第3章 基因组学.docx
《第3章 基因组学.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第3章 基因组学.docx（40页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
第3章基因组学
第二章基因组学
2．1基因组学的概念及意义
基因组学（genomics）最初是由ThomasRoderick于1986年提出的,其内容是指基因组作图（mapping）和测序（sequencing）。
近年来，这个概念有新的发展。
现在人们倾向于将基因组学分为结构基因组学（Structuralgenomics）、功能基因组学（functionalgenomics）、比较及进化基因组学等部分。
功能基因组学和比较及进化基因组学是建筑在结构基因组学基础上的，因此，结构基因组学是第一阶段的工作。
它的目标是构建出高分辨率的遗传图（geneticmap）和物理图（physicalmap）；图内又可包含转录图（transcriptmap）。
这里没有将测定的基因组DNA序列单独列出，因为基因组DNA序列就是最高分辨率的物理图，其分辨率为1个核苷酸。
功能基因组学是基因组分析的更进一步阶段。
它的主要内容是：
利用结构基因组学所提供的生物材料和信息，全基因组或全系统（global，genomewide、systemwide）地理解某种生物的遗传体系。
功能基因组学的研究必须结合统计学和计算机科学，应用所谓高通量（highthroughput）和大规模、自动化的实验技术得以实现。
虽然，科学界现在越来越热烈地谈论功能基因组学，并开始有关这方面的研究工作，但实际上，目前还处在结构基因组学的阶段。
功能基因组学的主要研究方法：
比较及进化基因组学
在结构基因组学中，基因组测序是最基本的研究领域。
因为，只有完成了这一阶段的研究，才有可能在分子（核苷酸）的水平上破译生物的遗传之谜。
在人类基因组计划的带动下，迄今已完成近50个不同生物的基因组DNA序列的测定，其中包括多个病原微生物和模式生物基因组的测序。
流感嗜血杆菌（haemophilusinfluenzae）是能独立复制的小基因组，而大肠杆菌是多年来在生物学上极为频繁使用的、也是被研究得十分深入的实验室“工具”。
啤酒酵母是基因组序列被测定的第一个真核生物，秀丽线虫则是第—个基因组序列被测定的多细胞动物。
自1990年开始大规模展开基因组DNA测序以来，进展非常迅速，参与这类研究的国家也不断增多。
通过基因组DNA测序，已经揭示和正在揭示出许多过去人们所未知的遗传信息。
在10年前，还有不少人怀疑基因组DNA测序的意义，现在情况已有了根本的扭转。
基因组学的发展必将给生物学和人类社会带来巨大的冲击，引起深刻的变化，这一点已是确定无疑的了。
从1995年7月第一个有细胞形态的生物（流感嗜血菌）的基因组全序列发表到今年2月人类基因组工作框架图初步分析结果发表，已有近40种原核生物和7种真核生物的基因组全序列被测出，还有400多种生物的基因组全序列测序工作正在进行。
模式生物基因组测序工作结束后，基因组研究的重点已由以测序为主向以结构和功能为主的后基因组研究转移。
整个生物学研究也进入了一个新的被称为基因组生物学（genomebiology）的时代，即从基因组水平上研究生命现象和生命过程的规律，除基因组学的核心分支——结构基因组学、功能基因组学、比较及进化基因组学、蛋白质组学、转录组学外，还不断产生着新的分支学科群，如药物基因组学、环境基因组学、疾病基因组学、生理基因组学等。
到目前为止，声势浩大的基因组学在理论上并未给生物学带来革命性的变化，但却为生物学研究的现代化、生物学理论的突破和生物技术产业化奠定了基础。
首先，基因组学改变了传统生物学的研究方式和方法。
基因组生物学注重从整体性和综合性角度进行研究，并以大规模、高通量、自动化的工业流水线形式进行。
这样生物学家的日常工作便从在实验室获得数据转移到理论假设和数据分析上。
那种倾尽毕生精力研究一个基因、一条代谢途径、一种生理现象的时代已经过去。
其次，模式生物基因组全序列数据为生物学理论的突破奠定了基础。
生物学家希望在弄清生物基因组所有基因及其产物在生物发生、发育和进化中的所起的作用和时空联系后，能建立类似于化学元素周期表的“生物学周期表”，以解释、预测甚至制造生命体。
第三，已完成及目前正在进行测序的400多种生物基因组全序列将为人们提供海量序列数据，这些序列包含了三十多亿年来生物演化所积累的精华——几十万个具有各种各样功能的基因，这些基因将为生物技术中基因和蛋白质操作提供原材料。
第四，基因组学将改变生命科学的研究范式。
由于生物所有的基因将被知晓，今后生物学研究项目的起点将是理论的，即从理论假设开始，首先通过生物信息学的方法在计算机上进行大量模拟分析，然后才转向实验室检验假设。
综观目前生物学的发展趋势，除上面介绍的基因组生物学外，分子生物学、系统生物学、发育生物学、神经生物学、生物技术也将是21世纪生物学的重点领域。
所有这些学科，无论是理论还是实际，都是建立在一个公共的技术及理论平台——生物信息学上的，因此生物信息学将是今后生物学的核心学科。
2．2基因组测序的策略和方法
基因组DNA测序的战略，大致可分为全基因组随机测序（whole—genomeshotgunsequencing）和根据物理图测序（physicalmap—basedsequencing）两大类。
其实在后一种战略中，当测定物理图中特定的每个克隆时，所使用的也是随机测序方法。
下面以入基因组、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、酵母基因组和线虫基因组测序为例，分别介绍上述两种测序战略。
2．3．1全基因组随机测序战略
早在1982年，英国剑桥的Sanger实验室就建立了随机测序战略，并用此战略成功地完成了入基因组的全序列测定。
目前。
国际上所使用的各种随机战略，基本上都建立在当时的这个方法之上。
从理论上讲，最有效的DNA测序法应该是定向测序，因为这可避开不必要的重复测序。
但经过科学家近20年的努力，仍然未研究出一种能定向测定DNA大片段的方法。
因此，随机测序法仍是当今测定大基因组的最佳方法。
有趣的是，随着DNA测序的高度自动化，测定DNAJ顺序已不是速度的限制因素。
同时，随机测序所产生的无法控制的重复，却成了提高DNA测序精度的一种有效方法。
DNA随机测序涉及到许多步骤，但并不复杂。
具体来说，是用物理手段打断DNA，构建出必要容量的随机测序的亚克隆库；然后，再随机地测定这个亚克隆库的DNA序列，使测出的序列达到6—8倍覆盖率；最后组装成一个完整基因组DNA序列。
当时入基因组序列的测定，是用手工操作的。
随着技术的进步，现在虽然测序的战略与当年基本相同，但已由手工测序发展到自动化测序仪测序，测序的速度和规模由机器的数量决定了。
先以嗜血流感杆菌为例，说明全基因组随机战略的一般步骤。
嗜血流感杆菌的基因组长达1．8Mb，其测序战略包括下述步骤：
（1）构建全基因组的随机质粒库和入库。
（2）证明库的随机性和代表性。
（3）对克隆进行两端测序。
（4）序列组装。
（5）填补缺口，完成测序。
（6）对已测DNA顺序进行编辑，纠正顺序中的误差。
（7）解读DNA顺序和基因的鉴别。
这种战略的优点是省去了复杂的构建物理图的过程，它的主要缺点是大大增加了测序的工作量。
这个全基因组随机战略是美国J．C．Venter提出的，他在嗜血流感杆菌基因组DNA测定中加以应用，取得成功。
其实，在本质上，这个方法与80年代初，Sanger实验室测定入基因组是类同的。
只不过Venter所测定的基因组比Sanger当年测定的要大而已。
Venter显然因全基因组随机战略测定嗜血流感杆菌基因组成功而受到鼓舞，他最近提出，甚至要用这个方法来测定人的全基因组DNA。
用全基因组随机测定嗜血流感杆菌基因组后，人们几乎全部用这个战略测定10Mb以下的所有微生物基因组了。
虽然在战略上，J．C．Venter提出的用全基因组随机测序战略来测人类基因组DNAJ顺序，只是将全基因组随机测序战略从几百万个核苷酸范围扩大到数十亿，但这一战略构想和目前的人类基因组计划的测序战略截然不同。
所以，一经提出，立即惊动了整个人类基因组研究领域。
Venter的想法是，将人类基因组DNA用多种方法打断后，建库，然后随机测序。
他设想在三个层次上进行。
首先是建立插入片段长度约150kb的BAC库。
此库由300000个克隆组成，然后对每一个BAC克隆进行两端测序，各端测出500bp。
这样可以得到约10％左右的人类基因组序列，即平均每5kb就有一个500bp的序列标记。
其次，用插入长度为10kb的低拷贝质粒克隆，计划建立一个由500万个克隆组成的库。
对每一个克隆两端各测出500bp，这样总共可得到50亿碱基的序列。
第三，用多拷贝质粒作载体建库，插入长度为2kb，库容量是30000000个。
同样对此库进行两端测序，得到总共300亿碱基序列。
所有序列加起来，起码是人类整个基因组DNA序列的10余倍。
每个层次是独立进行的，最后对所测得的DNA顺序加以总装。
如果这种战略是成功的话，则可摆脱作基因组物理图的困难。
加快测序的速度。
但是，人们担心，这么多的DNA序列片段，如何能装配出完整的人类基因组。
J．C．Venter认为，从理论上讲，只要有9倍的覆盖率。
应当能测出一段连续的DNA序列。
根据上述估计，这种战略得到的将是人类基因组10倍以上的覆盖率，可以满足统计意义上的要求。
Venter还认为，现在已有的人类基因组的数据库、遗传图、物理图和EST库，可以被用作填补缺口和帮助组装。
他估计，使用此种战略，最后会留下2000—5000个缺口，平均每个缺口约长58bp。
填补这些缺口，将是很麻烦的事情，但Venter认为，用他们的这种方法可迅速地得到人类基因组DNA顺序，其精确度达99．9％。
此序列将和EST库一样，虽不完善，却非常有用。
关于Venter的战略，还有一点必须指出，即这一战略对计算机的处理能力和软件系统要求都极高，一般测序用计算机不能胜任。
这一战略的基础是进行超大规模的极快速的测序工作。
现在广泛使用的DNA凝胶电泳测序仪肯定不能满足要求。
J．C．Venter认为可用最近开发的快速毛细管测序仪来进行。
它的测序速度又要快几个数量级。
现在生产自动测序仪的最大厂家PE公司，给他提供了经费和技术支持，因此实际上，Venter领导的研究人员已经开始了这一研究。
当然，这一战略的最终效果，还要经实践后才能真正确定。
2．3．2以物理图为依据的测序战略
使用这一战略，必须要先建立基因组的物理图。
然后，从物理图中选出完全覆盖了基因组的彼此最少重叠的克隆，对这些克隆进行测序后，便完成了对整个基因组DNA的测序。
现在，大的基因组项目包括酵母、线虫和正在进行的拟南芥菜、水稻、果蝇和人类基因组，用的都是这一战略。
这个战略本身也在发展着，从下面几种不同生物基因组的DNA测序中，可以明显地反映出来。
1．酵母基因组第3号染色体
酵母第3号染色体的DNAJ顺序早在1992年已测出。
在测定第3号染色体时，选择31个cosmid和入克隆。
测序方法进行如下：
（1）克隆直接测序（共测出19kb）。
（2）随机法测定亚克隆（82kb）。
（3）染色体步行（chromosomewalking）法测序（137kb）。
（4）系列缺失（nesteddeletion）法测序（147kb）。
这样得到385kb，最终拼装出315kb长的第3号染色体。
当然，这是1992年的工作，当时大规模系统基因组测序还没有开始，现在的物理图测序战略先进多了。
2．e.coli基因组
e.coli基因组DNA测序的情况有些特殊，科学家们是分步完成测序的。
（1）获取DNA片段它们的总长为1．92Mb（位于2686777—4639221bp），由一套彼此部分重叠的长15—20kb的入克隆所组成。
实际上，这就是基因组的部分物理图了。
DNA测序根据此图展开。
（2）大片段DNA通过所谓的“单跳质粒”（popoutplasmid）获得大片段DNA，其长度为200kb（位于2475719—2690160bp）。
单跳质粒的基本原理是：
利用同源重组，将带有复制起点和两个重组酶（recombinase）的特异的识别序列，插入到待克隆的染色体序列的两边（相距50—100kb）。
当受到诱导时，细胞表达出重组酶和复制蛋白。
重组酶切割两个插入序列，并将它们中间的染色体DNA环化。
这段DNA即可作为大质粒，靠复制起点扩增。
从细胞中将这种DNA分离出来后，即可测定其顺序。
（3）I—SceI位点的引入I—SceI是酵母编码的识别18bp序列的特异内切酶，在E.coli基因组中并无此酶识别序列。
经过转座子转座。
先将一个这样的位点转入到E.coli基因组中。
然后再通过转导引入另一个识别位点。
用I—SceI酶切这样的E.coli基因组，可获得大片段DNA产物。
将它们在脉冲电泳（PFGE）中分离后，即得到适当长度的DNA片段。
将这些DNA片段切短后，即可用M13载体和随机战略对它们进行测序。
用I—SceI位点插入法共获得11个约250kb的DNA片段。
用这种方法共测定DNA顺序2．4Mb。
它位于22551—2497976bp。
对于没有合适的I—SceI片段的另一部分（位于0—22551bp）DNA片段，则选择出三个覆盖该区域的入克隆。
通过对它们的测序，获得该区域的DNA顺序。
在测序过程中，发现其中有一个入克隆有缺失，于是通过长范围PCR，获得缺失片段，完成测序。
3．线虫基因组
线虫基因组测序是完全基于物理图进行的，因此比较有系统，其测序效率也高了。
先构建覆盖基因组6倍的、平均插入长度为40kb的cosmid随机克隆库。
然后通过“指纹法”（fingerprinting），建立起线虫基因组的物理图。
后来实验证明，指纹物理图大大提高了以后的DNA测序效率。
所构成的指纹物理图仍合有缺口。
此时，再用杂交法筛选出YAC（yeastartificialchromosome）克隆，填补缺口。
在线虫基因组物理图中，有20％被YAC克隆覆盖。
测序从染色体的中间区域开始，因为这里cosmid克隆的覆盖率和分子标记密度都高。
先在物理图中选择彼此最少重叠（平均重叠20％）的连续有序cosmid克隆进行测序。
对YAC克隆的测序，是在酵母基因组DNA测序完成后进行的，因为这时易于将污染的酵母序列剔出。
测序分两个阶段进行。
第一阶段为随机测序。
第二阶段包括填补顺序缺口和解决顺序不清楚的区段。
在第二阶段中用了多种酶。
酶切大多数cosmid克隆，以核对序列组装是否正确。
这对解决由重复序列造成的误差大有帮助。
科学家们也用过PCR来验证组装的正确性。
但发现这种方法的效率差，后来不用了。
在测序过程中用一个基因库是不够的。
因此，当cosmid克隆用完后，又筛选fosmid克隆（它类似于cosmid，但每个细胞只有一个fosmid拷贝，因此它更为稳定）。
fosmid库很有用，因为染色体中间区域的1／3缺口都是被fosmid克隆补上的。
在特殊情况下，也用长范围PCR填补染色体缺口。
最后填补染色体的缺口是通过YAC克隆，即选出跨越缺
口的彼此最少重叠的YAC克隆作为DNA模板进行测序。
在这里必须指出的是。
用自动化DNA测序仪测序的速度的确很快。
但测序仪所产出的DNA顺序的质量并不都令人满意。
由于DNA本身结构的关系，人们往往得不到应有的顺序信息。
其中，DNA中的二级结构就是测序的障碍。
在遇到非常困难的二级结构时，现在比较有效的办法是，将克隆随机打断成更小的片段，构建出更短插入片段的次亚克隆库，以破坏DNA中的二级结构，然后再测出其序列。
总的说来，97Mb长的线虫基因组，是通过2527个cosmid克隆、257个YAC克隆、113个fosmid克隆和44个PCR产物测出的。
12条染色体的末端顺序，是用专门含端粒的质粒测出的。
4．水稻基因组第4号染色体测序
我国目前对水稻基因组第4号染色体展开了系统的测序。
此项目正在中国科学院国家基因研究中心进行。
我国所采用的测序战略与上述的又有不同。
详细方法将在测序的专门章节中描述，这里仅作一个简介。
在测序前，先作基因组物理图。
利用一套平均插入片段为120kb的BAC库和指纹图法构建出克隆重叠群，再利用分子标记将重叠群定位于染色体上，获得了水稻基因组BAC物理图。
第4号染色体测序是根据这张物理图展开的。
测序的基本战略是：
（1）在重叠群中选出一套彼此重叠最少的有序BAC克隆。
（2）对每个BAC克隆进行亚克隆。
（3）用DNA测序仪随机测定亚克隆顺序。
（4）建立起亚克隆序列重叠群。
（5）用“半随机法”延伸亚克隆序列重叠群长度。
（6）通过引物步行（primerwalking）等技术定向填补缺口。
经过实验，上述水稻测序战略已被证明是有成效的。
综上所述。
测序的总体战略框架是类似的，但在具体运用中，涉及到许多不同的方法和技术，以满足特定基因组DNA测序的需要。
2．3．3随机定向战略
在原则上，这个战略属于物理图测序战略范围，但将随机和定向测序有机地结合了起来。
它的原理可用图5—l，5—2，5—3，5—4，5—5加以阐明。
首先从重叠群中选出相互重叠最少的克隆，形成所谓的“瓦式克隆”。
在确定“瓦式克隆”之前，必须对相邻两个克隆的重叠区加以检定。
这里介绍两种特定的方法。
图5—1介绍的是酶解法检定重叠区。
将两个被检定的克隆分别用一种限制性内切酶水解，用agarose电泳获得水解图。
然后分别将水解产物标记后与agarose电泳图杂交。
两个克隆的重叠区将会产生相同的酶解图案。
图5—2则为PCR法检定相邻两个克隆的重叠区。
在使用此方法前，必须要测得相邻克隆的末端顺序，然后根据末端顺序设计引物。
用这样的引物，分别以两个目的克隆为DNA模板进行PCR，获得扩增产物。
将此产物进行agarose电泳分析，并以同样的引物，但以水稻基因组总DNA为模板所获得的扩增产物为电泳对照。
相邻克隆的重叠区将产生相同长度的DNA片段。
须指出的是。
用一种方法检定克隆的重叠往往不够，一般需要用两种以上原理不同的方法。
但是，由于重叠群本身已由指纹法建立，在此基础上栓定相邻克隆的重叠比较容易。
当“瓦式克隆”选定后，即可开始亚克隆的构建。
由图5—3可以看出，当得到瓦式克隆后，就可对它们进行亚克隆。
先用超声波打断每一个BAC克隆，控制超声波能量等参数，使被粉碎的DNA片段比较集中分布在约3kb的范围。
BACDNA经这一处理而受伤（图5—3），不论在DNA链上和DNA的两端均造成亚克隆的困难，需要适当的修补，才进入亚克隆阶段。
BAC克隆之间的重叠区可以通过杂交去除，以避免该区的重复测序。
这样所得到的亚克隆便可进行随机测序了。
在基因组大规模测序中最花时间的有两步：
第一步是有代表性的高质量的亚克隆库的建立；第二步是所谓完成顺序（finishedsequence）的获得。
所谓完成顺序，包括了对DNA顺序的生物功能的注释。
这步都需专门的知识和技术，并要求研究工作人员有这方面的丰富经验。
但是，随机测序这一步骤很快。
随机测序所产生的是原始顺序，将原始顺序输入计算机后，所谓的亚克隆骨架很快就可建立起来。
图5—4是计机所建立起来的亚克隆骨架。
骨架的建立是一个随机的过程，它的整性和亚克隆的分布是无法预测的。
这个骨架十分重要，因为它的深度确保了亚克隆连接的正确性，实际上也保证了DNA顺序的准确性，这是基因组测序的关键。
根据水稻基因组测序的经验，建立一个合格的120kb左右的亚克隆骨架，大约需要测定600个亚克隆的末端DNA顺序。
到了这一步，留下的空隙就不多了。
而且，除了极个别情况外，空隙的跨度只有不到100个核苷酸。
图5—4表示了一个亚克隆骨架。
从图中可以看出，它的用一个盖革图中有一个空隙，但由于此图的比例缩得很小，在计算机的实际尺度上用肉眼是看不出来的。
为了说明空隙是如何填平的，需要将亚克隆骨架的空隙有关周围加以放大。
图5—5则是这个空隙的放大。
在图5—5中可以清楚地看出，只要选出B，C两个亚克隆，即可通过杂交，在亚克隆库中，找到那个填补空隙的特定亚克隆，即所谓的“搭桥克隆”，对这个亚克隆进行测序，亚克隆骨架中的这个空隙便填平了。
当然，填补空隙的办法很多，如用PCR进行双向测序就是办法之一。
上述的基因组测序战略利用了三个要素：
物理图、随机测序和定向补缺，它们的有机结合便构成了随机定向战略。
2.3基因组作图
2.3.1基因作图的目的基因作图是将基因分配到染色体的基因座上。
通过对很多基因和其他标记相对位置的作图，可能产生一个染色体图谱或整个基因组的图谱。
基因作图可帮助人们理解与开发生物性状的遗传性质，特别是通过遗传连锁（参阅）将一种性状的遗传与另一种（或者合适的遗传标记，参阅）相联系，或者通过将表型差异与染色体结构的改变联系起来。
商业上，这可以使动物和植物繁殖产生有改良性状的农作物和兽类，在人类范围中，这使生化机制不清楚的遗传疾病的基因在特定染色体或染色体带型中定位（分配到一个基因座），并通过标记相连锁追踪家诺（参见基因追踪）。
根据最近重组DNA技术的进展，通过建立基因组DNA片段克隆和分析可能产生详细的基因图谱。
最终，可能获得基因组的整个DNA顺序，这一无价的资源不仅提供了基因结构的信息，而且有高度有序的基因组序列高级结构和基因与基因组进化的信息。
现在，对几种模式生物在国际范围内开展制作遗传和物理图谱的工作，最终的目标是确定整个基因组顺序（表12．4）。
与物理基因作图相联系的技术用于定位克隆（参阅），每个基因序列的获得有很多商业用途，包括药物开发。
基因组作图、分析和测序的学科称为基因组学（genomics）。
2.3.2三种基因图
有三种主要的基因图：
遗传（连锁）图、细胞遗传图和物理（分子）图。
遗传或连锁作图（geneticorlinkagemap）是将基因分配到连锁群（1inkagegroup）（因在染色体上位置邻近倾向于一起遗传的一群基因）。
遗传图以绝对单位被标定，反映了通过重组（如在减数分裂作图中）或染色体片段化（如在放射性杂交作图和HAPPY作图中）标记分离的可能性，遗传作图依赖的原理是两个基因座出现在同一DNA片段的机会随它们之间距离的增加而减少。
在细菌中的遗传作图涉及相似的原理，水平基因转移自然机制使作图成为可能（见第10章细菌中的基因转移）。
遗传图谱分辨率在细胞遗传和物理图谱之间，但那些基于重组频率的作图可以被相对高或相对低的重组所歪曲（参见重组热点和冷点）。
另外，重组的频率在各种物种中并不一样；因此遗传图谱在不同的物种中反映了不同的物理距离。
细胞遗传图谱是通过将可观察到的染色体重排和表型相联系而产生的。
这一类图谱分辨率低，在少数物种中应用，如哺乳动物和果蝇，它们在自然或诱导可以产生可重复的染色体带型（另见病理作图）。
简单基因组的细胞遗传作图（如病毒、质粒等）用来确定它们物理性质差异的位置（参见变性作图）。
表2．4用于基因组作图和测序计划的物种
生物体评论
细菌大肠杆菌和枯草杆菌是得到细致研究的模式生物，被用于基因结构和调节的前沿研究。
大肠杆菌基因组序列最近被发表，而枯草杆菌在近些年也将完成。
许多其他细菌基因组已经完成测序：
第一个是嗜血流感菌。
酿酒酵母酿酒酵母和相关的裂殖酵母广泛用于真核基因结构和调节的研究，在核心途径如DNA复制和细胞周期的研究中尤其重要。
最近完整的酿酒酵母序列被发表——这种酵母有大约6300个基因；比原先预测的多。
线虫线虫是最简单的非脊椎动物模式动物（基因组为100Mb）。
它被广泛用于发育、特别是神经发育的研究，这是因为它不变的世系（从一个卵细胞成为959个体细胞的成体的发育途径已被完全阐述），且其神经系统的相互作用被完全作图。
已经完成高密度的遗传和物理作图，测序计划也接近完成。
果蝇果蝇是所有模式生物中研究得最广泛的，特别是在发育遗传的早期研究中。
基因组用形态标记高密度作图，果蝇还被广泛用于连锁分
升级会员 