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HE最终版

1.立项依据与研究内容

1.1假设的提出

Sathyasaikumar和Swapna曾用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）诱导的大鼠爆发性肝功能衰竭（Fulminanthepaticfailure，FHF）模型研究一种天然抗氧化剂-活化植性藻蓝素（C-Phycocyanin，C-PC）的保护作用。

FHF可以引起从精神恍惚到昏迷的一系列神经精神症状，氧化应激被认为在FHF的脑病理生理改变中扮演了一个很重要的角色，从而他们提出假设：

抗氧化剂可能在这个过程中保护脑。

于是两人24小时内两次向大鼠腹腔注射C-PC和TAA，第二次注射18小时之后处死动物,检测各种生化指标。

结果显示C-PC对脑有显著地保护作用，表现为大脑的不同区域星形胶质细胞的超微结构改变减少，大脑皮层、小脑、脑桥和延髓的组织病理学改变也减少，色氨酸和脂质过氧化标志物的水平降低，脑不同区域的过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活动水平上升。

综上他们认为C-PC可以通过提升抗氧化防御功能来改善肝性脑病（SathyasaikumarandSwapnaetal.2007）。

抗坏血酸（ascorbicacid，vitaminC）也是一种天然的抗氧化剂，它可以与氧负离子快速反应，还可以与羟自由基迅速反应生成抗坏血酸自由基。

它是血浆中最有效的抗氧化剂，是细胞外液抗氧化防御系统的第一道防线。

据此，我们不由地猜想抗坏血酸应该也可通过提升抗氧化防御功能来改善肝性脑病。

同时，大量实验数据表明，肝性脑病患者的脑脊液中超氧物歧化酶（SOD）异常增多，由于活性氧的异常增加，可导致病理性脂质过氧化反应增强。

活性氧通过对内皮细胞膜的脂质氧化作用来破坏血脑屏障（blood-brainbarrier，BBB）的结构和功能，使血脑屏障通透性增高，氨和其他毒性物质包括自由基大量入脑，损伤脑组织，从而促进或导致肝性脑病的发生。

据此，我们推测抗坏血酸可能是通过保护血脑屏障（BBB）免受被活性氧损伤而发挥作用的。

1.2研究背景

1.2.1HE的发病情况

肝性脑病（hepaticencephalopathy,HE）是各种肝病引起的，以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调的神经精神综合征。

狭义的HE是指门体分流性脑病（porto-systemicencephalopathy，PSE）。

HE的发病机制尚不清楚,可分为急性、慢性、复发性及亚临床或轻微肝性脑病（subclinicalhepaticencephalopathy，SHEorminimalhepaticencephalopathy,MHE），其发病率高，预后差。

10%－50%的肝硬化或行门体分流术的患者均会发生HE，1年生存率为40%，3年生存率为15%。

无论是急慢性HE，一旦进展到第Ⅳ期,死亡率高达80%[17]。

肝性脑病目前应用最广泛的分级标准是2001年美国胃肠病学会实践标准委员会发布的West-Haven标准：

0级肝性脑病：

意识、智力、个性、举止、神经肌肉均无明显改变。

1级肝性脑病：

失眠、嗜睡、睡眠倒错；计算能力下降，注意力下降；举止行为夸张，欣快或抑郁，易激动；震颤，共济失调，书写障碍。

2级肝性脑病：

反应慢，嗜睡，轻微定向力障碍；定时力障碍，计算能力显著下降，近事记忆力下降；个性、抑制力下降，个性明显改变，焦虑或淡漠；扑翼样震颤，言语不清，反射减退，共济失调。

3级肝性脑病：

昏睡；空间定向力障碍，完全遗忘，完全失去计算能力；行为举止怪异，情绪激动；Babinskin征（+），肌肉阵挛，僵直。

4级肝性脑病：

木僵，昏迷；无智力，不能辨认人；瞳孔放大，角弓反张。

HE中MHE处于0级，病人的精神和神经功能常规检查正常，而用严格的智力心理学测验或脑诱发电位检查则表现为异常。

它最容易发生，而且不易识别，易对社会造成危害。

美国肝硬化患者的MHE发病率高达60%－80%。

最近研究表明，通过神经电生理测试，发现在25%的急性重症病毒性肝炎患者中存在MHE，且MHE随着病毒性肝炎的恢复而自愈，而伴有门静脉高压患者患MHE的发病率还不清楚。

Elliott等人研究发现MHE在一些门静脉压力增高但无肝硬化的患者中也可发生，翟慧勤等人统计了不同地区和年份肝硬化患者并发MHE的情况，如下图[19]。

图-1不同地区和年份肝硬化患者并发MHE的情况

若MHE不予干预和治疗，最终有可能发展为症状性肝性脑病（overthepaticencephalopathy，OHE）。

有研究表明急性肝性脑病患者进行肝移植后1年的生存率仅42%，3年的死亡率高达77%，因此对肝病病人进行肝性脑病的预防对提高远期生存率和生活质量是很有必要的[19]。

1.2.2HE的社会影响

HE对认知功能的损伤也会对与健康状况相关的生活质量产生影响，表现为注意力、警觉性、控制力、操作等能力的障碍。

季芳等研究发现MHE患者有定向力、注意和计算力、回忆能力等能力的减退，而无记忆、常识或语言能力的减退。

Bajaj等的调查数据显示，在MHE患者中多达33%的患者在行车过程中发生过交通事故或者是违规，相比较而言，无MHE的患者只有4%会发生上述情况，即使是正在接受精神类药物治疗的患者也只有12%的患者会发生上述情况。

五年的调查数据显示患MHE的患者有53%的人可发生交通事故，而且这些患者在驾驶前均没有饮酒[19]。

1.2.3HE目前的预防和治疗

目前HE的治疗方法主要有去除上消化道出血等诱因；限制蛋白饮食，服用乳果糖等非吸收性的双糖，使用利福昔明等抗生素，服用益生菌等减少肠内毒物的生成和吸收；静脉注射L-鸟氨酸-L-门冬氨酸（LOLA），服用苯甲酸钠、口服或静脉输入支链氨基酸（BCAA）以促进有毒物质的代谢消除；以及应用一些作用于中枢神经系统的药物[17]。

对于HE的预防，Riggio等的随机对照试验（randomizedcontrolledtrial，RCT）结果显示，拉克替醇、利福昔明与空白对照组相比，在预防经颈静脉肝内门体分流术（transjugularintrahepaticportossteminshunt,TIPS）后1月内HE的发生率方面没有差异。

Rolachon等的研究显示甘露醇灌肠法预防HE有效，但基于目前有限的证据，临床上不推荐常规使用甘露糖灌肠，所以HE的预防主要是避免一切诱发因素。

总之，目前没有充分的证据证明哪一种药物能有效地预防或治疗HE，临床上采取的是结合个体化原则的综合疗法[17]。

本文研究假设的提出旨在为VITC预防HE的作用的大规模RCT实验提供理论基础。

从实用角度来看，VITC价格低廉，易于获取，普通瓶装的维生素C片,每片含量100mg,病人每天服用1-2粒药片即可，不会像其他的药物一样，给肝病病人造成经济负担。

与其他药物相比，VITC毒副作用极小，每天服用1-5g才会达到中毒剂量。

而且VITC是通过口服，方便无创，便于在基层推广使用。

1.3国内外研究背景

1.3.1国内VITC与HE有关的研究

VITC可改善肝功能的作用早已得到证实，张晓岚等使用的大剂量VITC（10g/d）疗法确有降酶、退黄、改善肝功能的作用，并且其机制与清除活性氧、抑制脂质过氧化有关[9]。

目前虽然没有大规模的RCT实验证明VITC对预防HE有作用，[1-3]但众多临床医生都会在临床实践中使用VITC作为辅助药物。

而且国际肝性脑病和氮质代谢学会（InternationalSocietyonHepaticEncephalopathyandNitrogenMetabolism，ISHEN）于第14届ISHEN会议公布了《2013肝硬化患者肝性脑病营养共识》，其中建议患者摄入VITC。

正是因为VITC在实际应用中发挥了作用，而人们对它作用的机理并没有确切的了解，我们提出的研究假设才显得有必要。

1.3.2国外VITC与HE有关的研究

Hernandez-GuerraM.等对VITC改善肝内皮细胞的功能，减弱餐后门脉压力的增加的效果进行了报道[10]。

MustafaHN等去年发表的研究结果称，维生素C和维生素E对硫代乙酰胺（TAA）诱发大鼠急性肝性脑病模型中的氧化应激和肝脑损伤有保护作用[11]。

OharaK等发现长时间暴露在氨环境下的星形胶质细胞，其胞外谷氨酸的水平会不断增加，推测由此导致的谷氨酸能神经元功能障碍是急性肝衰竭（ALF）患者出现精神障碍的发病机制之一，并证实使用VITC可以抑制胞外谷氨酸的增加[12]。

但目前国内外还没有人从VITC保护血脑屏障从而减轻HE发病程度的角度进行研究。

1.4理论基础

1.4.1VITC有强大的清除活性氧的能力

抗坏血酸可以很快地与氧负离子反应，更快地与羟自由基反应生成抗坏血酸自由基，因此抗坏血酸可以保护机体免受内源性活性氧的损伤。

更为重要的是，维生素C能与α-生育酚自由基相偶联，即水溶性的维生素C与苯并氢吡喃环伸向膜表面的膜中维生素E相偶联，使α-生育酚自由基还原成维生素E，间接地起着链阻断剂的作用。

Frei等用人血浆作为生理学模型系统研究了细胞外液的抗氧化保护作用。

发现只有在维生素C耗竭的时候，血浆中才可检测到磷脂、胆固醇和甘油三酯的氢过氧化物，并随着温育时间的延长，脂氢过氧化物含量不断增加，此时加入维生素C，则脂氢过氧化物的含量不再升高，说明维生素C对血浆中正在进行着的脂质过氧化作用也有阻断作用[13-15]，证明了维生素C是血浆中最有效的抗氧化剂，是细胞外液抗氧化防御系统的第一道防线。

故此，我们推测维生素C在保护血脑屏障免受自由基损害方面也起着重要作用[16]。

1.4.2活性氧和肝硬化相互促进

肝硬化主要的影响因素有代谢产物、细胞因子等，这些因素产生的影响均可从活性氧代谢失衡及其作用机制等方面进行阐述。

活性氧是具有不配对电子的原子、原子团、分子及离子，它参与多种生物活性物质的合成解毒反应、吞噬细胞杀灭细菌等过程，同时也可引起细胞膜脂质过氧化，改变酶的活性，损伤线粒体，攻击DNA，诱发基因突变等。

机体中也存在着抗氧化酶系统来消灭或转化活性氧从而保护机体，主要依赖于抗氧化酶。

现今我们所熟知的抗氧化酶主要有超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）,另外，谷胱甘肽、别嘌呤醇和维生素C、E等都具有清除或抑制活性氧的作用。

有研究表明,肝硬化患者由于自由基产生和清除之间的内稳机制失调，使其体内活性氧增多[6]。

增多的活性氧,通过细胞膜脂质过氧化作用进而改变膜的通透信和流动性，导致膜损伤，而使许多有害物质乘机透过细胞膜，发挥其毒性作用，还可介导炎症反应,可通过抑制肝细胞白蛋白合成等途径来加重肝细胞损伤[6]，进一步加重肝硬化,促进肝性脑病的发生。

1.4.3活性氧损害血脑屏障

血脑屏障（BBB）能够阻止某些物质由血液进入脑组织，可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。

中枢神经系统疾病等常引起血脑屏障结构和功能的剧烈变化，如新生儿核黄疸和血管性脑水肿，使脑毛细血管内皮细胞间紧密连接开放，屏障的通透性显著提高以致血浆白蛋白（分子量为69000）等大分子物质都可通过屏障。

在肝脏疾病的发生发展过程中，由于活性氧极为活跃，一旦形成，即可促使其中间产物不断产生新的活性氧，形成连锁反应。

活性氧可与各种细胞成分，如膜磷脂、蛋白质、核酸等发生反应，造成细胞结构和功能代谢损伤。

活性氧主要通过与膜脂质不饱和脂肪酸作用引发脂质过氧化反应，使膜的结构受到损失，功能发生障碍，使细胞膜及细胞器膜如线粒体膜等流动性降低和通透性升高。

肝硬化或肝性脑病的病理过程中，活性氧异常增加，在血脑屏障的内皮细胞膜上发生脂质氧化反应，造成内皮细胞的损伤，使血脑屏障出现通透性升高甚至破损，因而大量代谢毒物可乘机通过血脑屏障，对脑的代谢和功能造成损伤。

由此可见，活性氧量的异常增加能进一步加重肝硬化并诱发和促进肝性脑病的发生发展。

1.4.4毒素通过血脑屏障导致HE

肝性脑病的主要机制主要有氨中毒学说、假性神经递质学说、血浆氨基酸失衡学说、γ-氨基丁酸学说。

除以上学说外，研究表明许多蛋白质和脂肪代谢产物，如硫醇、短链脂肪酸、酚等对肝性脑病的发生发展也有一定的促进作用。

其中γ-氨基、硫醇、短链脂肪酸、酚丁酸等蛋白质和脂肪的代谢产物透过通透性已增高的血脑屏障进入脑内，从而在HE中对中枢神经系统产生损伤性的作用。

正常时，血脑屏障可保护脑环境不受血液成分变化的影响，但在血脑屏障受到活性氧破坏之后，苯乙醇胺，硫醇和酚等毒性物质可进入脑组织，从而干扰正常的神经兴奋传导，病人可出现意识和认知障碍，导致肝性脑病[20]。

1.4.5VITC目前的临床应用

抗坏血酸作为新陈代谢的必需物质，有极为重要的生理功能。

目前临床证实，VITC治疗多种急、慢性疾病均已取得良好效果，可用于辅助治疗小儿哮喘，可使血清脂质过氧化物（MDA）含量下降，红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性显著升高，可迅速有效地清除自由基。

此外，VITC还被用于抢救亚硝酸盐中毒、预防动脉硬化、辅助治疗新生儿缺氧缺血性脑病等方面[7-8]，这些疾病的发生都与活性氧的损伤有关。

据此，我们认为VITC在临床上预防[1-3]HE的发生发展方面也会有好的表现。

2项目目标、研究内容以及拟解决的关键科学问题

2.1研究目标

通过对在慢性肝硬化发展为肝性脑病过程中活性氧破坏血脑屏障从而影响毒性物质入脑机制以及抗坏血酸的抗氧化作用的研究，探索与肝性脑病发生发展的相关因素之一，为进一步在临床上用抗坏血酸预防肝性脑病提供理论和实践依据。

2.2研究内容

本课题用慢性肝硬化小鼠建立肝性脑病（hepaticencephalopathy，HE）的疾病模型进行研究。

在指标的选取方面，本文的基础假设是：

维生素C可以清除组织中的活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS），从而减少氧自由基对血脑屏障（blood–brainbarrier，BBB）的损伤，减少毒性物质入脑，进而达到预防HE发生的效果。

2.2.1慢性肝硬化模型的构建和肝性脑病的诱导

1）拟采用CCl4菜籽油溶液和不同浓度乙醇溶液构建肝硬化模型。

2）通过抽取慢性肝硬化小鼠腹水来诱发肝性脑病。

2.2.2VITC介导及肝性脑病相关症状反应和分子变化量检测

1）使用Micro-ESR---微型电子自旋共振波谱仪来检测活性氧的含量，操作简单易行。

2）依文思蓝等染料通过血脑屏障的量与血脑屏障通透性相关，通过染料依文思蓝入脑量反映血脑屏障的损伤程度。

3）肝性脑病的分级和游离色氨酸（FT）的含量及FT/TT的比值呈正相关，通过测量FT的含量及FT/TT的比值并辅以水迷宫和脑电图测试来反映肝性脑病的严重程度。

2.2.3相关数据判断及VITC预防效果分析

1）比对不同阶段小鼠造模情况数据记录表和治疗效果数据记录表。

2）综合各项测量指标分析VITC对肝性脑病的预防效果。

2.3拟解决的关键问题

1）小鼠慢性肝硬化导致的肝性脑病模型构建的最佳方案。

2）活性氧快速精密的检测。

3）血脑屏障通透性变化情况的准确判断。

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（1）33-36.

3、拟采取的研究方案及可行性分析

3.1研究方法

3.1.1实验分组

选取同批纯系昆明种（KM）雄性小鼠100只，为2月龄青年小鼠，体重20±2g，适应性喂养1周后，第2周开始实验[22]。

随机分配，选取80只小鼠进行慢性肝硬化模型的构建，从中选取40只小鼠作为实验组，对其进行维生素C干预处理；另外40只小鼠作为对照组，对其喂养等量的生理盐水；余下20只小鼠作为空白组。

（因考虑到造模过程中小鼠的死亡，实际实验时会增加10%的小鼠。

）

3.1.2KM小鼠慢性肝硬化模型的构建

表-1KM小鼠慢性肝硬化模型的构建

四氯化碳菜籽油溶液

饮用水

时间

1-2周

1-2周

3-4周

5-7周

空白组

0

等量生理盐水

等量生理盐水

等量生理盐水

对照组

0.2ml/（只次）2次/周

10%乙醇

20%乙醇

30%乙醇

实验组

0.2ml/（只次）2次/周

10%乙醇

20%乙醇

30%乙醇

具体操作如下：

采用背部皮下注射给药的方法，按0.2ml/只给予20%四氯化碳菜籽油溶液2周，每周给药2次，共计4次，同时以10%乙醇溶液为饮用水。

第3-4周改为20%乙醇溶液为饮用水，从第5周开始以30%乙醇溶液为饮用水，应用3周（乙醇溶液由市售品牌白酒加蒸馏水配制而成），共诱导7周。

三组小鼠均给予普通颗粒饲料喂养。

实验组和对照组小鼠给不同浓度的乙醇时，空白组给予等量的生理盐水。

3.1.3小鼠肝硬化模型检测

根据预备动物试验结果，并参照肝硬化大鼠模型分期，人为地将小鼠肝硬化模型病程分为3期:

早期（第4周末）急性肝坏死期，中期（第6周末）肝纤维化期，晚期（第7周末）假小叶形成期。

分别在第4、6、7周末随机抽取一只对照组及一只实验组动物处死解剖，测量每只小鼠体重、肝脏质量，计算脏器系数并做肝脏病理组织学检查[21]。

3.1.4用维生素C溶液灌胃

本实验用灌胃法对实验组小鼠在第二周起进行六周的维生素C干预，此方法能准确掌握给药量、给药时间、发现和记录出现症状时间和经过。

灌胃容积一般是0.1-0.2ml/10g，最大0.35ml/10g,每只小鼠的灌胃最大容积不超过0.8ml。

目前文献中的VITC用量有差异，因考虑到病患小鼠对VITC的需求量会增加，且小鼠体表面积相比体重的比值较大，代谢率较高，故我们选用每天给予8mgVITC[22-23]。

图-3小鼠灌胃

3.1.5诱发HE的方法

高蛋白饮食、消化道出血、细菌感染、便秘、利尿剂的使用不当、抽腹水、手术损伤、麻醉镇静药物等均可以诱发肝性脑病，综合考虑操作实施难易程度、效果是否明显、小鼠存活率等因素后，我们选用腹腔注射D-氨基半乳糖1700mg/kg体重（生理盐水配成10%，1NNaOH调至中性），空白组腹腔注射生理盐水2ml/只，实验过程中动物禁食，饮以10%葡萄糖水，之后进行HE发病的判断。

[24]

3.1.6水迷宫测试：

图-5水迷宫示意图

1）如图建立水迷宫；正式训练前将所有的动物放在梯子附件，让其自行爬上三次；

2）第1天训练，训练前，让动物自行爬梯一次。

将挡板置于A位置，动物在A点入水，放时将小鼠面向池壁。

训练时间定为120秒，如果在120秒内，动物未找到台阶，将动物置于台阶附近诱导其学习。

每天训练2次。

3）第2天训练，训练前，让动物自行爬梯一次。

将挡板置于B位置，动物在B点入水,其余同第1天训练内容。

4）第3天训练，训练前，让动物自行爬梯一次。

将挡板置于起点C位置，动物在起点C入水,其余同第1天训练内容。

5）第4天为实验测试，测试前，让动物自行爬梯一次。

将挡板置于起点C位置，动物在起点C入水，放时将小鼠面向池壁。

记录每只动物的游出时间（如果120秒内未上岸按120秒记录）及在游泳中进入盲端的次数，即错误次数。

6）测量完成所有实验组和对照组数据后，统计分析。

3.1.7脑电图测试:

小鼠以2%的戊巴比妥麻醉（2.3ml/kg.W），俯卧位固定，取两眼外眦与外耳门连线的前中1/3交点处作一连线，并于此连线中点旁开1mm处（相当于冠状缝后矢状缝旁开1mm）。

用自制的尖端有倒钩（防止脱落）的银电极刺入皮下，为作用电极；参比电极插在颈部皮下