整理western blotting protocolWWZ070610.docx
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整理westernblottingprotocolWWZ070610
Westernblottingprotocol
ByWei-ZhangWang-070610
A.溶液和试剂
注意：
溶液的配制最好用Milli-Q或同等纯度的水!
所有下面所用容器使用前都必须洗干净，并用双蒸水润洗，最后晾干。
A1.抑制剂：
蛋白酶抑制（35mg/mlPMSF）：
用无水乙醇稀释为35mg/ml，室温下避光保存，可使用3－4个月。
（MW：
172.4g）
丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂（5M氟化钠（NaF））：
取2.1克氟化钠置于10mlMilli-Q水中，然后vortex剧烈震荡使其充分溶解，最后分装成10μl/管，置于-20℃保存（解冻后必须1小时内使用）。
酪氨酸磷酸酶抑制剂（1M钒酸钠（SodiumOrthovanadate））：
称一定量的钒酸钠置于水中，用盐酸调pH至10.0，加热沸腾至完全溶解且溶液为无色，待溶液冷却至室温后再调pH至10.0，加热至溶液变无色，冷却后再调pH至10.0，如此反复操作至室温下pH稳定在10.0即可，最后定容至浓度为1M。
此配制方法是参考网上的WBprotocol，实际是否如此配制尚未实践过！
A2.1×PBS（pH7.4）
A3.1×SDS裂解液（20ml）:
Stock终浓度
Tris-HCL（pH6.8at25℃）1MTris（pH6.8）1.25ml62.5mM
SDS0.4g2％（w/v）
Glycerol（甘油）2ml10%
DTT（二硫苏糖醇）1M1ml50mM
Bromophenolblue（溴酚蓝）0.01%（w/v）
A4.转移缓冲液：
74.5g甘氨酸,15gTris碱加水定容至1000ml，成5×stock，4℃保存。
使用前稀释成1×：
取200ml5×stock转膜缓冲液，然后加入600mlddH2O，最后加入200ml无水甲醇至1L，4℃预冷2h以上。
A5.Tris-甘氨酸电泳buffer（pH8.3）：
Trisbase15.1g和94g甘氨酸，溶解在900ml水中，然后加入5gSDS，再加水至1000ml，成5X。
A6.配胶所用溶液：
1）30％的凝胶储备液：
Acyl29g+Bis1g溶于100ml水，用滤纸过滤至棕色瓶中，4℃避光保存。
每次使用前先放置室温15-30min。
2）1.5mol/LTris-HCL,pH8.8：
18.16gTrisbase溶解在80ml水中，用浓盐酸调节pH值至8.8，待溶液回复到室温再用6M的盐酸调pH至8.8，最后加水至100ml，室温保存。
3）1.0mol/LTris-HCL,pH6.8：
12.12gTrisbase溶解在80ml水中，用浓盐酸调节pH值至6.8，待溶液回复到室温再用6M的盐酸调pH至6.8，最后加水至100ml，室温保存。
4）10%SDS：
称10克SDS溶于100ml水中，储存于室温。
TEMED（四甲基乙二胺）：
4℃避光保存。
5）10％APS（过硫酸铵）：
配制10ml,分装100-200uL至0.5ml离心管中，-20℃保存。
解冻后4℃保存，不超过1周。
A7.10×TrisBufferedSaline（TBS）：
24.2gTris碱，80gNaCl，定容至1L，HCL调pH至7.6。
A8.洗膜液：
1×TBS中含0.1％Tween-20（0.1％TBS/T）；或者是1×PBS中含0.1％Tween-20（0.1％PBS/T）
奶粉封闭液（30ml）：
30ml洗膜液（0.1％TBS/T）加入1.5g脱脂奶粉，室温下搅拌半小时以上。
终浓度为1×TBS含0.1％Tween-20（0.1％TBS/T），5％脱脂奶粉（w/v）。
BSA封闭液（15ml）：
15ml洗膜液（0.1％TBS/T）加入0.45gBSA，颠倒混匀。
终浓度1×TBS含0.1％Tween-20，3％BSA（w/v）。
（牛血清白蛋白BSA）
以上封闭液可用1×PBS/T代替1×TBS/T。
注意：
一般情况下，BSA用于多克隆抗体的封闭，脱脂奶粉用于单克隆抗体的封闭！
建议第一次使用的抗体可同时用这两种方法进行封闭，以确定哪种方法的封闭效果最好。
假如两种方法的效果无明显差别，必须用脱脂奶粉进行封闭（脱脂奶粉比BSA便宜很多！
）。
A9.一抗稀释液（8ml）：
8ml洗膜液（0.1％TBS/T）加入0.08gBSA（终浓度1%BSA），混匀后加入抗体。
常用的抗体加入10%的叠氮钠（1：
1000稀释，终浓度为0.01%，抑菌作用）4℃保存，不常用的抗体-20℃保存。
A10.二抗稀释液（10ml）：
用10ml0.1％TBS/T配制（1：
5000－10000）。
注意：
CST推荐使用NC膜，此protocol对NC膜进行了优化！
同时PVDF（聚偏氟乙烯）（使用前用纯甲醇泡膜半小时）也可以使用。
B试验步骤
B1.准备样品
使用前1ml1×SDS裂解液加入2.5μlPMSF（苯甲基磺酰氟），1μl氟化钠和1μl钒酸钠。
终浓度为1mMPMSF、5mM氟化钠和1mM钒酸钠。
注：
氟化钠和钒酸钠是磷酸酶抑制剂，因此，如果检测磷酸化蛋白，则必须在1×SDS裂解液加入这两种抑制剂。
1）按实验需要准备好细胞：
悬浮细胞：
400g离心5min收集细胞，1×PBS洗3次，前2次用10/50ml离心管收集并洗细胞，最后1次转移至1.5ml管中，并计算细胞数。
按比例加入1×SDS裂解液，一般为4x106细胞加入至少100μl裂解液，用heatingblock95℃煮5-10分钟，期间振荡一次，至用10uL枪吸取不感觉有粘稠则可。
贴壁细胞：
去掉培养基，1×PBS洗3次（去掉培养基中的血清），每个孔（12孔板）加入适量的1×SDS裂解液。
以Hep3B为例（检测磷酸化蛋白），一般为2x105细胞（70％的confluence）加入75μl裂解液（其它细胞可根据细胞大小及密度调整裂解液的量），迅速用细胞刮刮下细胞并转移至1.5ml管中，用heatingblock95℃煮5-10分钟，期间振荡一次，至用10uL枪吸取不感觉有粘稠则可。
其他细胞所加裂解液的量请参考附录3。
2）12，000g，4℃离心8min，收集上清。
3）直接上样跑胶或者分装-80°C长期保存。
B2SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
1）制备分离胶（5ml/gel）
注：
不同的分离胶配方可参见附录2或者《分子克隆》p1716表A8-9。
分离范围：
丙稀酰胺浓度％线性分离范围kDa
1510-43
1212-63
1020-80
7.536-94
5.057-212
2）小心注入分离胶，留2cm左右的空间（制胶架绿色边框下缘）给浓缩胶，顶层覆盖去离子水或水饱和正丁醇。
静置约30分钟。
3）制备浓缩胶（2ml/gel）
4）将浓缩胶注入分离胶上端，注意避免气泡。
5）插入梳子，待浓缩胶凝固（胶与梳子之间有明显的分界，加上分离胶的凝固时间要大于2h），用双蒸水将孔洗净，去除凝胶碎片，然后用滤纸吸干水。
6）将胶放入电泳槽，上下槽均加入1×电泳缓冲液（反复使用不要超过3次）。
7）上样：
取3ulprestainedmarker加入适量1×SDS裂解液（使得总体积与sample孔一样），load到胶最右侧的孔中。
Sample上样量一般为10－25μl，先用heatingblock95℃煮5-10分钟，期间振荡一次，然后快速离心再上样跑胶；在没有loadsample的孔中加入等体积的1×SDS裂解液。
8）电泳：
开始为恒流10-15mA每块胶，当跑过浓缩胶后，将电流加大到25mA每块胶，电泳时间根据目标蛋白的大小及marker的位置确定，一般为目标蛋白跑到分离胶的三分之二的位置即可。
B3膜转移
不同大小蛋白的转膜条件：
蛋白x（kDa）
转膜液
转膜条件
x<20
14.9g甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），用水定容至1L。
250mA恒流转3hrs
20配方同上
250mA恒流4hrs
12014.9g甘氨酸（0.2M），3.0gTris碱（25mM），200ml甲醇（20%，pH8.5），0.05%SDS，用水定容至1L。
250mA恒流转6hrs
200配方同上
500mA恒流转4hrs
B1.NC膜（表达丰度高或大于25kDa的蛋白用0.45um孔径的NC膜，小于25kDa且表达丰度低的蛋白用0.22um孔径的NC膜，0.22um孔径的NC膜比0.45um孔径的NC膜贵很多）用铅笔在膜正面的最上方写上待检测蛋白名称、日期；然后先把膜置于双蒸水面自然浸润10分钟（利用虹吸的作用排掉膜的空气，注意不要把膜直接浸入水中）后，再连同2张3mm滤纸和海绵完全浸入转移缓冲液中15分钟。
B2.在胶的最右侧上方切角做记号后，完全浸入转移缓冲液中15分钟。
B3.制备“夹心饼”：
依次按如下顺序：
纤维垫--滤纸--NC膜—凝胶—滤纸--纤维垫。
转膜后marker必须在膜正面的最右侧。
注意：
每加一种物品都要对齐，并用10ml离心管排气泡，确保没有气泡。
B4.转膜：
转膜时间根据1）确定。
NC膜一边接正极（红色），凝胶一边接负极（黑色）。
接电源前再三确认。
C膜封闭和抗体孵育
注意：
下面所用溶液的量适用于5cm×8cm（40cm2）的膜，用于不同面积的膜可根据比例自行调整！
C1.转膜以后，用15ml的1×TBS室温洗膜10分钟；
C2.30ml奶粉封闭液或者15ml的BSA封闭液室温孵育2h或者4℃平缓摇动（20-30rpm）过夜；
C3.15ml的0.1％TBS/T洗膜3次，每次摇5分钟（60rpm）；
C4.加入8ml一抗稀释缓冲液（抗体根据说明稀释），室温2hrs或者4℃平缓摇动过夜（对于磷酸化抗体一般情况下都要4℃过夜，因为磷酸化蛋白多数丰度较低），回收一抗，按1：
1000加入叠氮钠（可抑制细菌生长）4℃保存（不常用的抗体可-20℃长期保存），可重复使用！
C5.15ml的0.1％TBS/T洗膜3次，每次摇5分钟（60rpm）；
C6.加入二抗（10mlTBST配制，一般为1：
5000-10000稀释），室温平缓（20-30rpm）摇动1h；
C7.15ml的0.1％TBS/T洗膜3次，每次摇5分钟（60rpm）。
最后用TBS浸泡；
注：
每次应从杂交盒的同一角倒出液体，然后加入洗膜液润洗一次，马上倒掉，再加入洗膜液摇5min。
每次加入液体应沿壁，而不能对着膜。
D显影，定影
D1.显色步骤：
先铺吸水纸，在吸水纸上再铺上保鲜膜；分别将水、显影液（颜色变黑则不能用）和定影液倒入各自的盘中。
2.5mlECL-A和2.5mlECL-B混合,避光。
将ECL混合液、膜等拿入暗房。
关好门，反锁，拉回布。
ECL混合液倒入小盒中，膜用止血钳夹住一角提起，用吸水纸吸取膜边缘多余的液体后放入ECL混合液中，室温手摇5min（使得ECL均匀的铺过膜）。
5min后用吸水纸将膜边缘多余的液体吸取，然后把膜置于保鲜膜上，膜面朝下包好，然后膜面朝上置于夹子中，将剪好的X-film（注意手只能拿X-film的边缘，且手/手套必须保持洁净和干燥。
X-film大小与待检测区域大小相当即可，并在marker一侧的上方剪角）放于膜上，（注意：
取胶片时要把灯光调到最小，且不要对着灯光，应背着灯光。
），根据条带的亮度来调整曝光时间，一般可先曝光2min，观察条带的强度，再确定最佳的曝光时间。
ECL工作液在室温下避光保存至少2h以上，尽量集中安排实验。
D2.显影，定影:
取出X-film置于显影液中一定时间后（视目的条带强度与背景而定），水洗一次再置于定影液中定影5min以上，最后泡水。
当检测条带较弱时，可通过延长曝光和显影时间来增强信号。
E一抗和二抗的stripping
（2）辨识和分析评价对象可能存在的各种危险、有害因素，分析危险、有害因素发生作用的途径及其变化规律。
E1.一抗的strippingbuffer：
For100ml
3.划分评价单元20mlSDS10%
（四）建设项目环境影响评价的内容12.5mlTrisHCl（pH6.80.5M）
67.5ml超纯水
0.8mlß-mercaptoethanol（通风橱中加入）
操作步骤（下面所有步骤必须盖上盖子）：
1.
2.2）规划实施可能对环境和人群健康产生的长远影响。
将30mlstrippingbuffer在50℃水浴中预热10min；
3.把待strip的膜放入预热的buffer中；
4.
5.安全评价是落实“安全第一，预防为主，综合治理”方针的重要技术保障，是安全生产监督管理的重要手段。
50℃水浴30min，每10min手摇一次；
6.30min后，用0.1％TBS/T洗膜3次，每次10min以上，直至没有了2-ME的气味为止（因为2－ME对一抗是有害的！
）；
7.
8.1）直接使用价值。
直接使用价值（DUV）是由环境资源对目前的生产或消费的直接贡献来决定的。
重新封闭膜。
3）应用污染物排放标准时，依据项目所属行业、环境功能区、排放的污染物种类和环境影响评价文件的批准时间确定采用何种标准。
综合性排放标准与行业性排放标准不交叉执行，即：
有行业排放标准的执行行业排放标准，没有行业排放标准的执行综合排放标准。
E2.二抗的strippingbuffer：
For100ml
20ml5MNaCl，加入80ml超纯水，使NaCl终浓度为1M。
操作步骤：
1.将strippingbuffer在37℃水浴中预热10min；
2.
3.1）按类型分。
环境标准按类型分为环境质量标准、污染物排放标准（或控制标准）、环境基础标准、环境检测方法标准、环境标准样品标准。
把待strip的膜放入预热的buffer中；
4.
5.2.建设项目环境影响评价文件的报批时限37℃水浴30min，每10min手摇一次；
6.30min后，用0.1％TBS/T洗膜3次，每次10min；
7.
8.《中华人民共和国环境保护法》和其他相关法律还规定：
“建设项目防治污染的设施，必须与主体工程同时设计，同时施工，同时投产使用（简称“三同时”）。
防治污染的设施必须经原审批环境影响报告书的环境保护行政部门验收合格后，该建设项目方可投入生产或者使用。
”“三同时”制度和建设项目竣工环境保护验收是对环境影响评价的延续，从广义上讲，也属于环境影响评价范畴。
重新封闭膜。
注：
当待检测的蛋白不止一种，且一抗种属来源不同时，strip二抗即可。
附录1：
显影液和定影液配方
显影液
体系
A液
B液
C液
自来水
25L
5L
204ml
182ml
1L
200ml
8.2ml
7.3ml
785ml
500ml
100ml
4.1ml
3.65ml
393ml
30L
5L
204ml
182ml
1L
167ml
6.8ml
6.1ml
820ml
500ml
83.5ml
3.4ml
3.1ml
410ml
定影液
体系
A液
B液
自来水
25L
5L
460ml
1L
200ml
18.4ml
782ml
500ml
100ml
9.2ml
391ml
30L
5L
460ml
1L
167ml
15.3ml
820ml
500ml
83.5ml
7.65ml
410ml
显影液：
先加自来水，后加A液搅拌均匀，再加B液搅拌均匀，最后加C液搅拌均匀。
一次不要配太多（一次配500ml），使用到液体颜色变黑就配新的。
定影液：
先加自来水，后加A液搅拌均匀，最后加B液搅拌均匀。
一次不要配太多（一次配500ml），使用到效果变差（定影速度慢）就配新的。
附录2：
分离胶和浓缩胶配方
附录3：
细胞
所用孔板
收集蛋白时的细胞密度（％）
裂解液的量（uL）
检测蛋白类型
Hep3B
12孔板
50－70
75
磷酸化蛋白
Huh7
12孔板
50－70
75
磷酸化蛋白
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