蔬菜中亚硝酸盐含量测定.docx

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蔬菜中亚硝酸盐含量测定

常州工程职业技术学院

毕业设计报告（论文）

（2009届）

系  别：

   制药与生物工程技术系   

课题名称：

  蔬菜中的亚硝酸盐含量测定   

指导教师：

班  级：

学生姓名：

摘要

近几年来我国人口中患消化系统癌症的人数明显增多，根据学者的研究发现，造成这种现象的原因与我国人口摄入过多的硝酸盐和亚硝酸盐是分不开的。

工业、农业的发展和生活燃烧导致了地区和全球氮循环的混乱,亚硝酸盐的渗透还引起地下水污染,威胁着人类的健康。

尤其是化学氮肥的广泛使用，蔬菜中的硝酸盐残留量过高。

人体持续摄入少量的硝酸盐会引起消化不良、精神抑郁和头痛,当摄入0.3-0.5g亚硝酸盐即可引起中毒,3克可致死。

另外亚硝酸盐能够透过胎盘进入胎儿体内,人体血液中亚硝酸钠浓度为0.4mg/kg～200mg/kg时会产生毒性,孕妇食用过量的亚硝酸钠可导致胎儿畸形,特别是六个月以内的婴儿。

联合国粮农组织和世界卫生组织规定硝酸盐和亚硝酸盐的每日允许摄入量：

KNO3或NaNO30.5mg/kg，KNO2或NaNO20.2mg/kg。

为了更加健康的饮食习惯，本文开始研究蔬菜中的亚硝酸盐含量。

针对亚硝酸盐的测定，本文借鉴前人的经验设计出一套合理可行的分光光度法测定蔬菜中亚硝酸盐的方案，该方案的线性范围为0mg/L～0.3mg/L，线性相关系数r=0.999x，检出限为0.14mg/kg，回收率为94.61%～104%的亚硝酸钠含量。

分别测出芹菜、西红柿、大蒜在常规条件下的亚硝酸盐含量，分别对这三种蔬菜在不同浸泡时间、不同煮沸时间及不同放置时间下的亚硝酸盐含量进行检测。

不难发现减少亚硝酸盐的摄入，科学的蔬菜处理法是要浸泡至少20min，煮蔬菜时尽量减少煮沸的时间，煮熟的蔬菜隔夜的不宜食用。

另外还可以从该实验中看出叶菜类蔬菜中含有的亚硝酸盐含量要高于茄果类蔬菜和鳞茎类蔬菜。

关键词：

分光光度法 蔬菜 亚硝酸盐 探究

Abstract

InrecentyearsChina'spopulationwiththedigestivesysteminthenumberofcancersignificantlyincreased,accordingtotheresearchofthefind,causethereasonsofthisphenomenonandourcountrypopulationexcessiveintakeofnitrateandnitriteisnotdivided.Industry,thedevelopmentofagricultureandlifeburningledtoregionalandglobalnitrogencycleofchaos,thepenetrationofnitritealsocausedagroundwaterpollution,threateninghumanhealth.Especiallythewidespreaduseofchemicalfertilizer,thevegetablesnitrateresiduesweretoohigh.

Thehumanbodyforasmallamountofnitrateintakecausesindigestion,depressionandheadaches,whenintake0.30.5gnitritecancausepoisoning,3gcanbedeadly.Anothernitritecanpassthroughtheplacentatothefetus,thehumanbodybloodsodiumnitrateconcentrationsincentralAsiafor0.4mg/kgto200mg/kgcanproducethetoxicity,thepregnantwomaneattoomuchandsodiumnitratecancauseoffetalabnormalities,especiallywithinsixmonthsofthebaby.TheUnitedNationsfoodandagricultureorganization（fao）andtheworldhealthorganizationprovisionsofnitrateandnitriteallowedperdayintake:

easierorNaNO30.5mg/kg,KNO2orNaNO20.2mg/kg.

Inordertomorehealthyeatinghabits,thispaperstudiesthevegetablesstartednitritecontent.Accordingtothedeterminationofnitrite,takinginthepreviousexperiencedesignafeasiblespectrophotometryvegetablesofnitratecentralAsiaplanwhichlinearrangeof0mg/L~0.3mg/L,linearcorrelationcoefficientr=0.999x,detectionlimitfor0.14mg/kg,therecoveryis94.61%~104%andsodiumnitratecontent.Measuredrespectively,tomatoes,garlicceleryunderroutineconditionsofthecontentofnitrite,respectively,onthethreevegetablesindifferentsoakingtime,differentboiltimeandplaceunderdifferenttimeofnitritecontentfortesting.Itisnotdifficulttofindthatreducetheintakeofnitrite,scientificvegetablesprocessingmethodistosoakatleast20min,boiledvegetablesreduceasfaraspossiblewhenboilingtime,cookedvegetablesofovernightunfittoeat.Itwasalsofromthisexperimentthatleafvegetablescontainnitritebio-controltechnologylevelsthanvegetablesandbulbvegetables.

Keywords:

spectrophotometry vegetables nitrite explored

第一章 前言  1

1.1 概述  1

1.2 课题研究的意义  1

第二章 方案设计  3

2.1 方案原理  3

2.2 实验条件探究  3

2.3 实验部分  4

第三章 实验结果与讨论  6

3.1 最大吸收波长的测定  6

3.2 标准曲线的绘制  6

3.3 如何消除抗坏血酸对实验的影响  7

3.4 实验的选择  8

3.5 芹菜、西红柿及大蒜各阶段中的亚硝酸盐含量  9

3.6 用盐水浸泡蔬菜对亚硝酸盐含量的影响  13

3.7 回收率的测定  14

3.8 精密度的测定  15

第四章 实验结论  16

辞谢  17

参考文献  18

附录  19

第一章前言

1.1 概述

亚硝酸盐是广泛存在于自然环境中的化学物质,特别是在食物中。

自然界中很多食物,包括粮食、蔬菜、鱼类、蛋类、肉类中,都含有亚硝酸盐。

蔬菜是一种易于富集硝酸盐的作物,尤其是叶类蔬菜,人体摄入的硝酸盐有81.2%来源于蔬菜。

硝酸盐、亚硝酸盐含量超标已成为影响蔬菜品质的一个重要因素。

关于亚硝酸盐的含量测定问题，前人已经研究出许多的方法，比如利用酚二磺酸法测亚硝酸盐、比色法测亚硝酸盐、α-萘胺法、亚硝酸盐与番红形成重盐（引起橘红色溶液在酸性介质中变成蓝色）、返滴定法测亚硝酸盐、甲基紫褪色分光光度法测测腌制品中亚硝酸盐、高锰酸根褪色法测亚硝酸盐等。

参考很多前辈研究出的蔬菜中亚硝酸盐含量检测的方法以及亚硝酸盐在各种蔬菜中亚硝酸盐的含量情况，我们设计出属于我们自己的一套检测方法，来探究不同条件下以芹菜、西红柿、大蒜为例的叶菜类、茄果类和鳞茎类蔬菜中的亚硝酸盐含量，以及如何处理减少蔬菜中的亚硝酸盐含量来方便人们健康食用。

1.2 课题研究的意义

亚硝酸盐的测定方法较多，在众多的分析方法中，以分光光度法为基础的测定方法，使用得最为广泛，分析亚硝酸盐时，硝酸盐对测定产生较强的干扰；催化动力学法，虽然灵敏度较高，但精密度差，分析条件要求苛刻；采用重氮化偶合法，测定亚硝酸盐时，新鲜蔬菜和瓜果中含有的色素及抗坏血酸等有机物会对亚硝酸盐的提取及测定造成严重的干扰，本文以传统的重氮化偶合法为基础，改进了样品预处理的方法，消除了抗坏血酸带来的干扰，提高了对亚硝酸盐测定的精确度，得到了满意的测定结果。

[9] 

本文对蔬菜中亚硝酸盐的来源、危害以及蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的累积机制、影响因素、控制措施等方面在文献调研的基础上进行了科学的阐述。

同时利用了重氮化偶合法主体针对常见的蔬菜在不同的贮存条件下，硝酸盐和亚硝酸盐的含量及转化关系作了对比实验研究，总结出它们的变化规律，从而为人类在日常生活中如何选择蔬菜、如何科学食用蔬菜、如何贮存蔬菜等方面提供了科学的依据。

通过正确的蔬菜处理方法，平时少食用硝酸盐和亚硝酸盐含量高的叶菜类蔬菜，如香菜、芥菜、芹菜等，多吃一些鳞茎类和茄果类蔬菜。

也可以从将蔬菜浸泡10min左右，煮沸时间要控制在5-10min以内，减少煮熟蔬菜的放置时间，隔夜菜不食用等方面减少亚硝酸盐的摄入量。

蔬菜亚硝酸盐含量的探究这个课题符合了当今社会的“绿色”主题，减少疾病的发生，有益于我们人类健康，有益于人类社会的发展。

第二章 方案设计

2.1 实验原理

亚硝酸盐采用重氮化偶合法测定，试样经沉淀蛋白质、除去脂肪及抗坏血酸后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。

2.2 实验条件探究

2.2.1最佳吸收波长的选择

针对亚硝酸盐的最大吸收波长，我们搜集了大量的文献，比如《亚硝酸盐硝酸盐含量测定GB5009.33-2010》中采用的是538nm为最佳吸收波长，《亚硝酸盐测定方法的比较与分析》中格里斯试剂比色法中采用的是550nm作为最佳吸收波长。

大多数文献都采用的是538nm，极少数的采用550nm。

而本实验的选择的关键还是在于自己的实验数据。

为了使标准液在测定过程中的吸光值在0.2-0.8之间，需通过多次的摸索在400-600nm波长之间每隔10nm改变一次波长来测定同一亚硝酸盐标准溶液的吸光度，所测得的吸光度有一个最大吸收峰，及最大吸收波长。

2.2.2如何消除抗坏血酸对实验的影响

新鲜蔬菜中含有一定量的抗坏血酸，而抗坏血酸对亚硝酸盐的测定具有一定的影响，如何消除其影响？

我们就想到了活性炭本身对抗坏血酸具有吸附作用而且对亚硝酸盐不会产生化学作用，因此初步判断活性炭可以消除抗坏血酸对亚硝酸盐含量测定产生的干扰。

参考《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》将蔬菜用去离子水洗净，晾干后，取可食部切碎混匀。

将切碎的样品用四分法取适量，用研钵制成匀浆备用。

称4g（精确至0.01g）制成匀浆的试样，置于50mL的烧杯中，加10mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70°C左右的水约50mL，将试样洗入100mL容量瓶，于70°C中加热45min，取出至冷水浴中冷却，并放置至室温。

在震荡上述提取液时，加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质，再加入1g活性炭以脱色和除去抗坏血酸。

加水定容至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上层清液用滤纸过滤，并弃去30mL初滤液，滤液备用。

吸取40mL上述滤液于50mL带塞比色管中，试样管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，放置3-5min，加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色皿，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度。

2.2.3提取温度和时间的选择

《新鲜蔬菜和水果中亚硝酸盐测定方案研究》[9]中的提取温度70°C和100°C，水浴时间15、30、45、60、75min来进行实验的。

以此为参考，我们将以亚硝酸盐含量较大的芥菜为样品简单处理后在70°C水中分别加热15min、30min、45min、60min、75min（100°C中加热15min、30min、45min、60min、75min），取出至冷水浴中冷却，并放置至室温。

按重氮化偶合法进行测定。

2.2.4显色时间的选择

显色时间的选择实验是控制其他的实验条件不变来改变显色时间，来看出到底在哪个时间下测出的亚硝酸盐含量才是最准确的。

参考《新鲜蔬菜和水果中亚硝酸盐测定方法研究》我们将显色时间改为5min、15min、30min、45min，在这四个时间点下分别按重氮化偶合法进行亚硝酸盐含量测定。

2.3 实验部分

2.3.1仪器

1、UV—7230可见分光光度计；2、石英比色皿（2cm）；3、电子天平（感量为0.1mg和1mg）；4、组织捣碎机；5、常用实验仪器

2.3.2 试剂及溶液配制

试剂均为分析纯，水均为去离子水。

1 试剂

亚铁氰化钾、乙酸锌、冰醋酸、硼酸钠、盐酸、氨水、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠

2 溶液配制[12]

（1）饱和硼砂溶液（50g/L）：

称取5.0g硼酸钠，溶于100mL热水中，冷却备用。

（2）亚铁氰化钾溶液（106g/L）：

称取106.0g亚铁氰化钾，用水溶解，并稀释至1000mL。

（3）乙酸锌溶液（220g/L）：

称220g乙酸锌，先加30mL乙酸溶解，用水稀释至1000mL。

（4）对氨基苯磺酸溶液（4g/L）：

称0.4g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%（V/V）盐酸中，混匀后，至棕色瓶中，避光保存。

（5）盐酸萘乙二胺溶液（2g/L）:

称取0.2g盐酸萘乙二胺，溶于100mL水中混匀后，至棕色瓶中，避光保存。

（6）亚硝酸钠标准溶液（100g/L）:

准确称取0.1000g亚硝酸钠，加水移入1000mL容量瓶，加水稀释至刻度，混匀。

（7）亚硝酸钠标准溶液（10g/L）：

临用前，吸取10mL亚硝酸盐标准溶液，置于100mL容量瓶，加水稀释至刻度。

2.3.3 分析步骤

1试样处理

将蔬菜用去离子水洗净，晾干后，取可食部切碎混匀。

将切碎的样品用四分法取适量，用研钵制成匀浆备用。

2提取

称4g（精确至0.01g）制成匀浆的试样，置于50mL的烧杯中，加10mL饱和硼砂溶液，搅拌均匀，以70°C左右的水约50mL，将试样洗入100mL容量瓶，于70°C中加热30min[3]，取出至冷水浴中冷却，并放置至室温。

3 提取液净化

在震荡上述提取液时，加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质，再加入1g活性炭以除去抗坏血酸。

加水定容至刻度，摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上层清液用滤纸过滤，并弃去30mL初滤液，滤液备用。

4 亚硝酸盐的测定

吸取40mL上述滤液于50mL带塞比色管中，试样管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，放置3-5min，加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min[9]，用2cm比色皿，以零管调节零点，于波长538nm[6]处测吸光度。

2.3.4计算公式

根据第一章中标准曲线的绘制，我们得到的线性方程y=1.4242x+0.084（后面实验得知），可以推算出求亚硝酸盐含量的公式为：

W：

蔬菜中亚硝酸盐含量，mg/Kg；

A：

试液的吸光度；

m：

所称样品的质量，g；

87.7686：

体积比换算出来的系数。

第三章实验结果与讨论

3.1 最大吸收波长的测定

为满足吸光值在0.2-0.8之间，本实验中配制了0.15ug/mL的亚硝酸盐标准溶液，按照重氮化偶合法的处理步骤，在400-590nm之间每隔10nm测定一次，得出最大吸收波长，实验数据如下所示：

表1 亚硝酸盐的最大吸收波长的测定

波长λ/nm

420

430

440

450

470

480

490

500

510

520

吸光度A

0.009

0.011

0.013

0.02

0.044

0.066

0.095

0.13

0.17

0.206

波长λ/nm

525

526

527

529

530

531

532

533

534

536

吸光度A

0.219

0.222

0.224

0.227

0.23

0.232

0.234

0.234

0.236

0.238

波长λ/nm

537

538

540

541

542

544

545

546

547

548

吸光度A

0.24

0.24

0.243

0.243

0.243

0.242

0.242

0.242

0.242

0.241

波长λ/nm

549

551

552

553

554

555

560

570

580

590

吸光度A

0.241

0.241

0.24

0.24

0.238

0.237

0.229

0.197

0.148

0.09S1

由以上数据，可知：

在537-553nm内，亚硝酸盐的吸光度处于平坦状态，比较难于选择。

在一般情况下，应选用最大吸收波长作为最佳测定波长。

在最大吸收波长附近波长的稍许偏移引起的吸光度的变化较小，可得到较好的测量精度，而且以最大吸收波长为入射光测定灵敏度较高。

但如果最大吸收波长附近存在干扰，则在保证有一定灵敏度的情况下，可以选择其他波长进行测定（应选曲线叫平坦处对应的波长），以消除干扰。

同时依据多数文献规定的分析线是538nm，那么就证明在538nm下测定的亚硝酸盐的含量较为准确，所以我们所选用的最佳吸收波长为538nm。

3.2 标准曲线的绘制

取0.00mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2.0mL亚硝酸钠标准使用液（10ug/mL），分别置于50mL带塞比色管中。

于标准管中分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，放置3-5min，加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色皿，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线。

实验数据如下图所示：

表2亚硝酸盐标准曲线

编号

1（空白）

2

3

4

5

移取V/mL

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

浓度/（ug/mL）

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

吸光度A

0.000

0.033

0.065

0.094

0.123

编号

6

7

8

9

10

11

12

移取V/mL

0.50

0.60

0.70

0.80

1.20

1.60

2.00

浓度/（ug/mL）

0.10

0.12

0.14

0.16

0.24

0.32

0.40

吸光度A

0.158

0.184

0.211

0.239

0.350

0.460

0.576

图1亚硝酸盐标准曲线

由以上结果，可知：

不同浓度亚硝酸盐在538nm处的吸光度是呈线性规律的，其线性方程是y=1.4242x+0.0084，又因为该组标准曲线的吸光度的相关性为0.9994,满足测定所需，因此该组数据可行。

3.3 如何消除除去抗坏血酸对实验的影响

分别称取两份4g样品（以芥菜为例），按照重氮化偶合法处理样品后，在538nm波长下进行测定。

测定得以下数据：

表3活性炭对实验的影响

编号

1（有活性炭）

2（无活性炭）

样品称重/g

4.0750

4.0797

吸光度A

0.162

0.047

亚硝酸盐含量/（mg/kg）

3.50

1.00

由以上结果，可以看出：

通过计算，样品中亚硝酸盐含量为3.50mg/kg、1.00mg/kg。

可以看出同样的条件下，测得的亚硝酸盐含量加入活性炭的样品中测出的亚硝酸盐含量远远高于未加入活性炭的样品中的亚硝酸盐含量，说明加入活性炭处理的样品已经消除了抗坏血酸对亚硝酸盐测定的干扰，使得亚硝酸盐测定的数据更为准确。

因此，样品处理时加入活性炭能使亚硝酸盐更好地提取出来，该方法不失为提取亚硝酸盐的最佳方法。

3.4 实验条件的选择

3.4.1提取温度和水浴时间的选择

分别称取10份样品（以芥菜为例），分别在70°C水中加热15min、30min、45min、60min、75min（100°C中加热15min、30min、45min、60min、75min），分别测出其亚硝酸盐的含量，其余的步骤不变。

得以下数据：

表4 提取温度和水浴时间对提取出的亚硝酸盐含量的影响

编号

1

2

3

4

5

水浴时间/min

15

30

45

60

75

100°C

样品称重/g

4.0746

4.0749

4.0759

4.0751

4.0739

吸光度A

0.100

0.089

0.111

0.108

0.095

含量/（mg/kg）

1.950

1.750

2.200

2.150

1.850

70°C

样品称重/g

4.0750

4.0732

4.0738

4.0716

4.0777

吸光度A

0.162

0.250

0.316

0.269

0.245

含量/（mg/kg）

3.37

5.22

6.5

5.5

5