22 动物细胞工程.docx

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22动物细胞工程

2.2动物细胞工程

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【学习目标】

1.简述动物细胞培养的过程、条件及应用。

2.简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景。

3.举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。

【重点难点】

1.教学重点：

（1）动物细胞培养的过程及条件。

（2）用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。

（3）单克隆抗体的制备和应用。

2.教学难点：

（1）用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。

（2）单克隆抗体的制备过程。

【学法指导】复习好细胞工程相关知识,学好植物细胞工程,认真阅读课文,自主完成导学案,关注重难点。

【知识联系】本节内容与细胞的有丝分裂、细胞分化、细胞的全能性、遗传等知识密切相关，也是学习胚胎工程的基础。

【问题情境】大面积烧伤病人，怎样才能获得自体健康皮肤进行皮肤移植？

克隆羊多利是怎样产生的？

什么叫做单克隆抗体？

单克隆抗体药物是如何制备的？

【基础梳理】

动物细胞工程常用的技术手段有、、、等，其中是其他动物细胞工程技术的基础。

一、动物细胞与组织培养

1、概念

⑴材料：

取自动物或出生不久的动物的器官或组织。

⑵场所：

生物，并模拟动物环境。

⑶条件：

充足、适宜和无菌条件、适宜pH等。

⑷目的：

使动物细胞或组织继续、并维持原有和。

2、过程

⑴动物细胞培养：

①概念：

就是从动物机体中取出相关的，将它分散成，然后放在适宜的中，让这些细胞。

②过程：

【积极思维】

①为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？

这些组织或器官上的细胞，。

②为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？

用酶消化的是什么物质？

③动物组织或细胞培养的难易程度：

幼体组织或细胞老龄组织或细胞；分化程度低的组织或细胞化程度高的组织或细胞。

④胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？

为什么？

⑤进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？

用胃蛋白酶行吗？

⑥为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？

【相关概念】

①细胞贴壁：

将细胞悬液放入培养瓶内，悬液中分散的细胞很快就贴附在上，称为细胞贴壁。

（培养贴附性细胞时，要能够贴附于底物上才能生长增殖。

这就要求培养瓶或培养皿的内表面、

，易于贴附。

）

②接触抑制：

细胞在培养瓶中生长，细胞进行分裂，数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

③原代培养：

通常将称为原代培养。

原代培养的细胞分裂，

一般表现为生长和。

由于组织或细胞刚刚离体，细胞的特性未发生很大变化，这一阶段中，培养的细胞最接近于体内组织活细胞的生长特性，很适合用于、基因表达等实验研究。

④传代培养：

贴满瓶壁的细胞需要重新用等处理，然后继续培养，让细胞继续增殖。

这样的培养过程称为传代培养。

⑤细胞株：

指细胞培养过程中存活代到代的细胞。

⑥细胞系：

指动物细胞培养过程中存活超过代的细胞，细胞系细胞的（或遗传物质）改变，带有的特点，能在培养条件下传代。

⑦动物组织培养：

与动物细胞培养的方法类似，主要区别是动物细胞培养过程中需要使用等使组织块中的细胞离散，而动物组织培养过程中不需要。

⑧消毒：

是利用物理、化学等方法杀死病原微生物以防止传染病传播的措施。

灭菌：

是指把物体上所有的微生物（包括细菌芽孢在内）全部杀死的方法，通常用物理方法来达到灭菌的目的。

⑨合成培养基：

是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的，其所含的成分（包括微量元素在内）以及他们的量都是确切可知的。

具有、便于的特点。

天然培养基：

是含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物。

天然培养基主要取自动物

、、。

具有，的特点。

3、动物细胞培养的条件

①的环境：

首先应保证被培养的细胞处于的环境，对培养液和所有培养用具应进行处理；通常还要在培养液中添加一定量的，以防培养过程中的。

此外，应定期更换，以便清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。

②营养：

细胞体外培养所需营养物质与体内基本相同。

可使用天然培养基，主要取自动物、

和等。

也可使用合成培养基，动物细胞培养液的成分有葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。

由于缺乏天然培养基中的某些无法替代的成分，在合成培养基中通常需加入一定量的动物、等一些天然成分。

动物细胞培养基的特点：

培养基、含动物。

③温度和pH：

适宜温度：

哺乳动物多以℃为宜；多数细胞适宜pH为。

④气体环境：

细胞培养所需气体主要有和，O2是所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的。

通常采用培养皿或，将其置于含95%加5%的混合气体的培养箱中进行培养。

4、动物细胞培养技术的应用

①生产生物制品：

如疫苗、、干扰素等。

②应用于基因工程：

为基因工程技术提供；

③用于检测有毒物质：

判断物质的。

④用于、、等方面的研究：

如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。

⑤用于皮肤移植：

利用动物细胞培养技术中的细胞生长和的特点，可用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞，以供植皮所需。

5、动物细胞培养、植物细胞培养比较：

项目

动物细胞培养

植物组织培养

原理

细胞来源

或动物组织或器官

离体植物、或

培养基

合成培养基；主要成分有：

葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清

合成培养基；主要成分有：

矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素、有机添加物

器皿

培养瓶、培养皿

锥形瓶

过程

生长特点

，，细胞增殖，不分化

诱导形成愈伤组织，细胞增殖、分化

细胞进行异养需氧代谢

接种前处理

灭菌、用使组织分散成单个细胞

灭菌

培养条件

恒温、无菌、适宜的温度、PH等，

无需光照

常温、无菌、适宜的温度、PH等，

再分化需要条件

培养目的

生产蛋白质生物制品；检测有毒物质；用于病理、药理、生理研究；皮肤移植等。

快速繁育无病毒植株；制备人工种子；生产药物、食品添加剂、香料、色素、杀虫剂等。

培养结果

细胞株→细胞系

愈伤组织→植株

二、动物体细胞核移植技术与克隆动物

1、概念：

动物核移植是将动物的一个细胞的移入一个已经去掉卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的。

这个新的胚胎最终发育为动物个体。

用核移植的方法得到的动物称为动物。

2、原理：

动物的具有全能性

3、分类：

①胚胎细胞核移植（分化程度，恢复其全能性相对）

②体细胞核移植（分化程度，恢复其全能性相对）

4、体细胞核移植的过程

⑴以克隆高产奶牛为例

⑵体细胞核移植的一般过程

【积极思维】

①在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？

为使核移植的胚胎或动物的全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。

②受体细胞为时期的细胞，此时期的细胞为次级卵母细胞，与第一极体同时存在，去核要同时去除第一极体。

注入受体细胞的是。

③用于核移植的供体细胞一般都选用传10代以内的细胞，这是为什么？

培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞可能会发生变化，其细胞

可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持。

因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。

④你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？

为什么？

克隆动物DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的，即线粒体中的是来自于受体卵母细胞。

所以，克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。

⑤动物体细胞核移植过程用到的具体技术有、动物细胞融合、早期胚胎培养、胚胎移植。

该过程有细胞融合体现了：

生物膜的特点。

动物体细胞核移植技术形成重组细胞发育成一个新个体，体现的是的全能性而非动物细胞的全能性。

【特别关注】克隆及动物体细胞移植的特点

克隆：

就是无性繁殖，就是从一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。

克隆需要以下条件：

①具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞；②能有效调控细胞核表达全能性的物质和营养条件（如去核的卵细胞）；③完成胚胎发育的必要环境条件（如诱导核质重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）。

动物体细胞核移植依据的原理还是细胞的全能性，与植物组织培养一样属于无性生殖。

虽然细胞核内具有发展成为一个完整个体所需的全套基因，但动物体细胞分化程度较高，因此很难表达全能性。

卵细胞体积大，易于操作，含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。

将体细胞核移植入去核卵细胞内，既保证了重组细胞的完整性，又能刺激体细胞核表达其全能性，发展成为一个新的个体。

动物体细胞移植产生的新个体的亲本有三个：

体细胞核供体、卵细胞细胞质供体、代孕母体。

新个体细胞核基因型与体细胞核供体完全一样，因此新个体性状与体细胞核供体基本相同。

卵细胞细胞质中也有少量的DNA，新个体性状与卵细胞细胞质供体有一些地方相同。

代孕母体没有为新个体提供遗传物质，新个体性状与代孕母体基本没有联系。

5、体细胞核移植技术的应用前景

①在畜牧生产中：

可以加速优良种畜进程；促进优良畜群。

②濒危物种保护：

可增加这些动物的。

③在医药卫生方面：

转基因克隆动物可作为生产医用蛋白。

④在治疗人类疾病方面：

转基因克隆动物细胞、组织、器官可作为的供体。

⑤人的核移植胚胎干细胞经诱导分化后提供相应组织、器官，可用于。

⑥克隆动物和克隆细胞可使人类深入研究及过程。

⑦克隆动物做疾病模型，疾病的发展过程和疾病。

6、体细胞核移植技术存在的问题

①非常低；

②绝大多数克隆动物存在、、缺陷等；

③克隆动物食品的存在争议。

【练习巩固】：

1、下列有关动物细胞培养的叙述中正确的是（）

A.动物细胞培育的目的是获得大量的细胞分泌蛋白

B.动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散

C.细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡过程中

D.培养至50代后的传代细胞称为细胞株

2、一般来说，动物细胞体外培养需要满足以下条件（）

①无毒的环境；②无菌的环境；③合成培养基需加血浆；④温度与动物体温相近；⑤需要O2，不需要CO2；⑥CO2能调培养液pH

A.①②③④⑤⑥B.①②③④C.①③④⑤⑥D.①②③④⑥

3、动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于（）

A.培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；

C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；

D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。

4、一只羊的卵细胞核被另一只羊的体细胞核置换后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。

这种克隆技术具有多种用途，但是不能（）

A.有选择地繁殖某一性别的家畜B.繁殖家畜中的优秀个体

C.用于保存物种D.改变物种的基因型

5、从母羊甲的体细胞中取出细胞核，注入到母羊乙去掉核的卵细胞中，融合后的细胞经卵裂形成早期胚胎，再植入到另一只母羊丙的子宫内，出生小羊的大多数性状（）

A.难以预测B.像甲C.像乙D.像丙

6、在动物细胞培养过程中，使用胰蛋白酶的目的是（）

A.使动物组织分散为单个细胞进行培养B.去掉细胞壁成为原生质体

C.去掉细胞膜暴露出原生质体便于细胞融合D.促进蛋白质水解为多肽

7、世界第一只克隆绵羊“多利”的培养程序如下图所示，请看图回答：

⑴写出图中a、b所指的细胞工程名称：

。

⑵实施细胞工程a时，所需的受体细胞大多采用动物的卵细胞的原因是：

。

⑶“多利”面部的颜色是，请根据遗传学原理说明判断依据：

。

⑷继植物组织培养之后，克隆绵羊的培育成功，证明动物细胞的细胞核也具有。

⑸请举一例，说明克隆绵羊培育成功的实际意义。

三、动物细胞融合

1、概念：

动物细胞融合也称细胞杂交，是指或动物细胞结合形成的过程。

2、原理：

，与植物原生质体融合的原理基本相同。

3、方法：

与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有、、电刺激等。

4、操作步骤：

细胞准备→细胞融合→杂种细胞选择→杂种细胞克隆

5、结束标志：

（发生在杂种细胞的有丝分裂过程中）。

6、结果：

融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的，称为。

7、意义：

克服了的不亲和性，成为研究、、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。

主要利用制造单克隆抗体。

8、动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：

比较项目

植物体细胞杂交

动物细胞融合

原理

和

和

融合前的处理

酶解法去除获得原生质体

酶处理使组织分散成

使用的酶

、

诱导融合方法

物理法：

、、电刺激

化学法：

等试剂诱导

除应用物理法和化学法外，也可用生物法：

诱导

过程

细胞A、B

↓去壁

原生质体A、B

↓诱导融合

融合的原生质体

↓再生出细胞壁

杂种细胞

↓组织培养

杂种植株

细胞A、B

↓融合

杂交细胞

↓有丝分裂

多个相同的杂交细胞

结果

获得

获得

应用

培育植物新品种

主要用于制备

意义

克服了的障碍，打破了生殖隔离，扩展了杂交的亲本组合范围

四、单克隆抗体

1、传统抗体的获得

⑴抗体产生：

由合成分泌，每一个B淋巴细胞只能分泌特异性抗体。

⑵方法：

向动物体内反复注射某种，使动物产生，然后，从动物中分离出所需抗体。

⑶特点：

、、。

⑷解决思路：

要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的细胞，形成细胞群。

⑸存在的问题：

一个B淋巴细胞不可能。

2、单克隆抗体的制备----1975年，英国科学家和，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体成功。

（1）单克隆抗体的制备过程：

【请在此空白处绘制制备过程流程图】

①产生特异性抗体的B淋巴细胞的制备：

向免疫小鼠体内注射特定的，然后从小鼠的内获得相应的B淋巴细胞。

②杂交瘤细胞的获得：

将鼠的与脾脏中形成的融合，用特定的选择培养基筛选出。

该杂种细胞既能，又能。

③细胞培养和抗体检测

④杂交瘤细胞的或注射到增殖。

⑤提取单克隆抗体：

从或小鼠的中提取。

（2）单克隆抗体技术：

将产生抗体的单个细胞同细胞杂交，获得既能产生，又能

的杂种细胞，并以此生产抗体。

（3）单克隆抗体：

由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

是由B淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。

（4）单克隆抗体的优点：

高，高，灵敏度高，强。

（5）单克隆抗体的作用：

①作为诊断试剂：

准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有、

、、快速的优点。

如用单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，灵敏度很高，在妊娠第8天就可以作出诊断。

②用于治疗疾病和运载药物：

主要用于治疗，也有少量用于治疗其它疾病。

如果把抗癌细胞的跟放射性同位素、化学药物或细胞毒素相结合，制成“生物导弹”，注入体内，借助的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。

这样既不损伤，又减少了用药剂量。

生物导弹的“瞄准装置”是，“炸药”是，是一种、的新型药物。

【特别关注】1、植物体细胞杂交和单克隆抗体制备的比较

比较项目

植物体细胞杂交

动物细胞融合（单克隆抗体制备）

原理

、

、

前期处理

法去除细胞壁（纤维素酶、果胶酶）

注射特定，免疫处理正常小鼠

促融方法

（1）物理法：

离心、振动、等

（2）化学法：

（1）物化法：

与植物细胞融合相同

（2）生物法：

灭活的

过程

原生质体的制备（酶解法）

正常小鼠免疫处理

原生质体的融合（物理、化学法）

动物细胞的融合（物理、化学、生物法）

杂种细胞的筛选和培养

杂交瘤细胞的筛选与培养

杂种植株的诱导与鉴定

单克隆抗体的提纯

用途意义

（1）克服远缘杂交的不亲和障碍，大大扩展杂交的亲本组合范围

（2）克服有性杂交的母系遗传、获得细胞质基因的杂合子、研究细胞质遗传

（1）制备单克隆抗体

（2）诊断、治疗、预防疾病，例如：

单抗诊断盒、“生物导弹”治疗癌症

2、植物体细胞杂交和动物细胞融合的拓展分析

（1）植物细胞A、B的体细胞是二倍体，体细胞中的染色体数是2n，则杂种细胞C就是4n，称为异源四倍体。

（2）动物细胞融合后获得的杂种细胞，目前还没有办法让其发育成一个个体，它不同于“克隆”，也不同于植物体细胞杂交。

（3）两者都要用到细胞融合和细胞培养两个技术手段。

【积极思维】制备单克隆抗体时，需要经过两次筛选，目的是否相同？

第一次筛选是在B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合之后，需要筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选需要在多孔培养皿上进行，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后筛选出能产生化学性质单一、特异性强的单克隆抗体的细胞群。

【拓展视野】制备单克隆抗体时，如何进行两次筛选、杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？

在细胞混合物中含有骨髓瘤细胞、B淋巴细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞、B淋巴细胞与B淋巴细胞的融合细胞、骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞，通常采用HAT培养基【属于选择性培养基，含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）】进行筛选培养，由于B淋巴细胞不能在体外天然增殖，因而未融合的B淋巴细胞以及B淋巴细胞与B淋巴细胞的融合细胞不能在HAT培养液中长期存活而死亡。

骨髓瘤细胞是次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT—）细胞，因而未融合的骨髓瘤细胞以及骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞在HAT培养液中不能利用次黄嘌呤作为前体合成鸟嘌呤和腺嘌呤，同时在HAT培养液中加入的氨基蝶呤阻断了利用脱氢叶酸还原酶合成嘌呤的第2条代谢途径，于是它们也不能增殖生长。

只有骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞可以在HAT培养液中增殖生长，因为杂交瘤细胞从B淋巴细胞处获取了HGPRT，可以利用培养液中的外源次黄嘌呤，而培养液中添加的胸腺嘧啶可以克服由于氨基蝶呤抑制脱氢叶酸还原酶而阻碍的嘧啶合成。

这样，在细胞融合大约10～14d之后，HAT培养液中只有骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合形成的杂交瘤细胞能够增殖生长。

由于不同效应B细胞的特异性存在差异，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体可能不同，还必须对杂交瘤细胞群进行二次筛选，才可能筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。

二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种到多孔细胞培养板上，使培养板的每孔中只有一个细胞，通过培养使细胞增殖，然后可用酶联免疫吸附试验法检测每孔上清液中细胞分泌的抗体类型。

上清液中能与特定抗原结合的培养孔即为阳性孔，阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，继续进行有限稀释，一般重复3、4次，直至确定每孔中细胞为单克隆细胞。

该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。

【练习巩固】

1、下列关于细胞工程的叙述，不正确的是（）

A.电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合

B.去除植物细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理

C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体

D.动植物细胞培养都需要经过脱分化处理

2、某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正常肝细胞（乙）进行动物细胞培养。

下列说法正确的是（）

A.在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理

B.细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺激细胞的呼吸

C.甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象

D.仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒

3、单克隆抗体（单抗）实质上是单个效应B细胞通过克隆形成的细胞群产生的化学性质单一、特异性强的免疫球蛋白。

下列有关叙述中，错误的是（）

A.单抗作为生物导弹能定向到达癌细胞所在部位

B.单抗制备的过程要用到动物细胞培养和细胞融合技术

C.在单抗制备的过程中必须经过至少两次细胞筛选

D.只有用物理或化学方法的诱导，才能促使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交细胞

4、下列关于细胞工程的叙述中，正确的是（）

A.植物细胞工程中，融合叶肉细胞时，应先去掉细胞膜，制备原生质体

B.植物体细胞杂交培育出的新品种一定不是单倍体

C.植物细胞工程中，叶肉细胞经再分化过程可形成愈伤组织

D.单克隆抗体制备过程，采用不经免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合从而获得杂交瘤细胞

5、人CD20单克隆抗体是治疗一些恶性肿瘤的特效药物，目前主要是通过培养哺乳动物细胞的方式生产。

我国科学家已经培育出世界上第一头转入了CD20抗体基因的转基因牛，可以从它产的牛奶中直接提取CD20抗体。

这项技术成熟后，有望使这一特效药的生产成本降至现在的1/10。

请回答：

（1）单克隆抗体的制备需先将和融合，这一过程的诱导方法与植物体细胞杂交不同的是。

（2）动物细胞培养需要在含混合气体的培养箱中进行，培养液中通常需加入

等一些天然成分。

（3）转基因技术的核心是。

该过程用到的工具酶有和。

6、有性生殖的生物产生后代需进行受精作用，植物体细胞杂交要进行原生质体融合，单克隆抗体的制备需进行动物细胞融合，可见细胞融合技术有着广泛的应用。

右图为细胞融合的简略过程，据图回答相关问题：

（1）若a、b表示两种植物体细胞，则由D细胞形成杂种植株的原理是，这种育种方法的优点是。

（2）若a、b分别为骨髓瘤细胞和效应B淋巴细胞，则d细胞特点是。

由d细胞产生的抗体与普通血清抗体相比较，具有的特点。

生产上，一般不能通过直接培养效应B细胞来生产单克隆抗体，其主要原因是。

（3）下列各图表示单克隆抗体制备过程的各阶段图解，请用箭头把代表各图解的字母按单克隆抗体制备过程的顺序连接起来。

顺序是。

7、右图为细胞融合的简略过程，请据图回答：

（1）若A、B是植物细胞，在细胞融合之前已用处理，除去了；由A、B到细胞C的过程中，常用的物理方法是。

融合完成的标志是。

形成的D细胞还要应用技术把D培养成植株。

（3）若A、B是动物细胞，一般取自，然后用使其分散开来；由A、B到C的过程中，常用的不同于植物细胞融合的手段是，所形成的D称为，A、B融合为C的过程说明了细胞膜具有。

（4）若该过程是制备单克隆抗体，A为小鼠效应B细胞，那么，在获得此细胞之前，小鼠已经被注射了。

注射后小鼠身体发生了相应的免疫反应，生成了，图中B为。

（5）若该过程仍是制备单克隆抗体，在A、B到C的过程中，所形成的C有种，用来培养的D细胞应该是。

从中选择出它的方法是培养，获得D后，常用的培养方法是培养液中培养和。

8、下图是单克隆抗体制备流程阶段示意图。

①技术是单克隆抗体技术的基础。

②根据培养基的用途分类，图中HAT培养基属于培养基。

③单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是。

④动物细胞融合除了采用植物细胞