。

研究结果证实UPLC在

精密度、准确性等方面与HPLC相近,但灵敏度大大高于

HPLC,且分析时间短,流动相消耗也较少。

刘颖等[37]建立一

种新颖的RRLC）MS/MS方法,无需母离子选择可同时获得

分子离子峰和碎片离子峰的二级质谱信息,此法用于中药的

复杂活性成分分析,快速、简便。

杨立伟等[43]建立了超高效液

相色谱（UPLC）法测定西洋参中主要人参皂苷成分含量的方

法,结果西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1在8min内得到完全

分离,UPLC法在不影响分离效果的情况下大大提高了人参皂

苷Rg1、Re、Rb1分析速度,同时减少了溶剂消耗。

该研究表明

UPLC法可作为传统HPLC法的一种更为高效、可行的替代方

法。

目前快速高效液相色谱技术还不能完全取代HPLC,但是

随着该色谱技术的发展及它所带来的显而易见的优势,今后

快速高效液相色谱技术在药品检验领域的应用将会更加广

泛。

3高效液相色谱法在食品分析中的应用

3.1在乳品分析中的应用

乳及乳制品的质量评价比较复杂，包括营养成分

及含量、乳品的风味物质、药物残留和毒物种类及含量

等多个方面，HPLC法可用于乳品中多种质量控制指

标的检测。

乳及乳制品中富含糖、脂、蛋白质、维生素等

营养以及强化的营养物质，HPLC技术几乎可用于各

种营养成分的检测。

在低分子糖类的测定中多采用氨

基键合柱、糖类分析专用柱进行分离，也有研究者利用

低成本非特定色谱柱测定低分子糖，如Mullin等[3]通过

树脂柱分离，脉冲安培检测器测定奶酪和牛奶中的乳

糖等并取得良好的效果。

在氨基酸的检测中，苗红等[4]

利用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸脂柱前

衍生氨基酸，Nova-PakC18色谱柱，乙腈磷酸缓冲液梯

度洗脱，紫外UV248nm检测，可同时准确测定奶粉中

Lys、Met、Asp等16种氨基酸。

丁晖等[5]用YWGC18色

谱柱，甲醇乙酸胺为流动相，紫外检测器230nm处测

定了AD奶和活性乳中的山梨酸和苯甲酸含量。

张春

燕等[6]采用ORH-801型有机酸专用色谱柱，以浓度

0.01mol/L硫酸溶液为流动相，用折光检测器对全脂奶

粉和酸奶中乳酸与乳酸盐进行测定，最低检测限可达

1.53×10-10kg。

随着分离柱的不断改进，高灵敏度的检

测仪器的引入，HPLC法已深入到乳品分析中的方方

面面。

相信在不久的将来HPLC法将在乳品工业中发

挥更大的作用。

3.2在肉制品分析中的应用

HPLC法可以测定肉制品中的兽药残留、致癌物

质含量等。

腌腊肉品中常添加硝酸盐或亚硝酸盐作发

色剂用，由于添加量过大或自身的还原作用在肉品中生成N-亚硝胺。

N-亚硝胺可诱发肝癌、结肠癌等。

过

去采用气相色谱法测定食物中挥发性亚硝胺，其中仅

色谱测定一步便需耗时1h之多，而采用高效液相色

谱法则只需要13min左右。

张辉[7]应用岛津LC-4A高

效液相色谱仪测定肉类抗生素残留量，对色谱分离实

验参数，包括色谱柱、流动相配比、缓冲液、pH、温度、

检测波长等，进行了系统的试验，使肉类食品中的四

环素、土霉素和金霉素能够同时分离和定量测定。

乔

坤云[8]建立了用HLPC测定鸡肝中土霉素、金霉素、四

环素方法。

中国农业大学动物医学院赵思俊等[9]通过研

究建立了同时检测动物肌肉组织中环丙沙星、单诺沙

星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、恶喹酸、氟甲喹7

种喹诺酮类药物的HPLC-FLD检测方法。

河南农业大

学牧医工程学院张素梅等[10]建立了牛肉中替米考星残

留的HPLC检测方法,结果可靠。

3.3在其它食品分析中的应用

HPLC可以广泛地用于检测食品的农药残留，食品

中过量的食品添加剂，食品中违禁成分；也可用于食品

中营养成分的分析。

沈向红等[11]建立了用HPLC测定保

健食品中人参皂甙的方法。

彭锦峰[12]建立了用高效液相

色谱测定食用香菇中甲醛的方法。

许龙福[13]建立了用

HPLC同时测定饮料中对羟基苯甲酸乙（丙）酯及咖啡因

的方法。

王帆等[14]建立了保健食品中大豆异黄酮的高效

液相色谱检测方法。

叶赛等[15]应用高效液相色谱-串联

质谱法测定海水中的氯霉素残留量,流动相为V（甲醇）

∶V（水）=80∶20。

樊金玲等[16]利用高效液相色谱与质谱联

用技术研究了牡丹花中的花色苷类化合物，分离检测了

5种花色苷，结合紫外吸收光谱和质谱信息分别确定了

具体类型。

广东省深圳市疾病预防控制中心仲岳桐等[17]

建立了应用高效液相色谱-质谱联用技术测定蛋类食

品及蛋制品中的苏丹红四号的方法，测定结果准确。

国

家大豆深加工技术研究推广中心李丹等[18]利用高效液

相色谱电喷雾质谱联机技术准确的分析了黑豆中异黄

酮的种类和含量。

HPLC可测定氨基甲酸酯农药、有机

磷农药、百草枯、杀草快、草甘膦及氨基膦酸、苯并咪唑

类杀菌剂、利谷隆（linuron）、灭草隆（monuron）及敌草隆

（diuron）、三嗪类农药等。

苯并咪唑类杀菌剂残留的多残

留分析亦可采用HPLC方法。

韩灏等[19]建立了高效液

相色谱法测定饮料类食品中的类雌激素的方法。

4高效液相色谱在中药指纹图谱的应用

　　李菁等[13]采用HPLC测定七叶皂苷钠，并用蒸发光检测器（ELSD）检测，得到HPLC-ELSD指纹图谱。

对不同注射用七叶皂苷钠样品的比较研究表明，HPLC-ELSD指纹图谱准确的显示了样品的质量，结果直观、可靠。

周玉新等[14]以HPLC梯度洗脱法对三七原药材、三七总皂苷提取物及以三七总皂苷为原料制成的市售注射液进行了指纹图谱研究。

该方法可操作性强、重现性好，可作为三七药材及含三七主成分注射剂指纹图谱研究的基础的色谱指纹图谱。

颜玉贞等[15]用优化的高效液相色谱试验条件，梯度洗脱，紫外检测，测定并记录色谱图，进行辨认、分析，所获得的色谱指纹图谱具有良好的重现性，可以明确鉴别西青果和诃子。

从指纹图谱追踪初步证明试验所用的所有西青果是大诃子的幼果。

杨光明等[16]对川芎药材进行指纹图谱研究，对来源于不同地区的川芎进行了比较。

采用KromasilKRl005C18分析柱，0.5％H3PO4-H2O与0.5％H3PO4-CH3OH梯度洗脱，流速1mL/min，柱温25℃，DAD检测器，检测波长280nm，参比波长360nm.确定了川芎药材指纹图谱的高效液相分析条件，建立了川芎的特征指纹图谱。

游松等[17]以芦丁为内标物，采用HPLC法分析银杏黄酮苷。

结果表明银杏叶药材、中间体及注射剂的指纹图谱有较好的相关性，所有共有峰的参数符合国家药品监督管理局关于有关中药注射剂的技术要求，有助于银杏叶药材的标准化种植及其制剂的质量控制。

刘艳华等[18]采用高效液相色谱法建立丹参药材的指纹图谱，以AlltechC18（4.6mm×250mm，5μm）为色谱柱，1％冰醋酸水溶液和1％冰醋酸甲醇溶液采用梯度洗脱，流速1.0mL／min，检测波长281nm.结果显示精密度和重复性试验中各共有峰相对峰面积的RSD均小于5％，符合有关规定，该方法可作为控制丹参药材内在质量的标准。

邹忠梅等[19]研究芍药总苷的高效液相色谱指纹图谱，为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。

他们利用HPLC-DAD方法，梯度洗脱，测定了10批芍药总苷样品。

色谱条件为：

SupelcosilTMLCl8分析柱（5μm，150mm×4.6mm），柱温25℃，流动相A为乙腈，流动相B为水（磷酸调pH为3.0），流动相A梯度洗脱（10％～45％乙腈），分析时间为50min，时间为0、5、25、27、38、40、50min，A（％）为10、15、18、30、35、40.结果表明芍药总苷的指纹图谱特征性及专属性强，可结合含量测定用于全面控制芍药总苷的质量，确保每批产品的均一性。

沈嘉等[20]以HPLC指纹图谱区分不同工艺、不同原料制备的黄连解毒汤（黄连、黄芩、黄柏、栀子）制品及日本汉方黄连解毒汤制剂。

采用C18V反相色谱柱，二元梯度洗脱，二极管阵列检测器，以芍药苷为内标作为相对标准。

结果共有15～16个特征峰为共有峰，但新工艺制品和醇提物出现1个独特的特征峰，与其它制品不同。

各不同工艺及原料制品的特征峰与内标峰的峰高比有显著性区别。

试验结果稳定，重复性良好，作者认为HPLC指纹谱可作为本复方中药不同工艺及原料制品的鉴别标准。

刘艳娥等[21]采用高效液相色谱梯度洗脱法，选用ZorbaXSB-C18（5μm，4.6mm×250mm）色谱柱，流动相：

（A）甲醇-0.05％磷酸溶液（10∶90），（B）甲醇-0.05％磷酸溶液（60∶40）梯度洗脱，检测波长为238nm，采用线性梯度洗脱程序。

流速：

1mL/min，运行时间60min.结果确定了金银花药材有11个共有峰，该方法可靠，为提高金银花药材质量控制标准提供参考。

陈闽军等[22]用高效液相色谱法测定参麦注射液中人参皂苷Rg1和Rb1的含量，并用所检测到的指纹图谱考察参麦注射液不同批次产品内在质量的一致性。

实验采用汉邦C18（5μm，250mm×4.6mm）色谱柱，流动相A为50mmol/LKH2PO4溶液，B为乙腈-水（80∶20），pH=3.5梯度洗脱，流速1mL/min，检测波长为202nm，柱温为40℃。

结果人参皂苷Rg1和Rb1的加样回收率>99％，RSD<1.2％，人参皂苷Rg1和Rb1分别在4.20～42.0μg和3.30～33.0μg范围内线性关系良好，色谱指纹图谱中分离出30多个峰。

实验表明将指标性成分人参皂苷Rg1和Rb1的含量测定与色谱指纹图谱比较分析相结合，可提高参麦注射液的内在质量控制水平。

马仁玲等[23]对苦参药材用不同提取方法进行化学成分分析，采用高效液相色谱／电喷雾离子化质谱联用技术对苦参药材不同的提取方法进行研究，结果表明氯仿-浓氨溶液提取法、火溶液提取法、水-甲醇溶液提取法获取生物碱和黄酮依次为9、8和12种。

该试验首次采用LC／ESI／MS联用技术对苦参药材的提取方法进行了研究，为中药苦参指纹图谱的建立提供了依据。

曹敏等[24]采用高效液相色谱法建立栀子药材的指纹图谱，以AlltechC18（250mm×46mm，5μm）为色谱柱，采用水和甲醇溶液梯度洗脱，流速10mL/min，检测波长440nm.结果精密度和重复性试验中对峰面积大于20％的共有峰，其相对峰面积的RSD均小于5％，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》中有关规定，本方法可作为控制栀子药材内在质量的标准。

　　中药各组分在色谱图上的色谱行为可用于中药品种的鉴定和质量控制。

HPLC法具有流动相选择性广、重现性好、色谱柱可反复使用，实际证明实用的检测器品种较多、需要时各组分收集容易等优点。

就目前的普遍性来说，是所有的光谱、色谱中最基本、最适合绘制指纹图谱、用途最广的一种方法。

结合数学统计手段以及计算机模拟的方法学研究，将中药体系的内涵进一步标示、定性和量化，得到相对完备的指纹性数据。

而联用技术是目前最受重视的手段，HPLC/MS、HPLC/UV、HPLC/NMR、HPLC/MS/MS等联用技术给中药这一复杂未知样品的分析带来了崭新的前景，为中药全组分的分析提供了大量的信息，也必将用于指纹图谱的建立。

5总结

高效液相色谱法是吸纳了经典液相色谱法和气相

色谱法的优点进行改进和发展起来的现代分析方法，

具有分离速度快，测效率高，重现性好的特点。

近年在

食品，分析上应用后，扩大了检测范围，提高了分析水

平，尤其对食品