浅谈致孔剂对多孔羟基磷灰石微球的孔结构的影响.docx

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浅谈致孔剂对多孔羟基磷灰石微球的孔结构的影响

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　　0　引　言

　　近年来，多孔材料由于具有相对密度低、比强度高、比表面积高、重量轻等优点而在组织工程领域引起了广泛的关注[1]。

目前国内外已有很多学者对多孔材料的制备及性能展开了研究。

Hench等认为组织工程多孔材料中的大孔是有必要存在的，因为它能给组织提供充足的血液供应，以保持新生组织的活力和健康生长。

而不同尺寸的大孔也具有相应的作用，据文献报道：

尺寸为15～40μm的孔洞适合于纤维组织的生长，尺寸为40～100μm的孔洞适合于骨组织的生长，而血管组织只能在孔直径大于100μm时才能够长入。

因此，根据不同的使用需求来制备孔径可控的多孔材料是十分有意义的。

另外，多孔材料的高孔隙率以及孔洞之间的高连通性，有助于血液、营养物质的运输和代谢废物的排除，对其应用也有重要影响。

于是，寻找出一种简单可行的方法来获得可调节孔径、孔洞高连通性及高孔隙率的多孔材料迫在眉睫。

　　近来，人们多采用模板法、相分离、乳液冷冻干燥、3D光刻和溶剂浇铸/粒子浸出等方法来制备孔结构可控的多孔材料。

其中，模板法中所使用的模板包括聚合物、晶体或微液滴等。

一些纳米聚合物，尤其是树脂，由于它们的物理化学性能，例如形状、尺寸和表面电荷等相对稳定，而被广泛用作模板来制备多孔材料。

基于热力学稳定性和对称性要求，常规的聚合方法，如乳液聚合、悬浮聚合、分散聚合等，制备的聚合物颗粒通常为球形颗粒，用于合成树脂微球的方法也有很多。

但是，由于树脂微球合成过程中的变量较多，形貌、尺寸及均匀性不稳定，所以很少有人直接将树脂微球用作致孔剂。

莰烯，是一种无毒的双环单萜烯类有机化合物，在低温环境下易形成枝晶且在60℃便可升华，因此它也经常被用作模板来制备具有连通性结构的多孔材料。

可是，由于其枝晶形态本身的不稳定性，所以在实际应用过程中往往受到限制。

羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA），是人体骨骼、牙齿等硬组织的主要无机组成部分，其所含钙磷量与天然骨的无机成分极其相似，具有良好的生物相容性、生物活性、骨传导性等特点，因而是一种理想的组织工程骨修复支架材料[11-14]。

在本次研究中，首先探索合成尺寸可调的间苯二酚-甲醛（resorcinolformaldehyde，RF）树脂微球的工艺参数，然后分别比较它与莰烯作为致孔剂在HA材料中所产生的不同孔结构，以期对多孔HA材料进行结构优化，使其具有合适的多孔结构。

　　1　实验部分

　　　试剂

　　间苯二酚（上海阿拉丁试剂有限公司）;甲醛（杭州高晶精细化工有限公司）;碳酸钠（天津永大化学试剂有限公司）;司班80（Span80，天津光复精细化工研究所）;吐温80（Tween80，天津永大化学试剂有限公司）;明胶（GEL，上海申能博彩生物科技有限公司）;聚丙烯酸钠盐（PAA，SIGMA公司）;莰烯（camphene）、无水氯化钙、十二水合磷酸氢二钠、聚乙烯醇（PVA）、氢氧化钠、无水乙醇、Triton　X-100均由杭州米克化工仪器有限公司代理订购。

所有药品试剂均为分析纯。

　　　实验过程

　　　RF树脂微球的制备

　　在室温条件下，将间苯二酚和甲醛水溶液（质量分数37%）先后加入到15mL去离子水中，在一定预聚合温度下搅拌45min，随后向将该混合溶液中添加去离子水，并定容至50mL，得到间苯二酚-甲醛溶胶溶液。

另量取300mL石蜡油，在其中添加一定量的表面活性剂Span80，在85℃水浴下搅拌5min，使石蜡油与表面活性剂混合均匀，然后将间苯二酚-甲醛溶胶溶液注入石蜡油，并以一定的搅拌速度搅拌，使其分散在油相中。

搅拌15min后，将烧杯放于85℃烘箱内静置2d，最后取出橙色沉淀物并用1%Tween80溶液离心洗涤3次，干燥后即得RF树脂微球。

　　本实验在RF树脂微球的制备过程中分别考察了碳酸钠、预聚合温度、表面活性剂浓度及搅拌速度等变量对微球尺寸的影响，其中的碳酸钠事先溶解在用来分散间苯二酚和甲醛的15mL去离子水中，预聚合温度从预设室温（25℃）变化至75℃，表面活性剂的浓度～/L，搅拌速度100～400r/min。

　　　HA微球的制备

　　首先制备HA粉末。

在室温条件下，用电位滴定仪将500mL浓度为60mmol/L的Na2HPO4水溶液缓慢滴加到500mL浓度为100mmol/L的CaCl2水溶液中，然后用1mol/L的NaOH调节溶液pH值为，在搅拌条件下继续反应6h，待反应完全结束后，将反应体系放置在37℃恒温箱中陈化4d，得到乳白色HA沉淀。

将所得沉淀分别用去离子水和无水乙醇洗涤3次，再置于60℃烘箱内干燥，最后研磨获得HA粉末。

接着配制10%明胶溶液作为粘合剂。

在50℃下，取10g明胶固体颗粒加入到90mL含有2%PVA的水溶液中，搅拌均匀，继而将表面活性剂Triton　X-100和分散剂PAA加入其中，充分溶解后备用。

　　当使用RF树脂微球为致孔剂时，先将一定尺寸的RF树脂微球与　HA粉末一起加入到4mL　10%明胶溶液中，并于50℃下搅拌4h后，将此悬浊液注射到0°C的植物油中，并以200r/min的转速搅拌使其分散，搅拌10min后取出，用丙酮和无水乙醇清洗干净，然后将小球冷冻干燥，最后放入马弗炉中以5℃/min的升温速率升温至1　200℃并保温4h，获得多孔HA微球。

当使用莰烯为致孔剂时，先将莰烯固体置于50℃水浴中融化，然后依次加入　HA粉末，4mL　10%明胶溶液，在50℃下搅拌4h，其余制备步骤与RF树脂微球为致孔剂时相同。

　　当使用RF树脂微球混合莰烯为致孔剂时，先将莰烯固体置于50℃水浴下融化，然后依次加入一定尺寸的RF树脂微球，粉末以及4mL　10%明胶溶液，继续在50℃下搅拌4h，其余制备步骤与RF树脂微球为致孔剂时相同。

　　　测试与表征

　　采用JSM-5610LV扫描电子显微镜观察RF树脂微球以及多孔HA微球的微观形貌;采用Nicolet5700红外光谱仪对RF树脂进行红外光谱分析（FT-IR），KBr压片，光谱范围500～4　000cm-1;采用CANON　PowerShot　A4000IS数码相机拍摄不同预聚合温度下的溶胶溶液（凝胶）颜色;采用图形分析软件Image-Pro　Plus（IPP）分析RF树脂微球的球形度以及平均粒径;根据获得的颗粒平均直径的数据，绘制相应的粒径分布曲线，而颗粒的球形度可通过以下公式计算：

φ=4π×AP2

（1）其中：

φ表示颗粒的球形度，A表示颗粒的投影面积，P表示颗粒的周长。

　　2　结果与讨论

　　　RF树脂微球的形貌

　　多孔基质上孔的形状和尺寸与所用致孔剂颗粒的形状和尺寸密切相关。

本实验通过油包水微乳液体系中的溶胶凝胶法来制备得到球形RF树脂颗粒。

通过图形分析软件IPP和公式

（1），计算出三组微球的球形度分别为、和。

理论上，球形度的计算数值越接近于1，则颗粒的球形度就越好，根据公式

（1），可以推算出球体的球形度为1。

例如与球体相近的椭球体（短半轴长　L，长半轴长L）的球形度为　2。

这一结果表明，反应条件对微球的球形度没有明显的影响（三种不同反应条件下，φ值仅从变化到），而三种反应条件下得到的微球都具有良好的类球形形貌，说明这种制备方法可以比较容易获得球形度良好的RF树脂微球颗粒。

每组微球的尺寸也都比较均匀，只是在不同组别间，微球的尺寸存在着较为明显的差异。

用IPP对进行分析，其所对应的平均直径分别是45、69、126μm。

其尺寸变化主要源于反应条件的变化。

这表明，RF树脂微球的形貌不易发生改变，而其尺寸却可通过改变反应条件来进行调控。

为此，下文将集中讨论影响RF树脂微球尺寸变化的因素。

　　　RF树脂微球的尺寸

　　　碳酸钠对微球尺寸的影响

　　在添加催化剂碳酸钠后，RF树脂微球的尺寸大大增加。

在其它反应条件保持不变的情况下，未添加碳酸钠所制得的RF树脂微球平均直径仅为3μm，而在添加碳酸钠后平均直径增长到了15μm。

　　RF树脂的形成过程主要包括羟甲基衍生物的加成反应和形成亚甲基与亚甲基醚桥接化合物的缩合反应。

在间苯二酚和甲醛的聚合反应中，碳酸钠是一种最为常见的碱性催化剂。

首先，这类碱性催化剂激活了一小部分的间苯二酚，为单体粒子的生长提供场所，;然后，这些单体粒子会形成高交联的聚合物胶体粒子;最后，这些优先形成的胶体粒子又会互相聚集从而形成更大的颗粒。

　　在2　923cm-1处有亚甲基的伸缩振动吸收峰;在1　614cm-1和1　470cm-1处有苯环的碳碳双键振动吸收峰;在1　218cm-1处有酚羟基伸缩振动吸收峰;在1　094cm-1处有较强的羟甲基伸缩振动吸收峰。

但是与未添加碳酸钠的RF树脂微球的谱图比较，添加了碳酸钠的树脂微球谱图上，在2　923cm-1和1　094cm-1处的吸收波峰相对更为强烈，而这两个波峰分别来自于亚甲基和羟甲基的伸缩振动。

这证明了在添加碳酸钠后，RF树脂具有更高的聚合度，而具有高聚合度、高交联结构的RF树脂所形成的微球通常会具有更大的尺寸。

　　　预聚合温度对微球尺寸的影响

　　当预聚合温度从25℃变化到50℃时，树脂溶液的颜色是逐渐变深的，继续上升至75℃后，液态的溶胶转变成了红色的固态凝胶。

这可能是因为随着温度的增加，预聚合反应速率也随之提高，晶胞发生聚集并形成了大量高粘性的小分子颗粒，由于粘性的增大，小分子颗粒间互相凝结，从而导致溶胶溶液的颜色产生了变化25℃和50℃下RF树脂微球的粒径分布，其平均直径分别是16μm和21μm;50℃下所形成的微球尺寸较大，这是由于该温度下的溶胶溶液具有较高的黏度，使得微球内部更为紧密，因此在相同转速的剪切力作用下，微球不易分裂。

　　　表面活性剂浓度对微球尺寸的影响

　　在RF树脂微球的制备过程中，表面活性剂在微乳液液滴的表面形成了界面张力，阻止了液滴与液滴间的再次聚集，以此来稳定油包水体系中所形成的微球。

随着表面活性剂浓度的降低，微乳液的表面能和界面张力随之降低，液滴间相互聚合的可能性增加，因而最终所形成的微球尺寸也将增加。

本实验用Span80作为表面活性剂，不同Span80浓度下RF树脂微球的粒径,保持其他反应条件不变，当Span80的浓度由/L增加大到/L时，RF树脂微球的平均尺寸从126μm减小到16μm。

　　　搅拌速度对微球尺寸的影响

　　保持其他反应条件不变，当转速从100r/min增加到400r/min时，RF树脂微球的尺寸由69μm减小到了28μm。

这是因为RF树脂微球是通过其溶胶溶液在高剪切力的作用下分裂而形成的小液滴，较高的转速产生了较强的剪切作用力，因而更易使溶液从大液滴分裂成小液滴，继而形成较小尺寸的微球。

　　　致孔剂对多孔HA微球孔结构的影响

　　　以RF树脂微球为致孔剂制备HA微球

　　本实验制备的一系列RF树脂微球经高温烧结后可被彻底气化排除，于是首先尝试选用RF树脂微球为模板占位制孔来获得多孔HA微球，HA微球内部产生了与所选RF树脂微球尺寸及形状相似的大孔，但是连通性较差，大孔与大孔间无孔道相连接。

这种无连通性的大孔结构使细胞或组织在HA微球内部无法交换营养物质，更无法进行集落生长，限制了多孔HA微球在组织工程中的应用。

　　　以莰烯为致孔剂制备HA微球

　　莰烯作为致孔剂被广泛应用于生物陶瓷如氧化铝、羟基磷灰石及聚合物之中。

由于其在低温下可形成枝晶且在60℃便能升华，所以尝试由它制孔生成具有连通性结构的多孔HA微球。

　　HA微球内部存在着相互连通的微孔。

这是因为，微球在冷冻干燥前的低温预处理过程中均匀混合在内部的莰烯转变成了枝晶结构，低温固化在HA微球的内部，在其后的冷冻干燥以及烧结处理中，枝晶结构的莰烯被完全除去，从而在HA微球内部形成了相互连通的微孔结构。

但是从SEM图中可以发现，这些微孔孔径都小于10μm，在HA微球内部并不存在满足组织工程所需的大孔结构，这种无大孔的微孔结构未能给细胞或组织提供合适的生长环境，同样限制了其在组织工程中的应用。

　　　以RF树脂微球混合莰烯为致孔剂制备HA微球

　　为了获得既具有连通结构又具有合适大孔的多孔连通性HA微球，本实验尝试将RF树脂微球混合莰烯来作为致孔剂制备HA微球。

选取了平均粒径较大的126μm的RF树脂微球与莰烯混合，使大小孔之间有明显的区分。

试样经冷冻干燥以及高温烧结处理，在HA微球中产生的孔结构，此混合致孔剂所形成的孔结构结合了RF树脂微球与莰烯制孔的优点，大孔及连通微孔同时存在，使HA微球较好地满足了组织工程对于多孔支架的要求，成为一种潜在的理想的生物支架以及药物载体。

　　3　结　论

　　以间苯二酚和甲醛为原料，用油包水微乳液体系的溶胶凝胶法制备RF树脂微球，所得微球球形度良好、尺寸均匀，且可以通过添加碳酸钠，改变预聚合温度、表面活性剂浓度和搅拌速度等反应条件来调控微球的尺寸，满足模板法制备孔径可控材料时对于致孔剂的要求。

使用制备得到的具有合适尺寸的RF树脂微球混合莰烯作为致孔剂，同样采用微乳液法制备HA微球，在经过一定的冷冻干燥和烧结后，可以获得具有连通性微孔和大孔结构的多孔连通性HA微球。

该种结构的HA微球在组织工程支架、细胞载体及其他多孔材料领域具有潜在的应用价值。

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