手把手教你做PCR引物设计来自小木虫.docx

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手把手教你做PCR引物设计来自小木虫

PCR引物设计的黄金法例

1.引物最幸亏模板cDNA的守旧区内设计。

DNA序列的守旧区是经过物种间相像序列的比较确立的。

在NCBI上

搜寻不一样物种的同一基因，经过序列剖析软件（比方DNAman）比对

（Alignment），各基因同样的序列就是该基因的守旧区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不该大于38，由于过长会致使其延长温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反响。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好靠近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引起反响。

上下游引物

的GC含量不可以相差太大。

此外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在必定盐浓度条件下，50%

寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）预计引物的Tm值，则有效引物的

Tm为55~80℃，其Tm值最好靠近72℃以使复性条件最正确。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码地区，引物3′端不要停止于密码子的第3位，因密码子

的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不可以选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不一样碱基引起效率存在着很大的差别，当末位的

碱基为A时，即便在错配的状况下，也能有引起链的合成，而当末位

链为T时，错配的引起效率大大降低，G、C错配的引起效率介于A、

T之间，所以3′端最好选择T。

6.碱基要随机散布。

引物序列在模板内应当没有相像性较高，特别是3’端相像性较高的序列，不然简单致使错误引起（Falsepriming）。

降低引物与模板相像性的一种方法是，引物中四种碱基的散布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

特别3′端不该超出3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引起。

7.引物自己及引物之间不该存在互补序列。

引物自己不该存在互补序列，不然引物自己会折叠成发夹构造

（Hairpin）使引物自己复性。

这类二级构造会因空间位阻而影响引

物与模板的复性联合。

引物自己不可以有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不该拥有互补性，特别应防止3′端的互补重叠以防

止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。

引物之间不可以有连

续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹构造假如不行防止的话，应尽量使其△G值不要过

高（应小于）。

不然易致使产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反响不可以正常进行。

8.引物5′端和中间△G值应当相对较高，而3′端△G值较低。

△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反应了双链构造内部碱基对的相对稳固性，△G值越大，则双链越稳固。

应入采用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超出9）的引物。

引物3′端的△G值过高，简单在错配位点形成双链构造并引起DNA聚合反响。

（不一样地点的△G值能够用Oligo6软件进行剖析）

9.引物的5′端能够修饰，而3′端不行修饰。

引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

所以，能够被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包含：

加酶切位点；标志生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质联合

DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列

等。

引物的延长是从3′端开始的，不可以进行任何修饰。

3′端也不可以有形成任何二级构造可能。

10.扩增产物的单链不可以形成二级构造。

某些引物无效的主要原由是扩增产物单链二级构造的影响，选择扩增

片段时最好避开二级构造地区。

用相关软件（比方RNAstructure）

能够展望预计mRNA的稳固二级构造，有助于选择模板。

实验表示，

待扩地区自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增常常不可以成功。

若不可以避开这一地区时，用7-deaza-2′-脱氧GTP代替dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11.引物应拥有特异性。

引物设计达成此后，应付其进行BLAST检测。

假如与其余基因不拥有

互补性，就能够进行下一步的实验了。

POSTbyBingsenXu

序言：

我是刚才注册到，在PCR技术议论版看见置顶贴，“恳求援引物设计的战友先进来这里！

”略微阅读了一下，发现好多朋友

对PCR引物设计还不是很熟习，我愿意把自己累积的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完以后，能够不用再发求援贴而是自己着手做引物设计或许引物查验。

开始以前：

其实特别简单，不需要你下载任何软件，可是你得有一台电脑能上网。

自然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的议论范围。

此外，要先对PCR目的序列的长度有个大概预计，好了，立刻开始吧：

第一步：

找到Primer3的站点。

你不用记着这个站点，可是要记着

“Primer3”个，而后翻开GOOGLE首，入Primer3，跳出来

的第一个目就是了“

（primer3-web/htdocs/input-040.htm）”网址是

。

第二步：

上模板序列。

入Primer3站点，能够看到一个引物

的界面。

（附件Word文档里有）在“Pastesourcesequencebelow

（5'->3'⋯..”下边的大空框里面把你的模板序列粘帖去。

注意是

5'->3'方向的，数字或许空格都没关系，件会自的。

第三步：

重要参数定。

第一是“ProductSizeRanges”，假如你不希望件你随意做的，第一要整的就是个参数。

默的参数上是从100到1000，个你得自己改，假如你希望物的大小切合你的期，尽可能把范改小，比方480-500，详细看状况整。

第二个参数是“PrimerSize”，默一般能够用，可是，当你用熟了个件，你自己就知道怎么改了。

第三个参数是”PrimerTm”个和PrimerSize差不多。

第四步：

Pickprimers：

点一下个按，切合你大小期的primer就出来了，看看Primer3Output的界面，多么美丽！

你要的primer出来了，并且有primer在序列上的地点比，有primer自己的信息，包含地点，度，Tm，GC含量，任何地点互碱基数，3'端互碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），有物大小，两引物随意互碱基数，两引物3'端互碱基数等。

假如引物尚在参数定的范内，但不是最正确，将会出警示。

比方（随意举例，自己在做一个超长引物）：

WARNING:

Leftprimerisunacceptable:

High3'stabilityOLIGOstartlentmgc%any3'seq

TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC

AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT

SEQUENCESIZE:

1388

INCLUDEDREGIONSIZE:

1388

第五步：

引物设计查验：

能够只是设计一直引物，只需在Pickleft

primer或许Pickrightprimer前面的勾勾掉一个就能够。

也能够

自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍旧

是5'->3'）假如切合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给

出警示信息，依据警示信息能够适合对自定义引物做些调整即可，警示信息也让你做实验的时候成竹在胸。

关于文件发布的引物，最好都

要检查一下，这样就能够防止被他人存心无心误导。

至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物越过内含子，这样防止潜伏DNA对RT-PCR

的扰乱。

实质做引物的时候，要把内含子都去掉，只是把外显子序列放入源序列框中，并且经过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别所有或许部分落在不一样外显子上。

至于怎样迅速辨别内含子和外显子以及电子PCR，我将抽闲另做说明。

至于设计出来的引物的实质成效，依据我的经验，一般状况下都能做

到PCR一次成功，或许随意那一段序列做引物也能达到很好的成效，

可是不论怎么说，软件做引物能够让自己成竹在胸。

最后，GOODLUCKTOEVERYONE.

手把手教你在线做PCR引物设计

POSTbyBingsenXu

序言：

我是刚才注册到，在PCR技术议论版看见置顶贴，“恳求援引物设计的战友先进来这里！

”略微阅读了一下，发现好多朋友对PCR引物设计还不是很熟习，我愿意把自己累积的一点引物设计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完以后，能够不用再发求援贴而是自己着手做引物设计或许引物查验。

开始以前：

其实特别简单，不需要你下载任何软件，可是你得有一台电脑能上网。

自然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的议论范围。

此外，要先对PCR目的序列的长度有个大概预计，好了，立刻开始吧：

第一步：

找到Primer3的站点。

你不用记着这个站点，可是要记着“Primer3”这个词，而后翻开GOOGLE首页，输入Primer3，跳出来的第一个项目就是了“

（primer3-web/htdocs/input-040.htm）”网址是

。

第二步：

上模板序列。

入Primer3站点，能够看到一个引物

的界面。

（附件Word文档里有）在“Pastesourcesequence

below（5'->3'⋯..”下边的大空框里面把你的模板序列粘帖去。

注意是5'->3'方向的，数字或许空格都没关系，件会自的。

第三步：

重要参数定。

第一是“ProductSizeRanges”，假如

你不希望件你随意做的，第一要整的就是个参数。

默的

参数上是从100到1000，个你得自己改，假如你希望物的

大小切合你的期，尽可能把范改小，比方480-500，详细看状况

整。

第二个参数是“PrimerSize”，默一般能够用，可是，当

你用熟了个件，你自己就知道怎么改了。

第三个参数

是”PrimerTm”个和PrimerSize差不多。

第四步：

Pickprimers：

点一下个按，切合你大小期的

primer就出来了，看看Primer3Output的界面，多么美丽！

你要的primer出来了，并且有primer在序列上的地点比，要primer自己的信息，包含地点，度，Tm，GC含量，任何地点互碱基数，

3'端互碱基数，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），

要物大小，两引物随意互碱基数，两引物3'端互碱基数

等。

假如引物尚在参数定的范内，但不是最正确，将会出警示。

比方（随意例，自己在做一个超引物）：

WARNING:

Leftprimerisunacceptable:

High3'stability

OLIGOstartlentmgc%any3'seq

LEFTPRIMER

TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC

RIGHTPRIMER

AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT

SEQUENCESIZE:

1388

INCLUDEDREGIONSIZE:

1388

第五步：

引物设计查验：

能够只是设计一直引物，只需在

Pickleftprimer或许Pickrightprimer前面的勾勾掉一个就能够。

也能够自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍旧是5'->3'）假如切合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警示信息，依据警示信息能够适合对自定义引物做些调整即可，警示信息也让你做实验的时候成竹在胸。

关于文件发布的引物，最好都要检查一下，这样就能够防止被他人存心无心误导。

至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物越过内含子，这样防止潜

在DNA对RT-PCR的扰乱。

实质做引物的时候，要把内含子都去掉，只是把外显子序列放入源序列框中，并且经过自定义引物设计的方

法，使上下游引物分别所有或许部分落在不一样外显子上。

至于怎样迅速辨别内含子和外显子以及电子PCR，我将抽闲另做说明。

至于设计出来的引物的实质成效，依据我的经验，一般状况下都能做到PCR一次成功，或许随意那一段序列做引物也能达到很好的效

果，可是不论怎么说，软件做引物能够让自己成竹在胸。

最后，GOOD

LUCKTOEVERYONE.