南农选修课 动物克隆重点.docx

南农选修课 动物克隆重点.docx

《南农选修课 动物克隆重点.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《南农选修课 动物克隆重点.docx（30页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

南农选修课动物克隆重点

第一章绪论

一、生殖

1．概念：

生殖（繁殖）：

有生命的个体以某种方式繁衍与自己性状相似的后代来延续生命。

2.1无性繁殖

·自然界主要见于低等动物，无性繁殖的过程只牵涉一个个体，例如孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。

·动物克隆技术（细胞核移植技术）是人工的无性生殖

2.2有性生殖

·有性生殖是通过生殖细胞的生殖，生物的生活周期中包括二倍体时期与单倍体时期的交替。

·二倍体细胞借减数分裂产生单倍体细胞（雌雄配子或卵子和精子）；单倍体细胞通过受精（核融合）形成新的二倍体细胞。

·这种有配子融合过程的有性生殖称为融合生殖。

3.1种族延续

·生殖是一切生物体的基本特征之一

·肉、奶、蛋等畜产品的获得均需经过繁殖环节来实现。

二、克隆

·克隆是英文clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。

无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式。

·无性繁殖的过程只牵涉一个个体

·“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”（“无性繁殖系”），其遗传物质完全相同（同卵双胞胎）。

·动物克隆技术不需要雌雄交配,不需要精子和卵子的结合,具有与单细胞供体完全相同的特征,是其“复制品”。

·动物克隆技术的成功,可同当年原子弹的问世相提并论

·克隆技术在生命科学基础研究、人类医疗和畜牧业等领域潜力巨大

--畜牧业生产：

使优良牲畜品种的培育与繁殖发生根本性的变革，繁殖效率无限放大。

--基因治疗：

攻克癌症、艾滋病等顽疾

--技术平台：

·科学家把人工方法操作高等动物进行无性繁殖的过程叫克隆（细胞核移植），这门生物技术叫克隆技术。

·细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖就可被激活、分裂并发育成新的个体，使得核供体的基因得到完全复制。

三、动物克隆研究进展

四、克隆的用途

·后代与供体的遗传物质几乎完全一致

·日本和牛是当今世界公认的品质最优秀的良种肉牛

·ω－３脂肪酸是人们熟知的“鱼油”的主要成分。

·英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。

这种羊奶的售价是6千美元一升。

·治疗性克隆（胚胎干细胞+细胞核移植生产供人体移植的器官和细胞）

·生殖性克隆人它对家庭、夫妻关系、伦理道德的强烈冲击，担心克隆技术会危害人类

·人类将可能面临生育危机：

据WHO统计，大约每七对夫妇中就有一对存在着各种程度的生育障碍。

·人工辅助生殖技术：

试管婴儿和AI

·美国先进细胞技术公司的科学家们日前宣布，他们已在实验室中利用干细胞制造出人造血。

倘若这一研究成果能继续推广，人类将从此结束献血。

五、课程内容简介

·克隆（细胞核移植技术）是当今全球生物界研究的热点课题之一

·以通识教育和科普教育为宗旨

·人类和动物的自然生殖规律（生殖器官、受精与早期胚胎发育、妊娠、分娩、生殖健康与避孕）、人工辅助生殖技术（试管婴儿、人工授精）的基础上，重点介绍“克隆”这一前沿技术的发展历史与现状、原理与操作过程、存在的问题与今后的发展趋势、研究意义与对人类的挑战等内容。

·胚胎干细胞、转基因动物、胚胎分割、性别鉴定与性别控制等生命科学前沿技术

·以拓宽学生的知识面，有利于不同学科间的交叉和渗透，使学生对动物科学和人类生殖方面的前沿技术和研究热点有一个较全面、深入的了解。

·在动物出生前即用人工方法控制其性别，以改变后代的自然性别比例，进而按照人们的意愿进行特定性别的畜禽生产，显著提高畜牧业经济效益。

·可使受性别限制的生产性状（如泌乳性状）和受性别影响的生产性状（如肉用、毛用性状等）能获得更大的经济效益

·一头奶牛从出生到配种再到产奶一般需要26个月，

--品种改良：

提高单个奶牛产奶量

--性别控制：

以生产母牛犊谋利

·犹如原子能技术，是一把双刃剑。

第二章动物生殖规律

第一节雄性生殖

一、雄性生殖器官

组成：

睾丸、附睾、阴囊、输精管、副性腺、尿生殖道和阴茎等

性腺：

睾丸（形状），隐睾

1.1睾丸

精子生成：

生殖细胞经过四次有丝分裂和两次减数分裂形成精子细胞，每克睾丸组织的精子日产量随品种不同而异。

激素分泌：

位于精细管之间的间质细胞分泌雄激素。

维持性欲，促进精子生成。

1.2附睾：

精子成熟和贮存的场所

1.3副性腺：

包括精囊腺、前列腺、尿道球腺。

射精时其分泌物与输精管壶腹的分泌物混合形成精清，与精子共同组成精液。

二、精子的发生和成熟

精子（sperm）是睾丸分化出来的特殊细胞，雄性动物到一定年龄，睾丸在垂体分泌的促性腺激素的作用下分泌雄激素，使精子在睾丸中发生。

刚从睾丸释放出的精子没有运动和受精能力，需在附睾中，受附睾微环境的pH值、渗透压、离子、大分子物质的作用才逐步获得运动和受精能力。

雄性动物在初情期至性机能减退的整个生殖年龄中，可以全年或季节性地产生大量精子。

精子的发生过程中，精原细胞最终成为精子，完成染色体数目减半和细胞质及细胞核的变化，形成精子特有的形态与结构。

1、精子发生：

指精子在睾丸内产生的全过程，包括精细管上皮的生精细胞由精原细胞经过精母细胞到精子细胞（spennatids）的增殖发育过程和精子形成过程

2、精子发生的过程：

曲精细管内的生精细胞经过分化、分裂，经过精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞阶段，最终成熟为精子。

理论上1个精原细胞生成64个精子。

生成的精子进入附睾内贮存和成熟，在动物射精时，精子随精液射出。

·精子发生过程可分为三个阶段：

精原细胞增殖、精母细胞发育与成熟分裂、精子的形成。

·精子的形成是指精子细胞发生复杂的形态结构变化而演变为精子的过程。

·圆形精子细胞变形之后精子细胞成为蝌蚪样的精子。

这一形态变化过程主要涉及顶体的发生、核的浓缩拉长、尾的形成和多余细胞质的脱落等过程。

3、精液组成：

精液=精子+精清

精液的理化形状：

外观、气味、精液量、精子密度、pH值、渗透压、比重、粘度、导电性及光学特性。

4精液品质检查

·是为了鉴别精液质量的优劣。

评定的各项指标，既是确定精液取舍、新鲜精液进行稀释保存的依据，又能反映雄性动物饲养管理水平和其生殖器官的机能状态。

·因此，常用作诊断公畜不育或确定其种用价值的重要手段，同时也是衡量精液在稀释、保存和运输过程中的品质变化和处理效果的重要判断依据。

·精子活力：

指精液中呈前进运动的精子所占百分率，也称活率。

由于它与精子的受精能力直接相关，所以是评价精液品质的一个重要指标。

通常在采精后，精液处理前、后，冷冻精液解冻后和输精前进行检查

·精子顶体异常率：

精子顶体在受精过程中具有重要作用，一般认为只有呈前进运动、且顶体完整的精子才具有正常受精能力。

·密度

·精子畸形率（ASR）检查凡形态和结构不正常的精子通称为畸形精子。

在正常精液中也有一定比例的畸形精子，但一般不会超20%。

第二节雌性生殖

一、雌性生殖器官

·内生殖器官：

卵巢、输卵管、子宫、阴道，由阔韧带附着支持，上为直肠，下为膀胱。

·外阴部：

阴道前庭、阴门。

1、卵巢：

哺乳动物大都呈卵圆形，都成对存在（鸟类的一侧生殖器官退化）。

·卵巢为实质器官，实质为各级卵泡，包括原始卵泡、初级卵泡、生长卵泡和成熟卵泡。

·成熟卵泡排出卵细胞后，形成红体，随后形成黄体。

黄体退化后由结缔组织填充，而成为白体。

1.1卵泡发育和排卵

·成熟：

随着卵泡的发育，经过初级卵泡、次级卵泡、生长卵泡和成熟卵泡阶段，卵原细胞经过初级卵母细胞、次级卵母细胞，最终发育为卵子，由卵巢排出。

1.2激素分泌：

排卵后形成的黄体，由颗粒黄体细胞和内膜黄体细胞组成。

都能分泌孕激素。

维持妊娠

·月经周期：

在人类，青春期后，GnRH的分泌增加，FSH和LH分泌也随之增加，卵巢功能开始活跃，呈现周期性变化，表现为卵泡的生长发育、排卵与黄体形成，周而复始，在卵巢甾体激素周期性分泌的影响睛，子宫内膜发生周期性剥落，产生流血现象，称为月经，所以女性生殖周期称为月经周期。

·哺乳动物也有类似周期，称为发情周期。

·卵巢的周期性变化是月经周期形成的基础。

·习惯上将卵巢周期分为卵泡期与黄体期两个阶段。

2、输卵管：

漏斗部－－壶腹部－－峡部

·紧接漏斗的膨大部称输卵管壶腹，约占输卵管长的一半，是精子和卵子受精的部位。

2.2输卵管的功能：

1.运送卵子和精子2.精子的获能、卵子受精、受精卵卵裂3.分泌机能

3、子宫：

是胎儿生长发育和娩出的器官。

·子宫角－－子宫体－－子宫颈

二卵子发生

·卵子是受精的基础，作为配子的一方，在卵泡中逐渐发育成熟。

·精子：

提供遗传物质

·卵子：

提供遗传物质，提供支持早期胚胎发育的营养

1、卵子形态结构

·哺乳动物的卵子为圆球形，其直径大小因所含的卵黄量不同，变异范围较大，透明带内卵黄的直径为80－200um，为精子体积的1万倍。

·家畜卵的直径一般小于185um，牛为120－140um，绵羊140－185um，猪120－170um。

·雌性生殖细胞的分化\增殖\成熟全过程称为卵子发生。

·卵子发生起始于胚胎早期，由原始卵原细胞经过有丝分裂、减数分裂最后成为单倍体的卵细胞，持续时间很长，一般在初情期以后开始，至受精过程中才能完成。

2、卵子发生特点

·卵子发生和精子发生的过程很相似，都要经过增殖期、生长期和成熟期三个阶段，但与精子发生相比也有许多不同之处。

·首先，卵原细胞经过有丝分裂的增殖形成初级卵母细胞，初级卵母细胞经过两次减数分裂，每次分裂均生成大小不等的两个细胞，小的称为极体。

多余的染色体被排出，最后形成一个成熟的卵子。

·其次，哺乳动物的卵原细胞分裂形成初级卵母细胞都是在胎儿出生以前或出生后不久完成的。

·在动物性成熟以前，卵母细胞不再增长，停留在第一次减数分裂前期。

·到性成熟以后，每个性周期都会有部分卵母细胞发育，但多数卵母细胞在发育过程中退化，只有少数卵母细胞发育到成熟并排卵。

（几百万与几百个）

·第三，卵母细胞在生长发育过程中要积累大量的营养物质和遗传信息，为受精和胚胎发育提供营养和信息。

3、卵子发生过程：

可划分为卵原细胞的增殖、卵母细胞的生长和成熟三个阶段。

·卵子从卵巢的成熟卵泡中排出的过程，称为排卵。

·排卵类型根据卵巢排卵特点和黄体的功能分为自发排卵和诱发排卵。

第三节受精与早期胚胎发育

·受精是两性配子（精子和卵子）相互作用，结合产生新的个体即合子（zygote）的过程。

·妊娠（怀孕）:

哺乳动物所特有的一种生理现象，是自卵子受精开始一直到胎儿发育成熟后与其附属物共同排出前，母体所发生的复杂生理过程。

·妊娠是新个体产生的过程，包括受精、着床、妊娠的维持、胎儿的生长以及分娩。

·胚胎一旦在子宫中定位，便结束游离状态，开始同母体建立紧密的联系，这个过程称为着床或附植。

·合子——2细胞——4细胞——、、、、——桑椹胚——囊胚——扩展囊胚——孵化囊胚——原肠胚——神经胚

·受精是两性配子（精子和卵子）相互作用，结合产生新的个体即合子的过程。

·受精过程始于精子与卵子相遇，两性原核合并形成合子时结束。

·→精子穿过放射冠→穿过透明带→精子进入卵黄（皮质、卵黄膜、透明带反应）→原核形成→配子配合。

二、早期胚胎发育

·合子经几次卵裂后的胚胎，形成像桑椹样的致密细胞团，称桑椹胚。

·胚胎经过一段游离状态后，开始同母体建立紧密联系，这一过程称为附植。

妊娠期:

从受精开始（一般由最后一次配种日期开始计算）到分娩为止的一段时间,是新生命在母体内生活的时期。

·各种动物的妊娠期——奶牛：

280肉牛：

285猪：

114山羊：

152绵羊：

150人：

三、胎膜、胎水与胎盘

·胎膜分为羊膜、尿膜、绒毛膜和卵黄囊。

·胎水指羊膜囊和尿囊内的羊水和尿水。

·胎盘的定义是由母体胎盘（子宫内膜）与胎儿胎盘（绒毛膜）共同组成的结构。

·胎盘的功能具有物质运输、合成分解代谢、分泌激素及免疫等多种功能。

▼母畜妊娠之后，母体与胎儿之间进行物质交换的器官是胎盘，胎儿从母体获得氧气和营养，胎儿向母体排出代谢产物，如二氧化碳和尿素等。

▼胎盘由胎膜和子宫内膜共同构成。

第四节妊娠与分娩

一、妊娠的识别与建立

·妊娠的识别妊娠的初期，孕体（胎儿、胎膜、胎液的复合体）即能产生信号传感给母体，母体随即产生一定的反应，从而识别（或知晓）胎儿的存在，由此，孕体与母体之间建立起密切的联系。

如阻止子宫的前列腺素分泌

·妊娠的建立孕体和母体之间产生了信息传递和反应后，双方的联系和互相作用已通过激素的媒介和其他生理因素而固定下来，从而确定开始妊娠。

·在人类，每个月经周期起初有15-20个原始卵泡同时开始生长发育，但是通常只有1个卵泡发育成为优势卵泡，最后发育成熟并排卵，其它卵泡均先后退化并形成闭锁卵泡。

·在卵泡期中，子宫内膜也发生相应的变化，主要表现为内膜增厚，腺体增多并变长，此期长为增生期。

·在黄体期，子宫内膜在雌激素作用的基础上又接受孕激素的刺激，内膜细胞体积增大，糖原含量增加，腺管由直变弯，分泌含糖原的粘液，故称分泌期。

·在子宫的分泌期,一切为妊娠作好准备,迎接受精卵子。

·正常妊娠的维持有赖于垂体、卵巢和胎盘分泌的各种激素相互配合，在受精与着床之前，在腺垂体促性腺激素的控制下，卵巢黄体分泌大量的孕激素与雌激素，导致子宫内膜发生分泌期的变化，以适应妊娠的需要。

·若不受孕，黄体的寿命为12-15天，黄体即退化，血中孕激素与雌激素浓度明显下降，子宫内膜血管发生痉挛性收缩，随后出现子宫内膜脱落与流血，出现月经。

·如果受孕，在受精后第六天左右，胚泡滋养层细胞便开始分泌绒毛膜促性腺激素，以后逐渐增多，刺激卵巢黄体变为妊娠黄体，继续分泌孕激素和雌激素，使黄体功能继续维持一定时间，适应妊娠的需要，月经周期停止（妊娠标志之一）。

·胎盘形成后，胎盘成为妊娠期一个重要的内分泌器官，大量分泌蛋白质激素、肽类激素和类固醇激素。

·避孕原理

二、分娩的发动与分娩过程

分娩：

雌性动物经过一定的妊娠期以后，胎儿在母体内发育成熟，母体将胎儿及其附属物从子宫内经过产道排出体外的生理过程。

·母体分娩的发生并不是单一的特殊因素所致，而是由机械性扩张、神经及激素等多种因素相互联系、协调而促成。

某些研究把分娩解释成母体的一种免疫反应

·分娩过程分为子宫颈开口期、胎儿产出期和胎衣排出期三个阶段。

·分娩过程是否顺利，主要取决于产力、产道和胎儿。

·胎向胎位胎势

·正常分娩时胎儿应为纵向/上位/头前置或臀前置呈伸展姿势.

·胎儿纵轴与母体纵轴互相平行的分娩方式。

·胎儿伏卧在母体子宫内，胎儿的背部在上

·胎儿在母体子宫内的姿势是指胎儿各部分屈伸的程度。

·若在分娩时羊水已流出，而胎儿尚未排出，母体的阵缩和努责又较微弱，助产人员可抓住胎头和两肢的腕部，随着母体的努责频率，沿着骨盆轴的方向缓缓拉出胎儿，切不可强行拉出，以免带出子宫，造成子宫脱。

三、妊娠诊断

·家畜繁殖工作中常常通过妊娠诊断,早期确诊母畜是否妊娠,对已妊娠母畜加强饲养管理,作好保胎工作;

·对没有妊娠的母畜即时的继续进行配种或找出未孕原因,进行必要的改进或治疗,以减少空怀,从而提高母畜的繁殖率。

·人：

尽量停止用药，防止畸形

·检测母体血中或尿中的HCG，可作为诊断早孕的准确指标（早孕试纸）。

第五节　激素与生殖

一、激素的概念

·早在公元前11世纪至公元前8世纪（西周时期），我国就有了家畜去势术（即去掉公畜的睾丸），而且相当盛行。

·激素是由有机体产生、经体液循环或空气传播等途径作用于靶器官或靶细胞、具有调节机体生理机能的微量信息传递物质或微量生物活性物质。

二、生殖激素的来源和作用

·概念：

与生殖活动有直接关系的激素

·来源：

生殖器官或其它器官。

·作用：

贯穿于生殖过程的始终。

如配子的发生、成熟与排出、性行为、受精、妊娠、分娩和泌乳等生理无一不受生殖激素的调节。

生殖激素作用的协调平衡是维持生殖活动得以顺利进行的内在生理基础。

第四章动物克隆技术

第一节动物克隆简史

一、克隆的定义及分类

·克隆（clone，愿意为树木的枝条）在生物学中指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖（细胞）系

·自然界中普遍存在着克隆现象，低等生物较常见（裂殖、蜜蜂孤雌生殖），但即使高等哺乳动物也不例外（同卵双胞胎）。

·自然的哺乳动物克隆的发生率极低，而细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，所以人们往往把它称为动物克隆技术。

二、细胞核移植技术

1.定义：

细胞核移植技术（nucleartransfer，NT），就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖就可被激活、分裂并发育成新的个体，使得核供体的基因得到完全复制。

2.获得克隆动物必需具备的条件：

1.供体细胞核2.受体卵母细胞3.胚胎移植的受体

3.克隆的原理

·早期胚胎的每一个卵裂球都具有独立发育成个体的全能性。

·全能性（totipotenty）指细胞能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即发育成完整动物体的能力。

·实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。

·细胞分化：

分化细胞中有组织特有的基因（奢侈基因，luxurygene），而且还能合成在该组织中特征的酶及结构蛋白质。

·体细胞重编程是分化的体细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程。

·诱导体细胞重编程的方法有许多，如核移植、细胞融合、细胞提取物诱导、化学诱导以及分子调控诱导等。

三、动物克隆的发展历史

1.哺乳动物胚细胞核移植

1981年，Illmensee和Hoppe通过直接注射法把小鼠内细胞团细胞引入合子中后去原核，出生了小鼠。

但这项研究未能重复出来。

2.哺乳动物体细胞的克隆

小鼠，卵丘细胞，Wakayama（1998）；采用直接注射法将卵丘细胞注射到去核卵母细胞质中，得到克隆和再克隆小鼠。

山羊，张涌（2000）阳阳

3.异种克隆

·核供体细胞与核受体细胞来源于两个不同的种系。

·在珍稀动物的保护方面可以发挥重要的作用

4.继代克隆：

指将核移植胚胎的卵裂球或克隆动物的体细胞作为核供体，进行第二代以至重复多代核移植，产生多代克隆胚胎和克隆动物。

5.转基因克隆动物

·转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆动物技术的有机结合，它是以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能够进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体进行动物克隆。

第二节动物克隆的技术流程

一、细胞核移植步骤概述

供体核的分离技术→受体细胞的去核技术→核卵重组技术→重组胚的融合与激活技术→核移植胚的培养、移植或重复克隆技术

1.显微操作仪简介

1.1机械手：

代替人手在显微镜下操作微小的细胞。

·机械手利用杠杆原理，通过力矩的变化缩小运动距离，这样人手的活动，就被机械手相应地缩小了许多倍。

因而，人手移动1毫米，机械手相应地移动不到几十分之一毫米。

1.2固定管

·拿一个足够细的玻璃管一端抵到细胞上，从另一端吸气，由于管内的压力降低，形成负压，卵细胞就会被牢牢地吸到玻璃管口上。

·再把玻璃管用夹子牢牢地固定到机械手上。

这样我们就可以“抓住”卵细胞，并能自如地把它移来移去了。

·固定管经过几道工序，经过拉、磨和煅烧才做出来的。

1.3注射管

·用注射管刺进卵细胞把核吸出来。

·做好的针后部用一段细胶管接到一个注射器上，做成一个带有极细针头的注射器。

1.4去核

·最初用注射针直接刺入卵细胞中把核抽掉，但这样做损伤卵子，易导致细胞死亡。

·这样当用“微型注射管”的玻璃针口抵在细胞膜上以后，抽去针管内的部分空气，细胞膜由于管内负压的作用，就有一部分连同细胞质一起进到玻璃管内，如果找好位置就可以把核一起吸到玻璃管内。

·核吸到玻璃管内以后，玻璃管向外拉，有核的这部分胞质就会与卵细胞分离断裂开。

·细胞膜在这方面与气球完全不同，它是一种动态的有活性的膜（膜的流动性），当有核的部分胞质与卵断裂开后，细胞膜会自动地将断裂的口修补上。

·卵细胞的结构比较特殊，在卵细胞膜外面还有一层很坚韧的比较厚的膜——透明带，注射针有锐利的尖即是为了刺穿透明带。

1.5注核

·将克隆的细胞核移到没有核的空卵中的过程是生产克隆动物的关键。

二、动物克隆的技术流程

1.供体细胞的种类与准备为关键步骤之一。

按供、受体动物种类分为同种和异种两种；按供体细胞的种类分为胚胎细胞、体细胞和ES细胞。

2.供体细胞周期的调控

·处于G0或G1期效果好。

常用方法为血清饥饿法处理，使细胞周期停滞在G0期（生长停滞期）或G1期。

·去核管要经过拉、磨和煅烧才做出来的

2.去核方法

常用方法为盲吸法、透明带切开法、荧光引导去核法。

·透明带切开法

1）透明带切口：

2）去核：

直接去核：

用平头吸管自切口处插入，连同PbⅠ及其下方的约1/4－1/3胞质去掉，适用于小鼠。

挤压法去核：

将PbⅠ重新固定于12点位置，用平头吸管自固定管对侧挤压卵，则PbⅠ及其下方部分胞质被挤出，适用于牛

（三）核卵重组技术

1.卵周隙注射多莉克隆技术2.胞质内注射檀香山技术（小鼠）

（四）重组胚的融合与激活技术

1.融合技术:

·卵周系（带下）注射的必须进行融合；

·融合的方法有化学法、仙台病毒融合法与电融合法，现以电融合法最常用；

※电融合法:

*不仅可以有效融合,而且可以激活;

*原理:

依靠直流脉冲使细胞膜产生可逆性的微孔,进而导致融合;

*方法:

将重组胚置于融合小室内，使核－质接触面与电极相垂直，在一定的电场强度下，给予一定时间的直流电脉冲促使其融合。

2.激活技术:

·重组胚的正常发育有赖于卵的充分激活;

·电脉冲可诱导融合与激活，但仅能引起胞内游离钙离子浓度的单次上升，激活率低，常采用电融合后再用化学试剂进行激活处理。

（五）核移植胚的培养、移植或重复克隆技术

·融合后的重组胚经化学激活或电激活后，在体外培养或经过中间受体（羊、兔等）培养至桑椹胚或囊胚，然后移入与胚龄同期的受体动物子宫角内，可获得克隆后代。

·获得的早期胚也可作为供体核重新克隆（继代克隆）。

第三节应用前景与存在的问题

一、应用前景

·利用克隆动物遗传基因与原型一致的特点，该技术在科学研究和实践应用中具有重大价值。

·在畜牧业生产、转基因动物生物反应器、发展蛋白质药物生产、制备医用试验动物、生物学基础研究、珍稀动物保存繁殖、异种器官移植、治疗克隆技术等方面都提供了发展的可能和无穷的潜在利益，对人类的贡献将是巨大的。

※克隆动物的应用价值

（1）作为胚胎发生、死亡及其调控，细胞核与胞质间的关系的研究手段，同时可促进人类了解生物生长发育的机理，特别是发现影响生长和衰老的因素。

（2）为科学研究提供大量遗传性状一致的实验动物。

（3）优秀种公、母畜的纯种快速繁育扩群。

培养大量品质优良的家畜，丰富人们的物质生活，使畜牧业的成本降低，效率提高。

（4）拯救珍贵濒危动物。

利用克隆可以大量复制珍稀动物，挽救濒危物种，调节大自然的生态平衡，如异种克隆。

（5）克隆复制转基因动物，建立生物工厂。

1.在畜牧业生产上的应用

·借助于克隆技术，可以特优良品种的牲畜或特别优良的个体，进行快速复制。

·即使它面临死亡，也可将它的组织冻存，利用体细胞克隆技术，得到它的复制品。

特别是用于牛的多代克隆技术己经达到实用化的