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拟南芥总蛋白提取

河北经贸大学毕业论文

拟南芥蛋白不同提取方法的SDS—PAGE凝胶电泳分析

专业名称：

生物技术

班级：

200302

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完成时间：

2007年6月

摘要

植物蛋白提取方法有很多种，不论使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性，保存活性防止变性及降解现象的发生。

因蛋白空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失，因此选择的条件应为十分温和。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术作为分离鉴定生物大分子的一种实验技术手段，已经成为分子生物学实验室中的重要技术之一。

本试验采用三种不同的方法（两种蛋白溶解法，一种蛋白沉淀法）分别提取拟南芥不同组织（拟南芥整个植株，拟南芥叶片，拟南芥愈伤组织）的蛋白，然后用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行电泳分析，通过分析凝胶电泳图谱比较分析不同提取液提取蛋白的效果优劣从而确定较好的蛋白提取法，以及拟南芥植株不同组织含有的不同蛋白。

实验结果表明提取液2提取蛋白的效果最好，电泳条带最清楚，提取液3即三氯乙酸丙酮次之，提取液1即PBS溶液最次；并且拟南芥总蛋白跑的电泳谱带最多且最清晰，叶片蛋白谱带最少且较模糊，说明植物各组织的蛋白含量与种类存在差异，这与其功能性质具有相关性，叶片电泳谱带少说明叶片蛋白只含有总蛋白的一部分，由于根部蛋白受培养基中的琼脂的影响而出现一条粗带。

另外，本实验采取了快速脱色和脱色液脱色两种不同的脱色法，结果表明快速脱色法不仅简单方便效果更好适于推广致用。

关键词SDS-PAGE电泳；拟南芥蛋白；蛋白质分析

Abstract

Therearemanymethodsofthewithdrawtionoftheplantproteins,nomatteranymethod,itmustpreservethebiologymacromolecularstructuretobeintegrityintheoperation,preserveactivitytopreventthedegradationanddegenerationphenomenon.Spaceforproteinstructuremainlyrelyonhydrogenbonding,saltbondingandtheVanderWaalsbonding,theexistenceoftheeventacid,alkalitreatment,hightemperature,Mechanicaldramaticroleandstrongradiationcanleadtothelossofactivity,itshouldchoosetheconditionsfortheverymodest.SDS-PAGEastheisolationandidentificationofbiologicalmacromoleculesinoneoflaboratorymeans,ithasbecomeoneoftheimportantlaboratorytechniqueinMolecularbiology.

Thisexperimentusesthreedifferentmethods（twomethodsareproteinstodissolvesolution,onemethodisproteinprecipitation）withdrawsthetissues,proteinofArabidopsisthaliana（alltheproteinofArabidopsisthaliana,theleafproteinofArabidopsisthaliana,theinjuriestissueproteinofArabidopsisthaliana）,andthentheproteinatlasindifferenttissuesandorgansofArabidopsisthalianawereanalyzedwithSDSpolyacrylamidegel,andthen,throughtheanalysisoftheSDS-PAGEpicturewecananalysisthedifferentextractbufferandthedifferentproteinofthedifferentorganizations.

Finally,theresultsindicatethatthebestmethodisextractbuffer2—theSDS-PAGEpictureistheclearest,theextractbuffer3thatisthetrichloroaceticacidacetonenext,thelastistheextractbuffer1whichisPBS.ThekindsofproteininthewholeArabidopsisthalianaweremostandclearestinthesethreetissues,thekindsofproteinintheleafwereleast,thisphenomenoncanbeexplainedbythattheprotein'scontentandtheprotein'stypearedifferent,thisindicatesthatthenumberofthestripbeltbandhastherelevancewiththefunctionnature,thephenomenonthatthenumberoftheleafproteinistheleastindicatethatthecontentandtypeoftheleafproteinareonlyapartofthewholeproteinofArabidopsisthaliana;asaresultofthattheculturemediumhasinfluencewiththerootprotein,thepictureofthewholeproteinhasathickbelt.Inaddition,thisexperimenttakestwodifferentbleachingmethods,oneisrapidbleaching,theotherisbleachingliquid,theresultshowsthattherapidbleachingmethodnotonlysimpleandconvenient,butalsohaveabettereffect,sowecanuseitextensively.

KeywordsSDS-PAGEelectrophoresis;Arabidopsisthalianaprotein;Theproteinanalysis

1引言···························································································1

1.1拟南芥简介·················································································1

1.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳·····························································2

1.3拟南芥蛋白提取···········································································3

1.4实验研究的意义···········································································3

1.5展望···························································································4

2材料、主要试剂及主要仪器···························································4

2.1实验材料···················································································4

2.1.1拟南芥培养···············································································4

2.1.2培养拟南芥愈伤组织··································································4

2.2主要试剂及药品···········································································5

2.2.1溶液的配置···············································································5

2.2.2所用主要药品和试剂··································································7

2.3主要仪器···················································································8

3实验方法·····················································································8

3.1样品蛋白的制备——蛋白质的提取·················································8

3.1.1提取液1、2和水提取蛋白··························································8

3.1.2提取液3提取蛋白·····································································9

3.1.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳···························································9

4结果与分析···············································································10

4.1不同方法提取拟南芥不同组织蛋白的效果比较分析·························10

4.2丙酮法提取蛋白与其它提取法的比较············································11

4.3拟南芥蛋白分子量分析·······························································13

5讨论··························································································13

5.1金属离子螯合剂在蛋白提取中起重要作用······································13

5.2关于谱带倾斜现象······································································13

5.3关于拟南芥各组织蛋白·······························································13

5.4染色、脱色·················································································14

6结论··························································································15

参考文献·······················································································16

致谢·····························································································18

拟南芥蛋白不同提取方法的SDS—PAGE凝胶电泳分析

1引言

1.1拟南芥简介

拟南芥（Arabidopsisthaliana）十字花科。

二年生草本，高7～40厘米。

基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。

总状花序顶生，花瓣4片，白色，匙形。

长角果线形，长1～1.5厘米。

花期3～5月。

我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现[1]。

图1-1拟南芥花图1-2拟南芥植株

这种植物具有以下特点：

（1）形态个体小，高度只有30cm左右；

（2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右；

（3）种子多，每株每代可产生数千粒种子；

（4）形态特征简单；

（5）基因组小，只有5对染色体。

拟南芥广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，被科学家誉为“植物中的果蝇”。

虽然这种植物在许多方面“简单”，但它的大多数基因与其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性，另外，由于这种植物的全部基因组测序已经完成，因此可以预测，拟南芥在植物学所有领域的研究中将发挥更大的作用[2]。

1.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

1937年瑞典化学家Tiseliue首先开发了蛋白质电泳技术，并成功地将血清蛋白分成几个组分。

原理：

迁移率是带电颗粒在一定电场强度下，单位时间内介质中的迁移距离，可公式计算：

U=V/E=Dl/Ut

U：

迁移率，单位是cm/V．s或cm/V．min

V：

泳动速度，单位是cm/s或cm/min

E：

电场强度，单位是V/cm

D：

泳动距离，单位是cm

T：

电泳时间，单位是min或s

L：

支持物长度，单位是cm

SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）的简称，是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。

这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量[3]。

聚丙烯酰胺变性凝胶电泳是对扩增产物进行检测，与其他电泳法比较具有如下优点：

①电泳区带狭窄不易扩散，供试品用量极微，电泳分离时间短，设备简单，分辨率高，重复性佳，已广泛用于酶、蛋白、聚核苷酸、多肽的分析鉴定和少量制备。

②凝胶是以单体-烯酰胺和交联剂，甲叉丙烯酰胺聚合而成的纵链交错的且有“分子筛效应的三维网状结构”。

其机械性能优良，对热稳定，无色透明，无杂质，不溶于缓冲液，在280nm波长处无紫外吸收。

电泳时无电渗和吸附作用，适于供试品的定量和精制。

本实验利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分别比较不同提取方法提取拟南芥总蛋白、叶蛋白、愈伤组织蛋白的差异以及每个提取方法的优劣。

1.3拟南芥蛋白提取

蛋白质的种类有很多，提取方法也有很多种，常用的有等电点沉淀法、盐析法、有机沉淀法，不同的方法对与提取不同的蛋白具有较好的效果。

即使是同一种物质的不同组织也含不同的蛋白质，在本实验中，将采用三种方法（两种蛋白溶解法，一种沉淀蛋白法）提取拟南芥不同组织的蛋白质，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，比较不同的提取方法的提取效果、不同组织的蛋白提取情况[4]。

不论使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性，保存活性防止变性及降解现象的发生。

因空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失，因此选择的条件应为十分温和。

同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染[5]。

1.4实验研究的意义

拟南芥已广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，被科学家誉为“植物中的果蝇”。

虽然这种植物在许多方面“简单”，但它的大多数基因与其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性，该种植物的全部基因组测序已经完成。

SDS聚丙烯是种很重要的分离生物大分子的实验技术，但是在实验过程也有很多应该注意的事项。

蛋白质的提取有多种方法，本实验中将选用三种不同的方法进行提取，然后将提取的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，从而确定提取蛋白的最佳方法。

本实验通过用多种对拟南芥不同组织进行提取，提取的蛋白样品将进行SDS凝胶电泳分析，分析不同蛋白提取法的优劣以及同一植物不同组织的蛋白电泳差异，加强对SDS-PAGE的原理和操作步骤的理解和掌握。

1.5展望

提取蛋白跑完电泳后可以做Western杂交，然后进行蛋白序列分析。

Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。

先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。

然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗，最后通过二抗上带标记化合物（一般为碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。

根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。

Western杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白[6]。

然后也可对已获得的目的蛋白进行蛋白序列的分析。

通常使用专一化学试剂或具有不同水解专一性蛋白酶，得到有可能重叠的序列的肽段，从而推断出蛋白的氨基酸序列。

蛋白质的一级结构是其高级结构的基础，因此，蛋白质序列分析对于获得有关高级结构的信息是一个很有用的基础[7]。

2材料、主要试剂及主要仪器

2.1实验材料

2.1.1拟南芥培养[8]

⑴培养前预处理：

拟南芥（Arabidopsisthaliana，哥伦比亚野生型）种子用70%乙醇浸泡2min后，无菌水漂洗1次，再用3.5％次氯酸钠浸泡10～15min，无菌水漂洗5次，播种于MS培养基上，放入4℃冰箱中春化3天；

⑵春化后的拟南芥种子放入生长箱中培养，生长7天左右（培养箱温度周期为22℃（昼）/18℃（夜），光周期为12h（光）/12h（暗），光强为120～130μmol。

2.1.2培养拟南芥愈伤组织[9]

⑴挑选大而饱满的具有发芽能力的成熟种子，采取两步消毒法。

剥胚前用75%酒精中浸1min，再用0.1%升汞消毒8min，无菌水冲洗5～6次。

在超净台内用镊子和解剖针仔细剥取胚，成熟胚盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基上。

⑵愈伤组织的诱导

将成熟胚每瓶接种5粒，接种后在黑暗条件下培养，温度为18℃，3～7天后，开始产生愈伤组织，15天后明显增大，统计愈伤组织诱导率。

⑶愈伤组织培养调控

愈伤组织最初多呈水浸状，质量较差，经过改良继代，其表面长出白色或黄色的愈伤组织，并迅速增殖。

愈伤组织20天继代1次，每瓶接3块，接种培养40天后观察愈伤状态。

愈伤组织的诱导和试管苗的分化在诱导培养基上培养1周，叶段和茎段的切口处开始膨大，两周后愈伤组织生长良好，表面呈粒状，局部变绿，18℃储藏以备用。

2.2主要试剂及药品

2.2.1溶液的配制[10-16]

2.2.1.1MS培养基

MS培养基配方：

大量元素（母液Ⅰ）        mg/L

NH4NO3                     33000

KNO3                       38000

CaCl2·2H2O             8800

MgSO4·7H2O             7400

KH2PO4                     3400

微量元素（母液Ⅱ）mg/L

KI                      166

H3BO3                      1240

MnSO4·4H2O              4460

ZnSO4·7H2O            1720

Na2MnO4·2H2O           50

CuSO4·5H2O             5

CoCl2·6H2O             5

铁盐（母液Ⅲ）mg/L

FeSO4·7H2O             5560

Na2-EDTA·2H2O          7460

有机成分（母液Ⅳ）mg/L

肌醇                     20000

烟酸                      100

盐酸吡哆醇（维生素B6）       100

盐酸硫胺素（维生素B1）       100

甘氨酸                    400

其中诱导培养基附加植物激素IAA0.5－2mg，分化培养基附加6BA0.5-1mg，IAA0.5mg，蔗糖20g，琼脂1.2%，pH5.8。

2.2.1.2蛋白提取液1——PBS溶液

称取NaCl0.8006g，KCl0.02012g，KH2PO40.02722g，Na2HPO40.