体外诊断试剂注册申报资料模板主要生产工艺和反应体系研究.docx

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体外诊断试剂注册申报资料模板主要生产工艺和反应体系研究

XXXXX检测试剂盒

（XXXXX法）

主要生产工艺及反应体系的研究资料

XXXXX有限公司

一、主要生产工艺的优化

（一）文库接头的配制研究

二、反应体系的研究

（一）样本的采集及处理

本试剂盒的检测对象为福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）的非小细胞肺癌（NSCLC）组织样本，必须按照标准的病理学方法进行处理和保存，以确保样本的质量，且采样不超过？

年。

用于提取的总核酸的组织标本中肿瘤细胞含量应达20%以上。

所有样本均视为有潜在感染性的物品，操作时按国家相关标准执行。

-70℃冷冻样本，解冻后石蜡包埋：

手术后直接石蜡包埋后常温保存：

（二）核酸片段化和补平反应体系研究

1.试验目的

比较核酸片段化试剂和补平加尾试剂分开加入和同时加入的差异。

2.检测对象

片段化缓冲液、片段化酶、连接缓冲液、连接酶1。

3.主要仪器

PCR仪、2100生物分析仪、荧光PCR仪、磁力架、移液器。

4.样本及来源

（细胞系或者临床样本均可）

5.研究方法

使用核酸提取试剂对样本核酸进行提取，以其为模板分别进行片段化处理和补平加尾处理。

其中，片段化处理分别设5分钟和10分钟反应时间，另外设片段化和补平、加尾步骤合并和分开加两类，两个变量两两组合。

产物经Agilent2100生物分析仪分析。

分段化处理设三个反应时间：

5分钟、10分钟、15分钟，另外设片段化和补平、加尾步骤合并和分开加两类，两个变量两两组合。

产物建库，考察文库产量，以不作FC处理作为对照。

6.试验结果

6.12100分析结果

Agilent2100分析结果如图06-2-1至06-2-4所示。

四组产物2100分析结果显示，。

6.2文库定量结果

六组处理的的文库定量结果如表6-2-1所示。

表6-2-1不同FB、FC处理条件的文库定量结果

反应过程

文库浓度（nM）

37℃/0m

+72℃/15m

37℃/5m

+72℃/15m

37℃/10m

+72℃/15m

37℃/15m

+72℃/15m

FB、FC分开

FB、FC合并

文库定量结果显示。

7.实验结论

由以上两组试验结果可知。

为确保各类核酸样本都能得到较好的片段化，选择。

（三）逆转录反应体系的研究

1.试验目的

设置不同的逆转录酶和RNA抑制剂的加入量，筛选出经济、高效的逆转录反应条件。

2.主要仪器

PCR仪（Veriti96-wellThermalCycler）、荧光PCR仪（QuantStudio3Real-TimePCRSystem）、磁力架、移液器。

3.试剂

40U/µLRNA抑制剂（Enzymatics），200U/µL逆转录酶（EnzScript,Enzymatics）。

4.实验样本

（细胞系或者临床样本均可）

5.研究方法

以9份核酸为模板建库，在19uL逆转录反应体系中分别设置3种逆转录酶和RNA抑制剂加入量，具体加入量如下表：

逆转录酶

RNA抑制剂

实验组1

100U

20U

实验组2

200U

40U

实验组3

400U

80U

分析文库产量及测序后RNA质控结果。

6.研究结果

6.1三组试验的文库产量如表1所示。

表1.文库产量比较

序号

样本

100倍稀释的文库浓度（pM）

实验组1

实验组2

实验组3

1

2

3

4

5

6

7

8

9

从表1所示，当逆转录酶和RNA抑制剂的加入量为100U和20U时，有两个样本文库产量较低（100倍稀释液浓度＜1pM）。

另外两组试验结果均符合要求。

6.2三组试验的文库测序分析质控分析如表2所示。

表2.文库测序分析质控结果

序号

样本

RNA/DNA值

实验组1

实验组2

实验组3

1

2

3

4

5

6

7

8

9

从表2所示，当逆转录酶和RNA抑制剂用量为100U和20U时，有3个样本文库RNA质控结果不合格（RNAreads/DNAreads值＜0.3）。

当逆转录酶和RNA抑制剂用量为200U和40U、400U和80U时，9个样本文库RNA质控均合格（RNAreads/DNAreads值≥0.3）。

7.实验结论

由以上研究结果可知，。

（四）接头融化方式研究

1.试验目的

设置不同的接头融化条件，筛选出适合接头融化条件。

2.主要仪器

PCR仪（Veriti96-wellThermalCycler）、荧光PCR仪（QuantStudio3Real-TimePCRSystem）、磁力架、移液器。

3.实验样本

（细胞系或者临床样本均可）

4.研究方法

以SW480核酸（DNA50ng）为模板建库，设置3种不同的接头融化方式：

a.冰上融化；b.手捂热融化；c.37℃融化。

分析文库产量。

5.研究结果

接头不同融化方式对产量的影响测试结果如表1，接头不同融化方式所构文库产量均符合建库要求（100倍稀释液浓度≥1pM）。

表1接头不同融化方式对产量的影响测试结果

接头

文库浓度（pM,100倍稀释液）

冰上融化

手捂热融化

37℃融化

6.实验结论

三种不同接头融化方式对文库产量影响不大，考虑到核酸在低温条件下稳定性较好，建议冰上融化接头。

（五）连接酶的研究

1.试验目的

在连接过程中设置不同的连接酶使用量，选出经济、高效的连接反应条件。

2.主要仪器

PCR仪、荧光PCR仪、磁力架、移液器。

3.试剂

T4DNALigase。

。

。

。

4.实验样本

（细胞系或者临床样本均可）

5.研究方法

以8份核酸为模板建库，21ul连接反应体系中设置3种核酸连接酶加入量：

①连接体系中加入60U连接酶；②连接体系中加入120U连接酶；③连接体系中加入240U连接酶。

分析文库产量。

6.研究结果

3组试验的文库产量如表1所示。

当连接过程中加入60U、120U和240U核酸连接酶时，三组试验结果均符合要求。

表13种不同用量核酸连接酶文库产量比较

序号

样本

100倍稀释的文库浓度（pM）

DNA核酸连接酶

60U

120U

240U

1

2

3

4

5

6

7

8

7.实验结论

由以上研究结果可知，。

（六）扩增反应体系的研究

1.试验目的

设置不同的PCR1延伸温度、延伸时间和PCR2循环数，筛选出快速、高特异性的PCRs反应条件。

2.主要仪器

PCR仪（Veriti96-wellThermalCycler）、荧光PCR仪（QuantStudio3Real-TimePCRSystem）、磁力架、移液器。

3.实验样本

（细胞系或者临床样本均可）

4.研究方法

试验一：

PCR2循环次数研究，以SW480核酸为模板建库，分别设置15cycles、18cycles、21cycles、24cycles四组试验，每组重复两次。

分析文库产量。

试验二：

PCR1延伸温度研究，以SW480核酸为模板建库，分别设置60℃、63℃、65℃、67℃四组延伸温度，每组重复三次。

分析文库产量。

试验三：

PCR1延伸时间研究，以SW480核酸为模板建库，在试验一得到的PCR1延伸温度基础上，设置PCR13min、5min、7min、10min四组延伸时间，每组重复三次。

分析文库产量及测序后OnTarget值。

5.研究结果

PCR2循环数的优化结果如表6-3-1，

表6-3-1PCR2循环次数优化结果

序号

文库

Adaptor

PCR1

P7标签

PCR2

PCR2循环数

100倍稀释文库的浓度pM

1

2

3

4

5

6

7

8

四组试验的文库产量随PCR2循环数的增加而增加，当PCR2达到15cycles时，文库产量已满足测序要求。

结合以往的实验结果，设置PCR2循环数≥16cycles作为反应条件。

PCR1延伸温度优化结果如表6-3-2所示。

表6-3-2PCR1延伸温度优化结果

序号

文库编号

Adapter

Index

PCR1

PCR2

100倍稀释文库的浓度pM

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

四组不同PCR1延伸温度实验所建文库产量有较大差异，随温度降低，产量明显增加。

暂选产量最高60℃作为PCR1备选温度。

在此基础上，对PCR1延伸温度作进一步研究。

PCR1延伸时间优化的结果如表6-3-3。

表6-3-3PCR1延伸时间优化结果

序号　

文库编号

Adapter

Index

PCR1

PCR2

100倍稀释文库浓度pM

OnTarget值%

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

四组不同PCR1延伸时间所建的文库的OnTarget值无明显差异，但文库产量有较大变动，随延伸时间的延长，产量呈明显增加趋势。

以产量最高的条件，即延伸时长10min作为PCR1反应条件。

6.实验结论

由以上研究结果，确定延伸温度？

？

℃，延伸时间？

？

min，转速？

？

C/s，反应循环数≥？

？

cycles作为PCR1反应条件。

三、质控方法

（一）阴阳性对照品（每次检测质控方法）

为评价每次试验结果的有效性和一致性建立了阴阳对照品，每次试验均需检测。

每次试验应同时满足阴性对照品检出为阴性和阳性对照品检出为阳性，否则试验结果视为无效。

（二）企业参考品盘（试剂盒质量质控方法）

建立企业参考品盘用以评价成品性能和保证质量。

该企业参考品盘包括n份企业阳性参考品，1份企业阴性参考品，n份企业最低检测限参考品。

需满足以下条件：

1.检测企业阳性参考品P1-Pn，结果应为相应的基因突变型。

2.检测企业阴性参考品N，结果应为未检出相应的基因突变型.

3.检测企业检测限参考品L1-Ln，结果应为相应的基因突变型。

4.使用经标化的企业阳性参考品P1，重复检测10次，结果应为相应的基因突变型。

使用经标化的企业阴性参考品N，重复检测10次，结果应为未检出相应的基因突变型。

四、生产工艺性能考核

按照优化好的生产工艺及反应体系，检测企业参考品盘，考核生产工艺性能，检测结果表明符合要求。

表1试剂盒的性能考核

阳性参考品符合率

阴性参考品符合率

最低检出限

重复性

企业参考品

P1~Pn

N

L1~Ln

P1、N

检测结果

100%

100%

均正确检出阳性

均正确检出

五、反应体系（检测流程）

（可将说明书中检测流程完整搬过来。

）

六、主要生产工艺小结

原料

配制

分装

贴签

XX缓冲液

XX酶

FE酶

PCR反应液

无核酸酶水

TEL缓冲液

纯化磁珠

文库接头

文库标签

阴性对照品

阳性对照品

七、生产工艺流程图

（将生产工艺流程图复制过来）