抗生素发酵的过程之欧阳生创编.docx

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抗生素发酵的过程之欧阳生创编

现代抗生素工业生产过程如下：

时间：

2021.02.08

创作人：

欧阳生

菌种→孢子制备→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取及精制→成品包装

一、菌种

   从来源于自然界土壤等，获得能产生抗生素的微生物，经过分离、选育和纯化后即称为菌种。

菌种可用冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰箱（-190℃~-196℃）内保存。

所谓冷冻干燥是用脱脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起，经真空冷冻、升华干燥后，在真空下保存。

如条件不足时，则沿用砂土管在0℃冰箱内保存的老方法，但如需长期保存时不宜用此法。

一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。

北京天坛医院呼吸内科郭伟

二、孢子制备

  生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。

制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5-7日或7日以上，这样培养出来的孢子数量还是有限的。

为获得更多数量的孢子以供生产需要，必要时可进一步用扁瓶在固体培养基（如小米、大米、玉米粒或麸皮）上扩大培养。

三、种子制备

   其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进逐级扩大培养。

或直接将孢子接入种子罐后逐级放大培养。

种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。

扩大培养级数通常为二级。

摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后以无菌操作接入孢子，放在摇床上恒温培养。

在种子罐中培养时，在接种前有关设备和培养基都必须经过灭菌。

接种材料为孢子悬浮液或来自摇瓶的菌丝，以微孔差压法或打开接种口在火焰保护下按种。

接种量视需要而定。

如用菌丝，接种量一般相当于0.1%—2%（接种量的%，系对种子罐内的培养基而言，下同）。

从一级种子罐接入 

二级种子罐接种量一般为5%—20%，培养温度一般在25—30℃。

如菌种系细菌，则在32—37℃培养。

在罐内培养过程中，需要搅拌和通入无菌空气。

控制罐温、罐压，并定时取样作无菌试验，观察菌丝形态，测定种子液中发酵单位和进行生化分析等，并观察无杂菌情况。

种子质量如合格方可移种到发酵罐中。

四、培养基的配制

  在抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理生化特性不一样，采用的工艺不同，所需的培养基组成亦各异。

即使同一菌种，在种子培养阶段和不同发酵时期，其营养要求也不完全一样。

因此需根据其不同要求来选用培养基的成分与配比。

其主要成分包括碳源、氮源、无机盐类（包括微量元素）和前体等。

（1）碳源 主要用以供给菌种生命活动所需的能量，构成菌体细胞及代谢产物。

有的碳源还参与抗生素的生物合成，是培养基中主要组成之一，常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂类。

对有的品种，为节约成本也可用玉米粉作碳源以代淀粉。

使用葡萄糖时，在必要时采用流加工艺，以有利于提高产量。

油脂类往往还兼用作消沫剂。

个别的抗生素发酵中也有用麦芽糖、乳糖或有机酸等作碳源的。

（2）氮源 主要用以构成菌体细胞物质（包括氨基酸、蛋白质、核酸）和含氮代谢物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。

氮源可分成两类：

有机氮源和无机氮源。

有机氮源中包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉（它如果经精制以去除其中的棉酚后称phamamedia）。

玉米浆、蛋白胨、尿素、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉和菌丝体等。

无机氮源中包括氨水（氨水既作为氮源，也用以调节pH），硫酸铵、硝酸盐和磷酸氢二氨等。

在含有机氮源的培养基中菌丝生长速度较快，菌丝量也较多。

（3）无机盐和微量元素 抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长、繁殖和产生生物产品的过程中，需要某些无机盐类和微量元素。

如硫、磷、镁、铁、钾、钠、锌、铜、钴、锰等，其浓度与菌种的生理活性有一定影响。

因此，应选择合适的配比和浓度。

此外，在发酵过程中可加入碳酸钙作为缓冲剂以调节pH。

（4）前体在抗生素生物合成中，菌体利用它以构成抗生素分子中的一部分而其本身又没有显著改变的物质，称为前体（precursor）。

前体除直接参与抗生素生物合成外，在一定条件下还控制菌体合成抗生素的方向并增加抗生素的产量。

如苯乙酸成苯乙酰胺可用作为青霉素发酵的前体。

丙醇或丙酸可作为红毒素发酵的前体。

前体的加入量应当适度。

如过量则往往前体有毒性，并增加了生产成本。

如不足，则发酵单位降低。

   此外，有时还需要加入某种促进剂或抑制剂，如在四环素发酵中加入M-促进剂和抑制剂溴化钠，以抑制金霉索的生物合成并增加四环素的产量。

（5）培养基的质量 培养基的质量应予严格控制，以保证发酵水平，可以通过化学分析，并在必要时作摇瓶试验以控制其质量。

培养基的储存条件对培养基质量的影响应予注意。

此外，如果在培养基灭菌过程中温度过高、受热时间过长亦能引起培养基成分的降解或变质。

培养基在配制时的调节其pH亦要严格按规程执行。

五、发酵（见手机电子书）

发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。

在发酵开始前，有关设备和培养基也必须先经过灭菌后再接入种子。

接种量一般为10%或10%以上，发酵期视抗生素品种和发酵工艺而定，在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧，在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。

此外，还要加入消沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的PH。

对有的品种在发酵过程中还需加入葡萄糖、铵盐或前体，以促进抗生素的产生。

对其中一些主要发酵参数可以用电子计算机进行反馈控制。

在发酵期间每隔一定时间应取样进行生化分析、镜检和无菌试验。

分析或控制的参数有菌丝形态和浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。

其中有些项目可以通过在线控制。

（在线即online，指不需取样而直接在罐内测定，然后予以控制）。

六、发酵液的过滤和预处理

发酵液的过滤和预处理其目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去。

尽管对多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，抗生素存在于发酵液中，但也有个别品种当发酵结束时抗生素大量残存在菌丝之中，在此情况下，发酵液的预处理应当包括使抗生素从菌丝中析出，使其转入发酵液。

（1）发酵液的预处理  发酵液中的杂质如高价无机离子（Ca+2、Mg+2、Fe+3）和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸附。

如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产出乳化，用溶媒和水相分层困难。

对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸。

如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量。

如加磷酸（或磷酸盐），则既能降低钙离子浓度，也易于去处镁离子。

Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+Na+

如加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。

此外，这二者还有协同作用。

它们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。

2K4Fe（CN）6+3ZnSO4→K2Zn3[Fe（CN）6]2↓+3K2SO4 

某些对热稳定的抗生素发酵液还可用加热法。

使蛋白质变性而降低其溶解度。

蛋白质从有规律的排列变成不规则结构的过程称为变性。

加热还能使发酵液粘度降低、加快滤速。

例如在链霉素生产中就可用加入草酸或磷酸将发酵液调至pH3.0左右，加热至70℃，维持约半小时，用此方法来去除蛋白质，这样滤速可增大10—100倍。

滤液粘度可降低至1/6。

如抗生素对热不稳定，则不应采用此法。

为了更有效地去除发酵液中的蛋白质，还可以加入絮凝剂。

它是一种能溶于水的高分子化合物。

含有很多离子化基团，如一NH2 —COOH，—OH等。

如上所述，胶体粒子的稳定性和它所带电荷有关。

由于同性电荷间的静电斥力而使胶体粒子不发生凝聚。

絮凝剂分子中电荷密度很高，它的加入使胶体溶液电荷性质改变从而使溶液中蛋白质絮凝。

对絮凝剂的化学结构一般有下列几种要求：

1）其分子中必须有相当多的活性基团，能和悬浮颗粒表面相结合。

2）必须具有长链线性结构，但其相对分子质量（分子量）不能超过一定限度，以使其有较好的溶解度。

在发酵滤液中多数胶体粒子带负电荷，因而用阳离子絮凝剂功效较高。

例如可用含有季胺基团的聚苯乙烯衍生物，分子量在26000—55000范围内。

加入絮凝剂后析出的杂质再经过滤除去，以利于以后的提取。

（2）发酵液的过滤  发酵液为非牛顿型液体、很难过滤。

过滤的难易与发酵培养基和工艺条件，以及是否染菌等因素有关。

过滤如用板框压滤则劳动强度大，影响卫生，菌丝流入下水道时还影响污水处理。

故以选用鼓式真空过滤机为宜，并在必要时在转鼓表层涂以助滤剂硅藻土。

当转数旋转时，以刮刀将助滤剂连同菌体薄薄刮去一层，以使过滤面不断更新。

七、抗生素的提取

提取时目的是在于从发酵液中制取高纯度的符合药典规定的抗生素成品。

在发酵滤液中抗生素浓度很低，而杂质的浓度相对地较高。

杂质中有无机盐、残糖、脂肪、各种蛋白质及其降解物、色素、热原质、或有毒性物质等。

此外，还可能有一些杂质其性质和抗生素很相似，这就增加了提取和精制的困难。

由于多数抗生素不很稳定，且发酵液易被污染，故整个提取过程要求：

1）时间短；2）温度低；3）pH宜选择对抗生素较稳定的范围；4）勤清洗消毒（包括厂房、设备、管路并注意消灭死角）。

常用的抗生素提取方法包括有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。

今分述如下：

（1）溶媒萃取法 这是利用抗生素在不同pH条件下以不同的化学状态（游离酸、碱或成盐）存在时，在水及与水互不相溶的溶媒中其溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相（如发酵滤液）转移到另一种液相（如有机溶媒）中去，以达到浓缩和提纯的目的。

利用此原理就可藉助于调节pH的办法使抗生素从一个液相中被提取到另一液相中去。

所选用的溶媒与水应是互不相溶或仅很小部分互溶，同时所选溶媒在一定的pH下对于抗生素应有较大的溶解度和选择性，方能用较少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分离掉杂质。

目前一些重要的抗生素，如青霉素、红霉素和林可霉素等均采用此法进行提取。

（2）离子交换法 这是利用某些抗生素能解离为阳离子或阴离子的特性，使其与离子交换树脂进行交换，将抗生素吸附在树脂上，然后再以适当的条件将抗生素从树脂上洗脱下来，以达到浓缩和提纯的目的。

应选用对抗生素有特殊选择性的树脂，使抗生素的纯度超过离子交换有较大的提高。

由于此法具有成本低、设备简单、操作方便，已成为提取抗生素的重要方法之一。

如链霉菌素、庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素等均可采用离子交换法。

此法也有其缺点，如生产周期长，对某些产品质量不够理想。

此外，在生产过程中PH变化较大，放不适用于在PH大幅度变化时，稳定性较差的抗生素等。

3．吸附法利用各种吸附剂（如活性炭、大孔树脂等）吸附培养中的活性物质，而后用适宜的有机溶剂（如甲醇、丙酮）或它们的水溶液从吸附剂上洗脱活性物质。

必要时可加入稀酸或稀氨水帮助洗脱。

4．直接沉淀法有些活性物质（如四环素）可从培养液中借助pH的调节而沉淀下来；有的也可借加入与水相溶的有机溶剂（如丙酮）而沉淀；还有的可借加入某种离子与活性物质形成复合物而沉淀，例如四环类抗生素与尿素形成的复合物沉淀。

该法是提取抗生素的方法中最简单的一种。

5.其他提取方法 由于近年来许多抗生素发酵单位已大幅度提高，提取方法亦相应适当简化。

如直接沉淀法就是提取抗生素的方法中最简单的一种。

例如四环类抗生素的提取即可用此法。

发酵液在用草酸酸化后，加黄血盐、硫酸锌，过滤后得滤液，然后以脱色树脂脱色后，直接将其PH调至等电点后使其游离碱折出。

必要时将此碱转化成盐酸盐。

八、抗生素的精制

这是抗生素生产最后工序。

对产品进行精制、烘干和包装的阶段要符合“药品生产管理规范。

（即GMP）的规定。

例如其中规定产品质量检验应合格、技术文件应齐全、生产和检验人员应具有一定素质；设备材质不应能与药品起反应、并易清洗，空调应按规定的级别要求，各项原始记录、批报和留样应妥为保存，对注射品应严格按无菌操作的要求等。

下面对抗生素精制中可选用的步骤分述如下：

A 脱色和去热原质

脱色和去热原质是精制注射用抗生素中不可缺少的一步。

它关系到成品的色级及热原试验等质量指标。

色素往往是在发酵过程中所产生的代谢产物，它与菌种和发酵条件有关。

热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。

各种杂菌所产生的热原反应有所不同。

革兰氏阴性菌产生的热原反应一般比革兰氏阳性菌的为强。

热原注入体内引起恶寒高热，严重的引起休克。

它是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，为大分子有机物质，能溶于水。

在280℃加热4h它能被破坏90%；180—200℃加热半小时或150℃加热2h能被彻底破坏。

它亦能被强酸、强碱、氧化剂（如高锰酸酸钾）等破坏。

它能通过一般滤器，但能被活性炭、石棉滤材等所吸附。

生产中常用活性炭脱色去除热原，但须注意脱色时pH，温度、炭用量及脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，否则能影此外，也可用脱色树脂去除色素（如酚醛树指，即122树脂）。

对某些产品可用超微过滤办法去除热源，此外还应加强在生产过程中的环境卫生以防止热原。

响收率。

B 结品和重结晶 抗生素精制常用此法来制得高纯度成品。

常用的几种结晶方法如下：

（1）改变温度结晶  利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。

例如制霉菌素的浓缩液在5℃条件下保持4—6h后即结晶完全。

分离掉母液、洗涤、干燥、磨粉后即得到制霉菌素成品。

（2）利用等电点结晶 当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时,它在水溶液中溶解度最小，则沉淀析出。

如6—氨基青霉烷酸（6—APA）水溶液当PH调至等电点（4.3）时，6-APA即从水溶液中沉淀析出。

（3）加成盐剂结晶  在抗生素溶液中加成盐剂（酸、碱或盐类）使抗生素以盐的形式从溶液中沉淀结品。

例如在青霉素G或头孢菌素C的浓缩浓中加入醋酸钾、即生成钾盐析出。

（4）加入不同溶剂结晶 利用抗生素在不同溶剂中溶解度大小的不同，在抗生素某一溶剂的溶液中加入另一溶剂使抗生素析出。

如巴龙霉素具有易溶于水而不溶于乙醇的性质。

在其浓缩液中加入10—12倍体积的95%乙醇，并调PH至7.2—7.3使其结晶析出。

重结晶是进一步精制以获高纯度抗生素的有效方法．

C 其他精制方法

  其他精制方法包括：

（1）共沸蒸馏法如青霉素可用丁醇或醋酸丁酯以共沸蒸馏进行精制。

（2）柱层析法 如丝裂霉素A、B、C三种组分可以通过氧化铝层析来分离。

（3）盐析法 如在头孢噻吩水溶液中加入氯化钠使其饱和，其粗晶即被析出后进一步精制。

（4）中间盐转移法  如四环素碱与尿素能形成复盐沉淀后再将其分解，使四环素碱析出。

用此独以除去4-差向四环素等异物，以提高四环素质量和纯度，又如红霉素能与草酸或乳酸盐或复盐沉淀等。

（5）分子筛    如青霉素粗品中常含聚合物等高分子杂质，可用葡聚糖凝胶G—25（粒度20—80μm）将杂质分离掉。

此法仅用于小试验。

时间：

2021.02.08

创作人：

欧阳生