酶法制备巴旦杏蛋白及其功能性研究.docx

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酶法制备巴旦杏蛋白及其功能性研究

目录

摘要………………………………………………………………………………1

前言……………………………………………………………………………1

1材料与方法…………………………………………………………………2

1.1试验材料…………………………………………………………3

1.2　方法…………………………………………………………………………3

1.2.1原料基本成分测定方法………………………………………………………3

1.2.2巴旦杏蛋白的提取工艺………………………………………………………3

1.2.3孢子悬浮液的制备…………………………………………………………3

1.2.4试验处理………………………………………………………………………3

1.2.5接种处理………………………………………………………………………3

1.3小白杏贮藏期间生理活性变化测定指标及方法…………………………3

1.3.1失重率的测定…………………………………………………………………3

1.3.2果实硬度的测定………………………………………………………………3

1.3.3可溶性固形物含量的测定……………………………………………………3

1.3.4维生素C的测定………………………………………………………………3

1.3.5总酸含量测定…………………………………………………………………3

1.3.6叶绿素及类胡萝卜素含量测定………………………………………………4

1.3.7呼吸强度的测定………………………………………………………………4

1.3.8乙烯含量测定…………………………………………………………………4

1.3.9果实损伤接种及病斑测定……………………………………………………4

1.4数据处理与分析………………………………………………………………5

2结果与分析……………………………………………………………………………5

2.1涂膜处理对杏果实失重率的影响……………………………………………4

2.2涂膜处理对杏果实硬度的影响………………………………………………6

2.3涂膜处理对杏果实VC含量的影响…………………………………………7

2.4涂膜处理对杏果实可溶性固形物含量的影响……………………………8

2.5涂膜处理对杏果实总酸含量的影响………………………………………9

2.6涂膜处理对杏果实固酸比的影响………………………………………10

2.7涂膜处理对杏果实叶绿素含量的影响…………………………………11

2.8涂膜处理对杏果实类胡萝卜素素含量的影响…………………………12

2.9涂膜处理对杏果实呼吸作用的影响……………………………………13

2.10涂膜处理对杏果实乙烯释放量的影响…………………………………14

2.11涂膜处理对杏采后病害的影响…………………………………………15

3讨论……………………………………………………………………………16

3.1涂膜处理对杏果实贮藏品质的影响……………………………………16

3.2现状与展望……………………………………………………………17

4结论………………………………………………………………………………18

谢辞………………………………………………………………………………19

参考文献………………………………………………………………………20

酶法制备巴旦杏蛋白及其功能性研究

闵昌荣

摘要：

关键词：

巴旦杏；酶；巴旦杏蛋白质；制备；功能性

EffectofChitosanCoatingonstoragequalityofApricotfruit

MINChang-rong

Abstract:

Inthispaper,Theapricotfruitweretreatedwith1%、2%concentrationchitosanandcarbendazimsolution，respectivelyandstoredat0℃,90%～95%RH.Effectsofthesetreatmentsonstoragecharacteristicsqualityandphysiologicalmetabolismofapricotfruitwereevaluatedduringstorage.Theresultsshowedthatthetreatmentcouldkeepwater,VC,totalacidandSSC，andalsodelayedtherespirationandethylenepeaks，thediseaseincidenceofthetreatedapricotwasmuchlessthanthecontrol.Resultformthisstudyshowedthatthebesteffectsofapricotfruitqualitywasthe2%chitosancoating.

Keywords:

chitosan;apricotfruit;storagequality

前言：

巴旦杏，又名扁桃，是蔷薇科李亚科桃属落叶乔木，是世界著名的干果树种和珍贵的木本油料植物[1]。

我国扁桃的栽培分布区位于新疆南部主要为喀什地区的英吉沙和莎车县[2]。

目前我国巴旦杏主要用于制作杏干，少量作其他用途。

然而，扁桃仁含糖2%~10%、脂肪47%~61%、粗蛋白28%，其粗蛋白含量高于仁用杏（24.9%），有资料称[3]：

扁桃仁的营养价值相当于同重量牛肉的6倍,为高级滋补品。

制成干果就损失了大量的营养物质，没有充分利用到其中的蛋白质等营养物质。

因此巴旦杏杏仁营养成分的分离提取的研究具有十分重要的意义。

本文研究了酶法提取巴旦杏蛋白质的工艺，以及研究分析了酶法提取的蛋白质与传统碱溶酸沉法提取的巴旦杏蛋白质功能区别。

1.材料与方法

1.1试验材料

供试巴旦杏：

购自乌鲁木齐市北园春市场。

中性蛋白酶：

购自南宁庞博生物工程有限公司（活性为20万u/g）；纤维素酶：

购自北京奥博星生物技术有限责任公司（活性1：

1000）；酸性蛋白酶：

购自奥博星生物技术有限责任公司（活性为50000以上）；其他试剂为实验室常用分析纯试剂。

试验仪器：

pH计、离心机、电热恒温水浴锅、电子天平、紫外分光光度计（金坛市恒丰仪）。

试验试剂：

NaOH，0.2N草酸，1.0%酚酞，丙酮溶液，2,6-二氯靛酚,0.4NNaOH溶液，2%草酸，4%NaOH溶液，考马斯亮蓝G-250。

1.2方法

1.2.1原料基本成分测定方法

粗蛋白含量的测定按GB/T5009.5-2003测定；水分含量按GB/T5009.3-2003测定；灰分含量的测定按GB/T5009.4-2003测定；粗脂肪含量的测定按GB/T5009.6-2003中第一法测定。

1.2.2巴旦杏蛋白的提取工艺

巴旦杏→去壳→去皮→粉碎→脱脂（正己烷1：

10浸泡12h）→抽提→晾干→过80目筛→酶解→灭酶→离心→上清液→酸沉（pH调至4.5）→离心分离→沉淀物→真空冷冻干燥→巴旦杏蛋白质

1.2.3考马斯亮蓝测定水溶性蛋白标准曲线的制作[4]

标准蛋白溶液：

称取10mg牛血清蛋白，溶于蒸馏水，定容至100ml。

制取100μg/ml的蛋白液。

考马斯亮蓝G-250蛋白试剂:

称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%的乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml（可放置1个月）。

取6支试管（具塞），按下表加入试剂：

盖上塞子，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色（比色应在1h内完成）。

以牛血清蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线，建立回归方程为Y=0.00377X+0.00384（R2=0.9992），其中Y为吸光度，X为蛋白质浓度（μg/ml）。

1.2.4巴旦杏蛋白等电点的测定

蛋白质等电点的测定采用比色法测定。

将中性蛋白酶提取的巴旦杏蛋白质提取液在25℃下用0.5mol/L盐酸调pH分别为4.00、4.25、4.50、4.75、5.00，使蛋白质沉淀1h，离心后取上清夜用考马斯亮蓝进行比色，吸光度值最小的点对应的pH即为等电点。

1.2.5蛋白质提取率的计算

蛋白质提取率=提取液中蛋白质含量/杏仁粉中总蛋白质含量×100%

其中提取液中蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定；杏仁粉中蛋白含量用凯氏定氮法测定。

1.2.6酶的筛选

称取1g左右的脱脂杏粉，加入20ml的水（料水比1：

30，剩下10ml水用于配制酶溶液），第Ⅰ组及第Ⅲ组预热至40℃，第Ⅱ组预热至50℃；第Ⅰ组各加入10ml酶溶液（0.0905g中性蛋白酶+30ml蒸馏水），第Ⅱ组各加入10ml酶溶液（0.0903g酸性性蛋白酶+30ml蒸馏水），第Ⅲ组各加入10ml酶溶液（0.0905g纤维素酶+30ml蒸馏水），第Ⅰ组的pH调至7.5，第Ⅱ组的pH调至3，第Ⅲ组的pH调至4.5；添加酶量为3%，各组分别在预热时的温度下反应60min后，转移至85℃的水浴中灭酶10min,冷却离心（1000r/min5min）,用考马斯亮蓝法测上清液蛋白含量。

计算蛋白质提取率。

1.3中性蛋白酶提取巴旦杏蛋白的单因素试验

1．3．1酶用量对巴旦杏蛋白质提取率的影响

称取1g的巴旦杏粉置于烧杯中，按1：

30的料水比，pH调至7.0，酶用量分别为1%、2%、3%、4%、5%。

在50℃的水浴中反应60min。

测定其蛋白质提取率。

做3次平行试验。

1.3.2料水比对巴旦杏蛋白提取率的影响　

称取1g的巴旦杏粉置于烧杯中，料水比分别为1：

20、1：

25、1：

30、1：

35、1：

40，pH调至7.0，酶用量分别为4%，在50℃的水浴中反应60min。

测定其蛋白质提取率。

做3次平行试验。

1.3.3时间对巴旦杏蛋白质提取率的影响

称取1g的巴旦杏粉置于烧杯中，按1：

35的料水比，pH调至7.0，酶用量分别为4%，在50℃的水浴中反应30min、60min、90min、120min、150min。

测定其蛋白质提取率。

做3次平行试验。

1.3.4

1.3.5

1.3.6

1.3.7

1.3.8

1.4结果与分析

试验数据采用DPS软件进行方差分析和检验，并利用Duncan多重式比较，进行差异显著性分析，p<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1壳聚糖涂膜处理对杏果实失重率的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图1可以看出，处理果、对照果失重率均呈逐渐上升趋势，在贮藏前20d，对照果与处理果差异不明显，到第25d时，对照果失重率已上升为2.18%，而多菌灵、1%壳聚糖、2%壳聚糖涂膜杏果失重率分别比对照低11.0%、3.7%、13.8%；到第35d时，对照果失重率已上升为2.98%，而2%壳聚糖涂膜杏果失重率仅为2.37%，显著低于对照20.5%（p<0.05）。

2.2壳聚糖涂膜处理对杏果实硬度的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图2可以看出，在贮藏期间，杏果的硬度均呈下降趋势。

在第30d时，对照组杏果已下降为0.94g/cm2，而2%壳聚糖硬度为1.82g/cm2，显著低于对照93.6%（p<0.05）；到第40d时，对照组杏果为0.62g/cm2，而多菌灵、1%壳聚糖、2%壳聚糖涂膜杏果硬度分别显著低于对照组37.1%（p<0.05）、29.0%（p<0.05）、51.6%（p<0.05）。

试验结果表明，对照组果实的硬度下降速度最快，各处理果硬度均高于对照果，其中，2%壳聚糖涂膜处理对保持杏果硬度效果最显著。

2.3壳聚糖涂膜处理对杏果实VC含量的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图3可以看出，在整个贮藏期间，杏果的VC含量均呈下降趋势。

其中，对照组VC含量下降最快。

在第20d时，对照组和多菌灵组VC含量分别为8.3mg/100g和8.7mg/100g，而1%壳聚糖和2%壳聚糖处理组分别比对照减少10.8%和27.7%，比多菌灵分别减少5.7%和21.8%；第40d时，对照组为3.6mg/100g，而2%壳聚糖涂膜组显著低于对照组58.3%（p<0.05）。

试验结果表明：

各处理组均能减缓VC损失速度，而2%壳聚糖涂膜处理效果优于多菌灵处理组。

2.4壳聚糖涂膜处理对杏果实可溶性固形物含量的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图4可以看出，低温下放置1d-40d，杏果的可溶性固形物含量经历了先升后降又升的过程，SSC含量先达到高峰，随后含量不断下降，而后又升高前15d，随着贮藏时间的延长，果实的可溶性固形物含量逐渐升高，各处理组与对照组无明显差异；第15d-30d时，对照组下降速度最快，第20d时，对照组杏果可溶性固形物含量为13.01%，而2%壳聚糖涂膜组比对照组高9.7%；在第30d-40d时，对照组上升最快，第40d时，对照组杏果可溶性固形物含量为16.08%，而多菌灵、1%、2%壳聚糖涂膜组分别比对照组减少3.7%、5.8%、11.3%。

试验结果表明：

各处理组均能减缓可溶性固形物的上升，其中，2%壳聚糖做为涂膜浓度保鲜效果最好。

2.5壳聚糖涂膜处理对杏果实可滴定酸含量的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图5可以看出，在整个贮藏期间，可滴定酸含量呈下降趋势。

对照组可滴定酸含量均低于各处理组。

在第15d时，对照组杏果已下降为0.9%，而多菌灵、1%、2%壳聚糖涂膜组分别比对照组高22.2%、33.3%、33.3%；第40d时，对照组已下降为0.4%，而2%壳聚糖涂膜组为0.7%，比对照组显著高75.0%（p<0.05）。

可见壳聚糖保鲜剂能延缓总酸的降低速度，并且，随着贮藏天数的增加，保鲜剂对保持杏果中可滴定酸含量的作用越来越显著。

试验结果表明，2%壳聚糖处理组总酸含量下降最慢，处理效果最好。

2.6壳聚糖涂膜处理对杏果实固酸比的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图6可以看出，在整个贮藏期间，各组固酸比均呈上升趋势。

在前20天，对照组与各处理组差异不明显，在第25d时，对照组杏果已上升为9.18%，而多菌灵、1%、2%壳聚糖涂膜组分别比对照组减少18.2%、6.5%、14.3%（p<0.05）；到第40d时，对照组已上升为25.93%，而多菌灵、1%、2%壳聚糖涂膜组分别显著低于对照组29.8%（p<0.05）、27.0%（p<0.05）、41.5%（p<0.05）。

由此，可以看出，各处理组均能减缓杏果固酸比的上升，其中，2%壳聚糖处理组固酸比上升最慢，这说明，2%壳聚糖涂膜处理对抑制杏果固酸比的上升效果最好。

2.7壳聚糖涂膜处理对杏果实叶绿素含量的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

由图7可以看出，整个贮藏期间，杏果叶绿素均呈下降趋势。

在第20d时，对照组、多菌灵、1%壳聚糖处理组已下降为0.96mg/l、1.04mg/l、1.02mg/l，而2%壳聚糖处理组为1.28mg/l，显著高于对照33.3%（p<0.05）；对照组叶绿素含量降低很快，40d内降低了1.21mg/l，而壳聚糖涂膜后叶绿素含量降低幅度较小，尤其2%壳聚糖处理组，叶绿素含量降低最为缓慢，仅下降了0.83mg/l，显著低于对照31.4%（p<0.05）。

由此可以得出结论：

2%壳聚糖涂膜对延迟杏果的后熟和保持杏果的鲜嫩度效果最好。

2.8壳聚糖涂膜处理对杏果实类胡萝卜素含量的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图8可以看出，整个贮藏期间，杏果中类胡萝卜素含量呈上升趋势。

对照组含量均高于处理组。

第15d时，对照组杏果已上升为162μg/100g，而多菌灵、1%、2%壳聚糖涂膜组分别比对照组减少9.8%、9.8%、17.3%；到第35d时，对照组为200μg/100g，而2%壳聚糖涂膜组仅为166μg/100g，比对照组减少17.0%。

试验证明，各处理均能有效抑制类胡萝卜素含量的增加，而2%壳聚糖涂膜浓度效果最佳。

2.9壳聚糖涂膜处理对杏果实呼吸作用的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

在贮藏的整个过程中，杏果呼吸强度随贮藏时间的变化趋势，如图9所示。

从图9看出，在贮藏后第10d，对照组杏果出现了呼吸高峰，而各处理组均延迟5d才出现了呼吸高峰，对照组呼吸高峰为13.0mg/kg.h，而多菌灵、1%、2%壳聚糖涂膜组分别为12.45mg/kg.h、12.85mg/kg.h、12.33mg/kg.h，分别比对照组减少4.2%、1.2%、5.2%。

试验结果表明：

各处理组均推迟了呼吸高峰的出现时间，且降低了呼吸强度，其中，2%壳聚糖处理的杏果效果最好。

2.10壳聚糖涂膜处理对杏果实乙烯释放量的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图10可以看出，对照组和多菌灵处理组的乙烯高峰出现在贮藏后的第10天；在贮藏第15天时，壳聚糖涂膜组同时出现了乙烯高峰。

对照组和多菌灵处理组峰值分别为1.452和1.453，1%、2%壳聚糖涂膜组分别为1.457和1.441。

试验结果表明，2%壳聚糖涂膜推迟了杏果实乙烯高峰的出现，同时，乙烯的释放量也相应的降低了。

2.11壳聚糖涂膜处理对杏果实采后病害的影响

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图11可以看出，小白杏接种青霉菌后，在常温贮藏第4天开始发病，当贮藏到第6天时，对照果实的发病率为38.5%，而2%壳聚糖涂膜处理果实的发病率仅为21.4%，显著低于对照组44.4%（p<0.05）；在贮藏后第7天，对照果实的发病率为76.9%，而多菌灵、1%、2%壳聚糖涂膜处理果实的发病率分别为72.0%、73.0%、50.0%，比对照分别减少了6.4%（p<0.05）、5.1%（p<0.05）、35.0%（p<0.05）。

说明各处理组均能抑制青霉发病率，尤以2%壳聚糖涂膜剂抑制效果最显著。

图中竖线表示标准误差（Barindicatedstardarderror）

从图12可以看出，赛买提杏果接种青霉后，在常温贮藏第4天开始发病，当贮藏到第6天时，对照果实的发病率为36.4%，多菌灵和1%壳聚糖涂膜处理果实的发病率为33.3%和32.3%，而2%壳聚糖涂膜处理果实的发病率仅为20.0%，显著低于对照45.1%（p<0.05）；在贮藏第7天，对照果和多菌灵处理果的发病率为72.7%和66.7%，而1%、2%壳聚糖涂膜处理果实的发病率分别比对照减少了17.5%（p<0.05）和42.5%（p<0.05）。

说明各处理组均能抑制青霉发病率，尤以2%壳聚糖涂膜剂效果最显著。

3讨论

3.1涂膜处理对杏果实贮藏品质的影响

硬度是衡量采后软化的重要指标之一[11]，它直接影响到果蔬贮藏的时间长短；VC是果蔬中一种很重要的营养成分,人类饮食中的VC有90%是从水果、蔬菜中获得的。

果蔬在保存期间VC极易被氧化而损失，因此VC是果实品质的重要指标之一；可滴定酸与可溶性固形物一样，是植物品质的重要构成性状之一，也是影响果实风味品质的重要因素。

因此对其进行定量研究对果蔬的品质鉴定具有重要意义；叶绿素含量是鉴定果实成熟度和蔬菜鲜嫩度的重要指标之一[12]；果实呼吸作用和乙烯与贮藏保鲜密切相关，一般随着呼吸作用增强和乙烯释放量的增加，果实成熟度加快，贮藏时间缩短。

对于贮藏期间的杏果来说，以上指标对杏果的品质都有不同程度的影响，因此，对其进行定量研究对果蔬的品质鉴定具有重要意义。

壳聚糖是以（C6H9O4NH2）为单体的高聚物，其保鲜机理主要是形成保护膜质，促进生理活性。

当该物质喷涂于果蔬表面，待溶剂挥发后，被处理的果蔬表面形成一层透明的无色薄膜，即壳聚糖分子形成互相交联，层层交联的膜层[13,14]。

该膜层具有通透性、阻水性，可以对各种气体分子增加穿透阻力[15~18]，形成了一种微气调环境。

一方面阻止外界的空气进入膜层内，另一方面使果蔬组织内的CO2含量增加，O2含量降低，抑制了果蔬的呼吸代谢强度和水分散失。

由于VC氧化还原型反应所需要的氧气浓度降低，从而对还原型VC有较好的保护作用，减少了贮藏过程中VC的损失，即减缓了果蔬组织和结构衰老，同时，也很好的保持了杏果的硬度。

果实O2吸收的减少，又直接影响着果肉组织有氧代谢的进行，从而抑制叶绿素的降解和类胡萝卜素的合成，使果实较长时间地保持原有品色，也就延长了果实的贮藏期。

壳聚糖在微酸环境中具有较强的抑菌抗菌作用，这是果蔬保鲜中十分重要的保鲜功能。

对于不同浓度的壳聚糖溶液，其粘度不同，形成的保鲜膜的疏密程度不同，成膜质量对保鲜时间的长短有明显的影响。

当壳聚糖浓度小于1%时，成膜薄，它对果蔬体内与空气的气体交换的阻力就小，导致杏果内的氧气浓度升高，CO2呼吸作用增强，营养成分及有机酸消耗过快，保鲜效果不好；当壳聚糖浓度大于2%时，成膜过厚，使果蔬内氧气浓度太低，不能满足正常呼吸，成为缺氧呼吸，保鲜时间也缩短；只有当壳聚糖浓度为2%时，成膜厚度适宜，果蔬既能进行有氧呼吸，又能防止水分散失过快，并能抑制微生物入侵，而使其显著延长贮藏时间，达到保鲜目的。

关于壳聚糖防腐的机理，除了壳聚糖延缓果蔬的衰老，保持组织健康外，主要有以下3点解释：

①是壳聚糖对一些腐败真菌起到直接的抑制或杀灭作用，②是壳聚糖能诱导植物产生一系列防御反应而增加自身抗病性，包括提高几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和苯丙氨酸解氨酶（PAL）及过氧化物酶（POD）活性，产生植保素[19]，合成木质素，加厚细胞壁以阻碍病菌穿透。

③是壳聚糖能延缓果蔬后熟。

从物理化学角度分析，则是壳聚糖类物质的正电荷与微生物细胞膜表面的负电荷作用造成蛋白质类物质及其他细胞内组成成分的流失而达到抑菌防腐的功能[20]。

该结论在本试验中也同样得到了应证。

2%壳聚糖涂膜剂由于能够延缓果蔬后熟，对一些腐败真菌起到直接的抑制或杀灭作用，并且，诱导杏果产生一系列防御反应而增加自身抗病性，从而，有效抑制果实贮藏期间腐烂的发生。

3.2现状与展望

壳聚糖来源丰富、结构独特、成膜简单、保鲜性能优越，作为果蔬等食品的保鲜剂，很有发展潜力。

用壳聚糖保鲜液处理操作简便，成本低，平均每千克保鲜液能浸杏果900~1000kg，每千克水果成本增加5~6分钱，适合果农使用。

我国海域辽阔，海产品资源丰富，自然界每年生物合成的甲壳素估计有数十亿吨，主要分布在虾、蟹外壳,地球上储量约1000亿t，并能再生利用。

所以，壳聚