手把手教你做PCR引物设计来自小木虫.docx

1、手把手教你做PCR引物设计来自小木虫PCR引物设计的黄金法例1.引物最幸亏模板 cDNA的守旧区内设计。DNA序列的守旧区是经过物种间相像序列的比较确立的。在 NCBI上搜寻不一样物种的同一基因，经过序列剖析软件（比方 DNAman）比对（Alignment ），各基因同样的序列就是该基因的守旧区。2.引物长度一般在 1530 碱基之间。引物长度（ primer length ）常用的是 18-27 bp，但不该大于 38，由于过长会致使其延长温度大于 74，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反响。3.引物 GC含量在 40%60%之间， Tm值最好靠近 72。GC含量（ compositio

2、n ）过高或过低都不利于引起反响。上下游引物的 GC含量不可以相差太大。此外，上下游引物的 Tm值（ melting temperature ）是寡核苷酸的解链温度，即在必定盐浓度条件下， 50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tm值 510。若按公式 Tm= 4（G+C）+2（A+T）预计引物的 Tm值，则有效引物的Tm为 5580，其 Tm值最好靠近 72以使复性条件最正确。4.引物 3端要避开密码子的第 3 位。如扩增编码地区，引物 3端不要停止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物 3端不可以选择 A，最好选择 T。引物

3、 3端错配时，不一样碱基引起效率存在着很大的差别，当末位的碱基为 A 时，即便在错配的状况下，也能有引起链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引起效率大大降低， G、C错配的引起效率介于 A、T 之间，所以 3端最好选择 T。6.碱基要随机散布。引物序列在模板内应当没有相像性较高，特别是 3端相像性较高的序列，不然简单致使错误引起（ False priming ）。降低引物与模板相像性的一种方法是， 引物中四种碱基的散布最好是随机的， 不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。特别 3端不该超出 3 个连续的 G或 C，因这样会使引物在 GC富集序列区错误引起。7.引物自己及引物之间不该存在互补序列。引物自

4、己不该存在互补序列，不然引物自己会折叠成发夹构造（Hairpin ）使引物自己复性。这类二级构造会因空间位阻而影响引物与模板的复性联合。引物自己不可以有连续 4 个碱基的互补。两引物之间也不该拥有互补性，特别应防止 3 端的互补重叠以防止引物二聚体（ Dimer 与 Cross dimer ）的形成。引物之间不可以有连续 4 个碱基的互补。引物二聚体及发夹构造假如不行防止的话，应尽量使其 G值不要过高（应小于）。不然易致使产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反响不可以正常进行。8.引物 5 端和中间 G值应当相对较高，而 3 端 G值较低。G值是指 DNA 双链形成所需的自由能

5、， 它反应了双链构造内部碱基对的相对稳固性， G值越大，则双链越稳固。应入采用 5 端和中间 G值相对较高，而 3 端 G值较低（绝对值不超出 9）的引物。引物 3 端的 G 值过高，简单在错配位点形成双链构造并引起 DNA 聚合反响。（不一样地点的 G值能够用 Oligo 6 软件进行剖析）9.引物的 5端能够修饰，而 3端不行修饰。引物的 5 端决定着 PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。所以，能够被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5 端修饰包含：加酶切位点；标志生物素、荧光、地高辛、 Eu3+等；引入蛋白质联合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的

6、延长是从 3 端开始的，不可以进行任何修饰。 3 端也不可以有形成任何二级构造可能。10.扩增产物的单链不可以形成二级构造。某些引物无效的主要原由是扩增产物单链二级构造的影响， 选择扩增片段时最好避开二级构造地区。用相关软件（比方 RNAstructure ）能够展望预计 mRNA的稳固二级构造，有助于选择模板。实验表示，待扩地区自由能 （ G）小于 58.6l kJ/mol 时，扩增常常不可以成功。若不可以避开这一地区时，用 7-deaza- 2- 脱氧 GTP代替 dGTP对扩增的成功是有帮助的。11.引物应拥有特异性。引物设计达成此后， 应付其进行 BLAST检测。假如与其余基因不拥有互

7、补性，就能够进行下一步的实验了。POST by Bingsen Xu序言：我是刚才注册到，在 PCR技术议论版看见置顶贴，“恳求援引物设计的战友先进来这里！ ”略微阅读了一下， 发现好多朋友对 PCR引物设计还不是很熟习， 我愿意把自己累积的一点引物设计方面的经验和大家分享， 希望不会做引物设计的朋友看完以后， 能够不用再发求援贴而是自己着手做引物设计或许引物查验。开始以前：其实特别简单， 不需要你下载任何软件，可是你得有一台电脑能上网。自然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的议论范围。此外，要先对 PCR目的序列的长度有个大概预计，好了，立刻开始吧：第

8、一步：找到 Primer3 的站点。你不用记着这个站点，可是要记着“Primer3 ” 个 ，而后翻开 GOOGLE首 ， 入 Primer3 ，跳出来的第一个 目就是了“(primer3-web/htdocs/input- 040.htm) ”网址是 。第二步： 上模板序列。 入 Primer3 站点，能够看到一个引物 的界面。（附件 Word文档里有 ）在“ Paste source sequence below(5- 3 . ”下边的大空框里面把你的模板序列粘帖 去。注意是5-3 方向的，数字或许空格都没关系， 件会自 的。第三步：重要参数 定。第一是“ Product Size Ran

9、ges ”，假如你不希望 件 你随意做的 ， 第一要 整的就是 个参数。 默 的参数 上是从 100 到 1000， 个你得自己改，假如你希望 物的大小切合你的 期，尽可能把范 改小，比方 480-500，详细看状况 整。第二个参数是“ Primer Size ”，默 一般能够用，可是，当你用熟了 个 件，你自己就知道 怎么改了。第三个参数是” Primer Tm ” 个和 Primer Size 差不多。第四步：Pick primers ： 点一下 个按 ，切合你大小 期的 primer 就出来了，看看 Primer3 Output 的界面，多么美丽！你要的 primer 出来了，并且有 p

10、rimer 在序列上的地点比 ， 有 primer 自己的信息，包含地点， 度， Tm，GC含量，任何地点互 碱基数， 3 端互 碱基数，以及引物序列， （注意，下游引物是 5-3 ）， 有 物大小，两引物 随意互 碱基数，两引物 3 端互 碱基数等。假如引物尚在参数 定的范 内，但 不是最正确，将会 出警示。比方（随意举例，自己在做一个超长引物） ：WARNING: Left primer is unacceptable: High 3 stability OLIGO start len tm gc% any 3 seqTAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCAAA

11、GGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCE SIZE: 1388INCLUDED REGION SIZE: 1388第五步：引物设计查验：能够只是设计一直引物，只需在 Pick leftprimer 或许 Pick right primer 前面的勾勾掉一个就能够。也能够自己定义引物，放在 Primer 框里，（注意，下游引物的书写反向仍旧是 5-3 ）假如切合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警示信息，依据警示信息能够适合对自定义引物做些调整即可， 警示信息也让你做实验的时候成竹在胸。 关于文件发布的引物， 最好都要检查一下，这样就能够防止被他人存

12、心无心误导。至于 RT-PCR所用的引物，最好是使得产物越过内含子， 这样防止潜伏 DNA对 RT-PCR的扰乱。实质做引物的时候，要把内含子都去掉，只是把外显子序列放入源序列框中， 并且经过自定义引物设计的方法， 使上下游引物分别所有或许部分落在不一样外显子上。 至于怎样迅速辨别内含子和外显子以及电子 PCR，我将抽闲另做说明。至于设计出来的引物的实质成效， 依据我的经验， 一般状况下都能做到 PCR一次成功，或许随意那一段序列做引物也能达到很好的成效，可是不论怎么说， 软件做引物能够让自己成竹在胸。 最后，GOODLUCK TO EVERYONE.手把手教你在线做 PCR引物设计POST

13、by Bingsen Xu序言：我是刚才注册到，在 PCR技术议论版看见置顶贴，“恳求援引物设计的战友先进来这里！ ”略微阅读了一下，发现好多朋友对 PCR引物设计还不是很熟习， 我愿意把自己累积的一点引物设计方面的经验和大家分享， 希望不会做引物设计的朋友看完以后， 能够不用再发求援贴而是自己着手做引物设计或许引物查验。开始以前：其实特别简单，不需要你下载任何软件，可是你得有一台电脑能上网。自然，最重要的是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的议论范围。此外，要先对PCR目的序列的长度有个大概预计，好了，立刻开始吧：第一步：找到 Primer3 的站点。你不用记着这

14、个站点， 可是要记着“Primer3 ”这个词，而后翻开 GOOGLE首页，输入 Primer3 ，跳出来的第一个项目就是了“(primer3-web/htdocs/input-040.htm) ”网址是 。第二步： 上模板序列。 入 Primer3 站点，能够看到一个引物 的界面。（附件 Word文档里有 ）在“ Paste source sequencebelow (5- 3 . ”下边的大空框里面把你的模板序列粘帖 去。注意是 5-3 方向的，数字或许空格都没关系， 件会自 的。第三步：重要参数 定。 第一是“ Product Size Ranges”，假如你不希望 件 你随意做的 ，

15、第一要 整的就是 个参数。 默 的参数 上是从 100 到 1000， 个你得自己改，假如你希望 物的大小切合你的 期，尽可能把范 改小，比方 480-500，详细看状况 整。第二个参数是“ Primer Size ”，默 一般能够用，可是，当你用熟了 个 件，你自己就知道 怎么改了。第三个参数是” Primer Tm ” 个和 Primer Size 差不多。第四步： Pick primers ： 点一下 个按 ，切合你大小 期的primer 就出来了，看看 Primer3 Output 的界面，多么美丽！你要的 primer 出来了，并且有 primer 在序列上的地点比 ， 要 prim

16、er 自己的信息，包含地点， 度， Tm，GC含量，任何地点互 碱基数，3 端互 碱基数，以及引物序列， （注意，下游引物是 5-3 ）， 要 物大小，两引物 随意互 碱基数，两引物 3 端互 碱基数等。假如引物尚在参数 定的范 内， 但 不是最正确，将会 出警示。比方（随意 例，自己在做一个超 引物） ：WARNING: Left primer is unacceptable: High 3 stabilityOLIGO start len tm gc% any 3 seqLEFT PRIMERTAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHT PRIMERAAAG

17、GGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCE SIZE: 1388INCLUDED REGION SIZE: 1388第五步：引物设计查验： 能够只是设计一直引物，只需在Pick left primer 或许 Pick right primer 前面的勾勾掉一个就能够。也能够自己定义引物，放在 Primer 框里，（注意，下游引物的书写反向仍旧是 5-3 ）假如切合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警示信息， 依据警示信息能够适合对自定义引物做些调整即可，警示信息也让你做实验的时候成竹在胸。 关于文件发布的引物，最好都要检查一下，这样就能够防止被他人存心无心误导。至于 RT-PCR所用的引物，最好是使得产物越过内含子，这样防止潜在 DNA对 RT-PCR的扰乱。实质做引物的时候，要把内含子都去掉，只是把外显子序列放入源序列框中，并且经过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别所有或许部分落在不一样外显子上。 至于怎样迅速辨别内含子和外显子以及电子 PCR，我将抽闲另做说明。至于设计出来的引物的实质成效， 依据我的经验， 一般状况下都能做到 PCR一次成功，或许随意那一段序列做引物也能达到很好的效果，可是不论怎么说，软件做引物能够让自己成竹在胸。最后， GOODLUCK TO EVERYONE.