甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因的烟草转化及转基因植株的鉴定.docx
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甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因的烟草转化及转基因植株的鉴定
甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因的烟草转化
及转基因植株的鉴定
摘要：
本工作利用已构建的pET（CmPP）质粒为模板，再扩增甲基戊糖梭菌膜整合焦磷酸酶基因CmPP，然后通过酶切克隆到质粒pBI121中，构建了植物表达载体pBI121（CmPP），并将其转化到根癌农杆菌LBA4404中。
通过农杆菌侵染的叶盘转化法和多重PCR鉴定，获得了阳性CmPP转基因烟草植株。
关键词：
甲基戊糖梭菌，膜整合焦磷酸酶，农杆菌转化，转基因烟草
Tobaccotransformationofthemembrane-integralpyrophosphatasegeneofClostridiummethylpentosumandidentificationofthetransgenictobaccoplants
Abstract:
Inthiswork,usingtheconstructedplasmidpET（CmPP）asDNAtemplate,themembrane-integralpyrophosphatasegeneCmPPofClostridiummethylpentosumwasre-amplified,andsubclonedintotheplasmidpBI121byenzymedigestiontocreatetheplantexpressionvectorpBI121（CmPP）thatwasfurthertransformedintotheAgrobacteriumtumefaciensstrainLBA4404.ThroughtheleafdisctransformationbyAgrobacteriuminfectionandmultiplePCRidentification,thepositivetransgenictobaccoplantsofCmPPgenewereobtained.
Keywords:
Clostridiummethylpentosum,membrane-integralpyrophosphatase,Agrobacteriumtransformation,transgenictobacco
1前言
膜整合焦磷酸酶（简称膜PPase）是焦磷酸（PPi）储备能量转移和利用的动员蛋白，用以维持阳离子梯度进而帮助细胞在胁迫条件下存活[1-4]，与生物体的逆境适应密切相关[5-10]。
膜PPase根据其转运离子的特异性可分为Na+-PPase、Na+,H+-PPase和H+-PPase三个亚家族，其中以Na+-PPase作为膜PPase的进化始祖，它们在高级结构和功能关键残基上具有高度的保守性[11,12]。
另外，膜PPase根据其活性是否需要K+激活而总体上可划分为K+依赖型和K+非依赖型两大类[13]。
具有H+泵活性的膜H+-PPase广泛存在于包括古生菌、真细菌、植物和原生动物在内的生物三界中，发现最早，研究得最早和最多[2]，特别是近十五年来在构建抗逆生物尤其是植物方面的应用已十分引人瞩目，过表达H+-PPase的各种转基因植物在诸多逆境条件（如高盐、干旱、磷或氮营养亏缺等）下表现出增强的抗性或耐受性[14-20]。
相比较，其它两个亚家族PPase（Na+-PPase和Na+,H+-PPase）几年前或最近仅在原核生物（主要是一些极端环境（如高盐、缺氧）下的古生菌和细菌）中发现[3,4]，不仅暗示出它们对原始生物体应对早期地化环境（当前还有遗存）的重要性，同时也一致性印证了H+-PPase对现世植物适应逆境的关键作用。
它们具有Na+泵活性和直接的排Na+作用以及在创建抗盐转基因生物的巨大应用潜力。
但是，关于它们的功能验证和应用研究目前还几乎没有明确的报道。
本工作特地针对人肠道甲基戊糖梭菌的膜整合PPase（CmPP，推测是Na+,H+-PPase亚家族成员），将其基因转化到烟草中以分析它在转基因烟草的抗盐效果，为后续进一步将它应用于主要农作物的抗逆（盐）基因工程打下必要的基础。
2材料与方法
2.1实验材料
植物实验材料：
烟草品种为NicotianatabacumXanthi，种子由本实验室提供，取其一个月大的无菌苗叶片作为转化外植体。
宿主菌及载体：
本工作所用大肠杆菌菌株DH5α、植物载体pBI121、根癌农杆菌LBA4404均为本实验室保存。
2.2主要试剂和耗材
2.2.1生化和分子生物学试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶、DreamTaqDNA聚合酶等购于ThermoScientificFermentas公司。
蛋白胨、酵母提取粉等购于生工生物技术有限公司。
氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术公司。
常用试剂盒如胶纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒，溶液纯化试剂盒、植物基因组DNA提取试剂盒由北京天根公司提供。
2.2.2激素与抗生素
（1）a-萘乙酸（NAA）：
用95%的酒精溶解后，加水定容，配制成0.2mg/mL的母液，用0.22μm滤膜过滤灭菌后于4℃保存。
（2）6-苄氨基嘌呤（6-BA）：
用2M的氢氧化钠溶解后，加水定容，配制成2mg/mL的母液，用0.22μm滤膜过滤灭菌后保存于4℃。
（3）羧苄青霉素（Car）：
储存浓度为250mg/mL，称取2.5g的药品溶解在无菌水中，定容到l0mL后用0.22μm滤膜过滤灭菌，保存在-20℃。
（4）链霉素（Str）：
125mg/mL，将1.25克药品溶解于无菌水中，定容至l0mL后用0.22μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存。
（5）卡那霉素（Kan）：
100mg/mL，称取1g的药品溶解到无菌水中，定容到l0mL后用0.22μm的滤膜小心过滤灭菌，-20℃保存。
2.2.3培养基的配制
（1）YEB培养基（用于农杆菌的培养）：
配制1L，加酵母提取物1g、蛋白胨5g、牛肉膏5g、蔗糖5g、硫酸镁0.5g，将pH调为7.0，每升固体培养基加20g琼脂粉，高压灭菌后备用。
（2）MS培养基（用于烟草的培养），按表4.1配制6种母液：
表4.1MS培养基母液的配制
母液
成分
用量（g）
定容（mL）
每升用量（mL）
母液1（50倍）
NH4NO3
8.25
100
20
KNO3
9.5
MgSO4∙7H2O
1.85
母液2（100倍）
无水CaCl2
3.3224
100
10
母液3（100倍）
KH2PO4
1.7
100
10
母液4（100倍）
Na2∙EDTA
0.373
100
10
FeSO4∙7H2O
0.278
母液5（1000倍）
H3BO3
0.62
100
1
MnSO4∙H2O
1.69
ZnSO4∙7H2O
0.86
KI
0.083
Na2MO4∙2H2O
0.025
CuSO4∙5H2O
0.0025
CoCl2∙6H2O
0.0025
母液6（200倍）
肌醇
20
100
5
甘氨酸
0.4
烟酸
0.1
盐酸吡哆醇（VB6）
0.1
盐酸硫胺素（VB1）
0.02
注：
将药品分别用少量蒸馏水溶解后，混匀，加蒸馏水并定容至所需体积；1L培养基中需加入30g蔗糖，固体培养基每升加7g琼脂粉；固体和液体培养基的pH均为5.8。
（3）LB（Luria-Bertain）培养基，用于大肠杆菌的培养。
配制方法（1L）：
称取10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，溶于900mL去离子水中，用5M的NaOH调节pH值至7.0-7.2，用去离子水定容至1L。
分装后于121℃高温高压灭菌30min后室温保存，开封后4℃保存。
如果是固体培养基则调整pH值后按15g/L加入适量琼脂粉再定容和灭菌。
2.3实验方法
2.3.1植物基因组DNA的提取
参照TIANGEN公司的新型植物基因组DNA提取的试剂盒说明书进行：
（1）材料处理：
称取100mg新鲜植物组织或干重组织20mg，加入少量液氮研磨充分。
把400μLLP1缓冲液和6μL浓度为10mg/mLRNaseA加入到材料中，振荡旋涡1min，在室温下放置10min。
（2）加入130μL缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡1min。
（3）12,000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中。
（4）把1.5倍体积的缓冲液LP3（使用前已加入无水乙醇）加到离心管中，立刻振荡15sec，混匀，振荡后也许会有絮状沉淀出现。
（5）把上一步得到的溶液连同絮状沉淀一起都加一个新的吸附柱CB3中，12,000rpm的转速，室温下离心30sec，将废液倒掉，并把吸附柱CB3放入干净的收集管中。
（6）把600μL的漂洗液PW加入到CB3中（使用前经检查已加入无水乙醇），12,000rpm的转速，室温下离心30sec，将废液倒掉，并把吸附柱CB3放入干净的收集管中。
注意：
如果漂洗后吸附柱膜依然呈现绿色，要将500μL的无水乙醇加入到吸附柱CB3中加入，12,000rpm的转速，室温下离心30sec，将废液倒掉，并把吸附柱CB3放入干净的收集管中。
（7）重复操作（6）。
（8）将CB3吸附柱放回到收集管中，12,000rpm离心2min，将废液倒掉。
把CB3吸附柱静止放在室温下几分钟，彻底晾干漂洗液。
（9）把CB3吸附柱转移到一个干净的离心管中，向吸附柱中央悬空加入适量水。
室温下放置2~5min后，12,000rpm离心2min，把洗脱下来的溶液收集到离心管中。
2.3.2烟草种子的消毒及无菌苗的培养
（1）将适量烟草种子置于灭过菌的1.5mL离心管中，用无菌水冲洗干净；
（2）加入适量75%的乙醇，对种子进行表面消毒30s，其间不断用枪头吹吸；
（3）用无菌水冲洗一次；
（4）向离心管中加入适量10%的双氧水，对烟草种子进行彻底消毒10min，其间不断用枪头吹吸；
（5）用无菌水冲洗5次，吸出多余的水，将离心管置于超净工作台吹干；
（6）将种子转接到MS基本培养基上培养2~3周，培养条件为：
温度26℃，光照强度1500Lux，16h光照/8h黑暗。
（7）剩余的种子封装好放于4℃保存备用。
2.3.3农杆菌感受态细胞的制备
（1）-80℃保存的农杆菌LBA4404解冻后，取少量于YEB培养基（含125mg/LStr）平板上划线，28℃培养2天左右。
（2）挑取单菌落接种于3mLYEB培养基（含125mg/LStr），28℃，180rpm振荡培养过夜。
（3）按1:
100的比例取过夜培养物接种于新鲜YEB培养基（含125mg/LStr）中，28℃，180rpm振荡培养至OD600=0.45左右。
（4）将菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰浴30min，4℃，5000rpm离心5min。
（5）用10mL冰冷的0.15mol/L的NaCl溶液悬浮沉淀4℃，5000rpm离心5min，弃尽上清。
（6）冰浴中用1mL0.02mol/L的CaCl2溶液（含终浓度15%的甘油）轻轻悬起细胞，即用、或100μL/管分装好后液氮速冻并于-80℃保存备用。
2.3.4CmPP植物转化载体的构建
2.3.4.1插入片段CmPP（SS）的制备
（1）片段CmPPSm的扩增
扩增体系如下：
组分
体积（μL）
10×PfuBufferwithMg2+
5
2.5×dNTPMix（2mMeach）
4
引物CmPP-5Sm（25μM）
1
引物Tt7Dw-Rv（25μM）
1
模板：
适当浓度的pET（CmPP）质粒
1
PfuDNA聚合酶（5U/μL）
0.5
无菌水
37.5
程序：
步骤
温度（℃）
时间
循环数
预变性
95
5min
1
变性
94
30s
1
退火
49
30s
延伸
72
5min
变性
94
30s
35
退火
56
30s
延伸
72
5min
最后延伸
72
10min
1
胶回收PCR产物，纯化后片段取名为CmPPSm。
（2）用SacI完全酶切CmPPSm，胶回收约2.1kb的片段（不要~0.2kb的小片段），取名为CmPP（SS），作为插入片段。
2.3.4.2载体片段pBI121（SS）的制备
（1）将植物载体pBI121转化到大肠杆菌DH5中，摇菌，提取质粒，取1μL用琼脂糖凝胶电泳检测。
（2）将植物载体pBI121的DNA用SmaI、SacI双酶切完全（切出来两个片段12.9kb、1.9kb），胶回收约12.9kb的大片段，取名为pBI121（SS）。
2.3.4.3连接、转化及鉴定
（1）将片段pBI121（SS）和CmPP（SS）进行连接
组分
体积（μL）
pBI121（SS）
10（20~00ng）
CmPP（SS）
13（与载体DNA的摩尔比（1:
1~10:
1））
10×T4DNA连接缓冲液
3
T4DNA连接酶
1
ddH2O
3
轻轻混匀，22℃孵育30min~2h，取5μL连接产物转化DH5。
注：
PCR产物的5’平端能跟载体SmaI酶切的平端连接，PCR产物的3’端经SacI酶切的粘性末端能跟载体SacI酶切的粘性末端连接。
（2）菌落PCR鉴定：
随机从转化平板中挑取单菌落，做菌夜PCR，用基因本身引物引物CmPP-5Nd、CmPP-3Sc；PCR大小约2.1kb；阳性重组载体取名为pBI121（CmPP）。
（3）提取pBI121（CmPP）的质粒，取1μL用琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行酶切鉴定（SmaI、SacI分别单切，大小约为15Kb；XbaI/SacI双酶切会产生两片段12.9kb，2.1kb）。
2.3.5质粒pBI121（CmPP）转化农杆菌感受态细胞及转化子鉴定
（1）农杆菌感受态细胞LBA4404100μL于冰上解冻后，加入质粒pBI121（CmPP），轻轻混匀，冰浴30min。
（2）37℃水浴5min，冰浴2min。
（3）于超净工作台上加入800μL28℃保温的新鲜YEB培养基，28℃,110rpm培养3~5h。
（4）1000rpm离心30s。
（5）弃上清，用100μLYEB培养基重悬菌体，涂布于含抗生素（50mg/LKan和125mg/LStr）的YEB平板上，静置30min后，于28℃恒温培养箱中培养2天左右。
（6）转化子鉴定：
随机挑取YEB平板上的农杆菌单菌落进行菌液PCR。
2.3.6用于转化烟草的农杆菌的培养
（1）挑取已鉴定的pBI121（CmPP）转农杆菌LBA4404的阳性克隆，于3mLYEB培养基（50mg/LKan和125mg/LStr），28℃、180rpm振荡培养过夜。
（2）按1:
100的比例取过夜培养物接种于新鲜50mLYEB培养基（50mg/LKan和125mg/LStr）中，28℃、180rpm振荡培养至OD600=0.45左右。
（3）将菌液转移至预冷的100mL离心管中，4℃、12000rpm离心5min。
（4）用1/2MS培养基溶液悬浮沉淀，并将悬浮液全部转移至100mL预先灭好菌的蓝盖试剂瓶中，置于超净台备用。
2.3.7烟草叶盘法转化及转基因烟草的无菌培养
（1）将烟草无菌苗的优质叶片用灭过菌的小刀切去中脉和叶缘，把剩下的叶片切成0.6~0.8cm×0.6~0.8cm的大小均匀的小叶片。
（2）将切好的叶片用灭过菌的镊子小心的转移到制备好的农杆菌菌液中，不断的轻轻缓慢侵染振荡5min。
（3）用灭过菌的镊子小心的将小叶盘夹到事先备好的无菌水中，轻轻洗去表面的多余菌液。
（4）用镊子将叶盘夹到灭菌过的滤纸上，吸干残留在叶片上的无菌水及菌液。
（5）将小叶片转移到共培养培养基（MS固体培养基+1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA）上，培养基表面先加上一层事先灭好菌的滤纸，把叶片的正面向上，小心放到滤纸上，用封口膜把培养皿封好，于28℃暗培养3天。
（6）滤菌培养：
将叶盘从共培养培养基转移到滤菌培养基（MS固体培养基+1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA+500mg/LCar）上，在26℃、光照强度1500Lux、16h光照/8h黑暗的条件下培养5天。
（7）选择培养：
将外植体从滤菌培养基转移到选择培养基（MS固体培养基+1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA+100mg/LKan）上，在26℃、光照强度1500Lux、16h光照/8h黑暗的条件下培养20天。
（8）继代培养：
把长出大量愈伤组织的优质的抗性外植体用小刀小心分割成小块后，用灭过菌的镊子转入到继代培养基（MS固体培养基+1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA+100mg/LKan+300mg/LCar）中，在26℃、光照强度1500Lux、16h光照/8h黑暗的条件下培养。
（9）生根培养：
等到筛选的抗性芽长到l。
2~1.5cm的时候，切下抗性下，并转到生根培养基（MS固体培养基+0.1mg/LNAA+100mg/LCar）上诱导生根，在26℃、光照强度1500Lux、16h光照/8h黑暗的条件下培养25天左右，获得具有卡那霉素抗性的转基因烟草植株。
2.3.8CmPP转基因烟草植株的鉴定
（1）按2.3.1的方法提取卡那霉素抗性烟草转化再生植株的基因组DNA。
（2）PCR检测：
采用3对引物，对烟草转化再生植株进行鉴定，引物对：
CmPPm-Fw/CmPPm-Rv，CmPPm-Fw/NosTer-Rv，35SPro-Fw/CmPPm-Rv。
反应体系如下：
组分
体积（μL）
10×EasyTaqBufferwithMg2+
2.5
2.5×dNTPMix（2mMeach）
2
-Fw（25μM）
0.5
-Rv（25μM）
0.5
模板：
基因组DNA（10pg~1μg）
0.5
EasyTaq酶（5U/μL）
0.25
无菌水
18.75
程序：
步骤
温度（℃）
时间
循环数
预变性
95
5min
1
变性
94
30s
30
退火温度
55
30s
延伸
72
1min40s
最后延伸
72
10min
1
3结果
3.1CmPP植物转化载体的制备
以质粒pET（CmPP）为模板，采用Pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增条带大小正确，约为2.3kb（图1A）。
将PCR产物进行胶回收后，电泳检测浓度约为25ng/μL（图1B）。
对回收后的PCR产物用SacI酶切完全，胶回收约2.1kb的片段（图1C），取名为CmPP（SS），另外酶切会产生一个约0.2kb的微弱小片段。
ABC
图1CmPP基因酶切片段的制备
A：
CmPP再扩增；B：
胶回收CmPP扩增产物；C：
SacI酶切CmPP扩增产物
提取植物载体pBI121的质粒DNA，由于该载体拷贝数较低，所以提出的质粒浓度较低，约20ng/μL（图2A）。
将质粒pBI121用EcoRI进行单酶切鉴定，酶切后大小约为15kb；用SmaI/SacI、XbaI/SacI进行双酶切鉴定，均切出两个片段12.9kb、1.9kb；结果验证了pBI121质粒的正确性，可用于后续实验（图2B）。
取一定量的pBI121质粒，用SmaI和SacI双酶切完全（图2C），胶回收12.9kb的片段，取名为pBI121（SS），电泳检测回收后的浓度较低，约为10ng/μL（图2D）。
ABCD
图2载体pBI121酶切片段的制备
A：
pBI121质粒的提取；B：
pBI121酶切鉴定；C：
SmaI和SacI双酶切pBI121；D：
双酶切产物回收检测
将酶切片段pBI121（SS）和CmPP（SS）进行连接，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，随机挑取转化菌落进行菌液PCR，挑取的4个克隆有1个是阳性，条带大小正确，约为2.1kb（图3A）。
将鉴定出的阳性克隆摇菌并提取质粒（图3B）。
对重组质粒进行酶切鉴定：
SmaI、SacI分别单切（大小约为15kb），XbaI/SacI双酶切产生两片段12.9kb、2.1kb（图3C），结果说明了重组质粒pBI121（CmPP）的正确性。
对重组质粒转化农杆菌的菌落进行菌液PCR，所挑选的2个菌落均为阳性，条带大小正确，约为2.1kb（图3D）。
ABCD
图3植物载体pBI121（CmPP）的构建和农杆菌转化
A：
pBI121（CmPP）菌液PCR鉴定；B：
pBI121（CmPP）质粒提取；C：
pBI121（CmPP）酶切鉴定；D：
pBI121（CmPP）农杆菌转化子PCR鉴定
3.2CmPP基因的烟草叶盘法转化及无菌培养
烟草小叶片在共培养培养基（MS固体培养基+1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA）上于28℃暗培养3天后，由于没有光照，叶片微微泛黄，叶片吸取了培养基中的水分后，表面积比暗培养之前变大。
将叶盘从共培养培养基转移到滤菌培养基（MS固体培养基+1mg/L6-BA，0.1mg/LNAA+500mg/LCar）上，在26℃、光照强度1500Lux、16h光照/8h黑暗的条件下培养5天（图4A）。
将外植体从滤菌培养基转移到选择培养基（MS固体培养基+1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA+100mg/LKan）上，在26℃、光照强度1500Lux、16h光照/8h黑暗的条件下培养。
在选择培养基中培养14天左右，农杆菌无污染，但烟草外植体只出现零星小芽；到20天左右，烟草外植体出现大量绿色小芽，农杆菌依然能够很好地得到抑制（图4B）。
将长出大量愈伤组织的抗性外植体分割成小块后转入继代培养基（MS固体培养基+1mg/L6-BA、0.1mg/LNAA+100mg/LKan+300mg/LCar）中，在26℃、光照强度1500Lux、16h光照/8h黑暗的条件下培养。
培养20天左右，抗性芽长至l~1.5cm（图4C）。
将茎较长的抗性芽切下并转入生根培养基（MS固体培养基+0.1mg/LNAA+100mg/LCar）上诱导生根，在26℃、光照强度1500Lux、16h光照/8h黑暗的条件下培养25天左右，获得具有卡那霉素抗性的烟草转化再生植株（图4D）。
图4CmPP基因转化烟草的培育过程
A：
滤菌培养；B：
选择培养；C：
继代培养；D：
生根培养
3.3CmPP转基因烟草植株的鉴定
选取17株CmPP转化烟草再生植株（1-17）和野生型植株（WT），按2.3.1的方法提取基因组DNA，取1μL电泳检测，结果如图5A所示。
以所提基因组DNA为模板，用EasyTaq酶及3对引物鉴定转基因植株：
引物CmPPm-Fw、CmPPm-Rv分别为CmPP基因内部的上、下游引物，引物35SPro-Fw为载体pBI121上CaMV35S启动子引物，NosTer-Rv为载体pBI121上Nos终止子
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