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枯草芽孢杆菌培养基的优化研究

毕业论文

课题名称枯草芽孢杆菌培养基的优化研究

2014年5月18日

摘要Ⅰ

枯草芽孢杆菌培养基的优化研究

摘要

本文选取BPG液体培养基研究该培养基配方对枯草芽孢杆菌生长的影响，通过相关资料的查询，选取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾这四个因素变量。

先通过单因素实验确定这四个因素的最适含量，再进行L9（34）正交试验确定BPG液体培养最适培养基组合。

最终得到最佳培养基配方含量是牛肉膏4.0g，蛋白胨3.8g，NaCl3.3g，葡萄糖4.0g，淀粉3.3g，KH2PO43.4g，MnSO4·7H2O0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0，其枯草芽孢杆菌生长量为3.631×107CFU/mL。

关键词：

枯草芽孢杆菌；葡萄糖；蛋白胨；牛肉膏；磷酸二氢钾；正交实验

Bacillussubtilisculturemediumoptimizationresearch

Abstract

ThisarticleselectedBPGliquidmediumtostudytheculturemediumformulaoftheeffectonbacillussubtilisgrowth,throughtherelevantinformationquery,glucose,peptoneandbeefextract,potassiumdihydrogenphosphatethisfourfactorsvariables.Firstdeterminedbysinglefactorexperiment,theoptimumcontentofthesefourfactors,thenL9（34）orthogonaltesttodeterminetheBPGliquidculturecombinationoptimalmedium.Finallyitistoknowthebestculturemediumformulacontentis0.40gofglucose,peptone0.38g,0.36gbeefpaste,potassiumdihydrogenphosphate0.34g.

Keywords:

Glucose,peptoneandbeefextract,potassiumdihydrogenphosphate,singlefactorexperiment,orthogonalexperiment

1前言

芽孢杆菌是人类最早发现的细菌之一[1]。

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），为芽孢杆菌属的革兰氏阳性菌，芽孢大小为0.6～0.9×1.0～1.5μm，外形为椭圆或柱状，一般处在菌体中央部位，形成芽孢后细菌体不会膨胀。

菌落外观粗劣并且不通透，颜色为白色和微黄色，在液体培养基中生长时，会形成皱褶，生长需要氧气。

枯草芽孢杆菌是一种重要的α-淀粉酶的生产细菌，它能合成α-淀粉酶及多种酶类，与消化道和动物体内的消化酶类共同发挥作用。

它在成长的过程中产生的枯草菌素、多粘菌素等活性物质，对致病菌和内源性感染的致病菌有着非常显著的抑制作用，而且作为好氧菌，可以迅速消耗肠道环境中的氧气，引起肠道缺氧，促进细菌的生长，并产生乳酸和其他有机酸，降低肠道pH值，对其他病原菌的生长起到不可忽视的作用[2]。

同时枯草芽孢杆菌是一种多功能、高效、安全和极具开发潜力的微生物菌种，已经广泛应用于各类科研领域，跟随着科研水平的提高和经济的发展，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活越来越密切，随之而来的就是对枯草芽孢杆菌越来越多的培养研究，为了在工业生产中提高枯草芽孢杆菌的产量和降低生产成本，因此我们需要研究出更好的枯草芽孢杆菌培养基[3]。

到目前为止，对枯草芽孢杆菌的国内外研究不在少数。

1945年约翰逊报告了枯草芽孢杆菌防治植物病害的控制作用。

此后，枯草芽孢杆菌制备的生防制剂用来防治植物病害的研究成为了国内外研究的热门话题。

1980年PapavizasGC报导，枯草芽孢杆菌可以用来防治水稻等作物受多种真菌的病害[4]。

1992年Hwang等报导，枯草芽孢杆菌可以防治豌豆的根腐病[5]。

20世纪90年代后，国外已有了多种枯草芽孢杆菌制剂投入市场。

美国Agraquest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株和QST2808菌株分别研制出活菌杀菌剂SerenadeTM和SouataAS，已在美国登记使用，叶面喷施能防止蔬菜，樱桃，葡萄，葫芦和核桃，霜霉病，白粉病，灰霉病，细菌和真菌疾病。

GBO3和MBI600分别由古斯塔夫森和微生物公司美国发展公司，根施或种子处理可以防止霉菌，镰刀菌，链格孢和丝核菌引起的大豆，小麦，棉花和花生根腐病。

2001古斯塔夫森将淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生物防治剂混合在一起，称为BioYield，解淀粉芽孢杆菌变种植物生长促进剂taensa商品生产，商品taegrotm，用于灌木、树苗和装饰植物根部的室内培养，用来防治根腐病和枯萎病[6]。

海内少许公司也对具备生防功能的枯草芽孢杆菌进行了研究，涉及的防治对象有土传病害和果实病害、大田作物的叶部病害等。

不同菌株有着不同的抑制作用，抑菌作用，抑菌机理。

如今已从植物的根部泥土、植物和叶片上分离出的许多枯草芽孢杆菌对不同作物的真菌和细菌病害具有抑制作用，与人工诱变方法做比较提高了应变和这些菌株的发酵条件，学习的效率，通过对一些抗菌物质的分离和研究它的特点，同时进行温室和田间生物防治剂的试验，海内已经成功研究出并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有根腐消等。

云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”获得农业部登记注册，在多个省市推广使用，推广面积约为4667hm2，主要防治三七根腐病、水稻纹枯病、烟草黑胫病，百抗的主要有效成分是枯草芽孢杆菌B908[7]。

江苏省农业科学院陈志谊等经过生物防治水稻病的研究获得了50.0％~81.0％的防治水稻纹枯病的效果，现已在江苏等地得到广泛推广；黑龙江省级科学研究院应用微生物研究所研发出来的枯草芽孢杆菌水剂主要用来防治瓜类及保护地蔬菜枯萎病、豆类根腐病和立枯病，已在黑龙江等地进行普及应用[8]。

枯草芽孢杆菌是当前应用最广泛的工业酶生产菌种之一，根据部分统计，枯草芽孢杆菌生产的酶占全部酶市场的50 %[9]。

由于枯草芽孢杆菌的优点，如安全性好、产酶量高、种类多和环保，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，在各领域发挥着重要作用，如发酵法生产的食品，饲料，酶洗，纺织，皮革，造纸，医药等。

枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，有较强的防病功能，美国到现在已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并在2000 年通过美国环保局（EPA） 的登记，用作防治多种作物的白粉病、灰霉病等病害；中国利用枯草芽孢杆菌，植物病害的防治已达到世界先进水平，商业制剂已研制成功并投入雅宝，百抗，丰宁生产，小麦曲宁产品如[10]。

枯草芽孢杆菌是基因工程菌的受体，是制备近200基因原核和真核细胞的本源，无论是在生产或研究中，都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面[11]。

枯草芽孢杆菌是国内准许使用的饲料微生物菌种，由于它的无毒害，经常被制造成为微生物添加剂，使用在改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病等方面。

枯草芽孢杆菌的内生孢子存在于制剂中，在动物肠道中，孢子能迅速恢复和分泌高活性的上肠蛋白质，脂肪，淀粉，有助于牧草碳水化合物的降解；此外，枯草芽孢杆菌为需氧菌，在厌氧环境中，可以通过肠耗氧促进肠道菌厌氧菌的繁殖，促进肠道的生态平衡[12]。

据研究，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可应用于多种疾病的感染，如肠炎、支气管炎[13]。

最初枯草芽孢杆菌在水产养殖中应用很晚，因为它可以分泌多种酶和抗生素，使池底积累大量的饲料、粪便、有害气体和动植物残体，使它成为小分子，然后分解为小分子有机物，最终分解为二氧化碳的水和无机盐，氨基氮水、亚硝酸盐和硫化物浓度减少，从而有效提高水的质量，而且还可以用于单细胞藻类浮游植物提供营养，促进再生。

研究表明，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用，枯草芽孢杆菌酶主要应用在食品工业领域，全世界食品工业用酶约占总量的60%，而中国高达85%以上[14]。

虽然如今化学杀菌剂在农药产业中占主要地位，但枯草芽孢杆菌杀菌剂所具备的优点，让它更加符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治的要求，如：

对人畜安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等。

枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化和抗菌作用的分子机制、抑制基因的克隆和其表达调控的研究已经积累了非常丰富的资料，具有重要的理论意义和生产价值。

为了提高枯草芽孢杆菌的产量和降低工业生产的成本，在参照已有研究资料的前提下，本文主要以BPG的液体培养基作为枯草芽孢杆菌的发酵培养基，并对培养基中葡萄糖含量，牛肉膏含量，蛋白胨含量，磷酸二氢钾含量作为研究因素，研究他们对枯草芽孢杆菌生长的影响，然后再对这几个单因素做正交实验，从而确定在工业生产中最佳培养基。

2材料与方法

2.1材料以及试剂

材料：

枯草芽孢杆菌（湖南师范大学微生物实验室提供）

试剂：

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾、氯化钠、可溶性淀粉、蒸馏水、硫酸锰等

2.2实验主要仪器设备

高压灭菌锅、超净工作台、35℃摇床培养、培养箱、光学显微镜、电烘箱、电子天平、分析天平、锥形瓶、移液管、烧杯、玻璃棒、培养皿、酒精灯、分光光度器等

2.3试验方法

2.3.1基础培养基的配置

BPG液体培养基：

牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO43.3g，MnSO4·7H2O0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

2.3.2实验方法

（1）标准曲线的制定

按照BPG液体培养基的配方：

牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO43.3g，MnSO4·7H2O0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0，配制好母液，高温蒸汽灭菌后，冷却待用。

然后将枯草芽孢杆菌的菌种接种到母液，35℃下摇床培养。

每隔3小时取样测定OD值，并且通过平板菌落计菌数。

根据所得数据制作标准曲线。

（2）BPG液体培养基的配置

在药剂柜中找出自己需要用到的药剂：

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾、淀粉、氯化钠、硫酸锰，准备1000mL的去离子水和pH试纸。

用电子天平分别称量牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO43.3g，MnSO4·7H2O0.2g，加入1000mL去离子水，将pH值调节到7，用玻璃棒搅拌均匀，使药品充分溶解。

（3）枯草芽孢杆菌母液的培养

将之前配制好的BPG液体培养基高温蒸汽灭菌，冷却，将枯草芽孢杆菌接种到其中，35℃摇床培养18h，分光光度仪及平板菌落计数法制作其标准曲线，待用。

（4）单因素试验培养基的配制

单因素实验BPG液体培养的配制，是在母液培养基配方的基础上缩小10倍配制的。

取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾四个因素进行单因素实验，每个因素取5个值进行实验。

葡萄糖为变量的配方：

在蛋白胨0.34g、牛肉膏0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，葡萄糖分别取0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g，加入100mL去离子水，将pH调节到7。

蛋白胨为变量的配方：

在葡萄糖0.34g、牛肉膏0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，蛋白胨分别取0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g，加入100mL去离子水，将pH调节到7。

牛肉膏为变量的配方：

在葡萄糖0.34g、蛋白胨0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，牛肉膏分别取0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g，加入100mL去离子水，将pH调节到7。

磷酸二氢钾为变量的配方：

在葡萄糖0.34g、蛋白胨0.34g、牛肉膏0.34g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，磷酸二氢钾分别取0.31g，0.32g，0.33g，0.34g，0.35g，加入100mL去离子水，将pH调节到7。

按照以上四个配方，用千分之一电子天平一一称量出需要的药品，将其配制好，高温蒸汽灭菌。

（5）接种

将母液中的菌液接种到单因素实验培养基中，每个培养基接种5mL菌液，35℃摇床培养18h。

（6）测量OD420值

将培养好的单因素实验中的BPG液体培养基用紫外分光光度计分别测量它的OD420值，记录。

（7）正交实验设计

在单因素实验完成的前提下，设计出L9（34）正交试验表，根据正交实验表将所需要配制进行正交实验的BPG液体培养基配制好，每个培养基中接种5mL菌液，35℃摇床培养18h。

培养好后一一检测OD420值，记录。

3结果与分析

3.1标准曲线的制定

3.1.1标准曲线制作的方法

（1）母液的培养

按照BPG液体培养基的配方：

牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g，KH2PO43.3g，MnSO4·7H2O0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0，配制好母液，高温蒸汽灭菌后，冷却待用。

（2）接种

将枯草芽孢杆菌的菌种接种到母液，35℃下摇床培养。

（3）检测OD420值和活菌数

在确定的培养基的基础上，每隔3小时取样测定OD值，并且通过平板菌落计菌数如下。

表3.1比浊法与平板菌落计数法测定活菌数的关系

时间（h）

0

3

6

9

12

15

18

21

24

OD

0.008

0.034

0.085

0.112

0.153

0.211

0.278

0.246

0.245

活菌数（×107CFU/mL）

0.10

0.50

1.30

1.80

2.60

3.10

3.60

3.30

3.10

从图3.1可以看出OD值与活菌数呈现的关系，得到的关系式Y=1.3×108X+1.6×106，其中R2=0.9706，基本符合线性关系。

所以当OD值≤0.278时，比浊法测定的OD值和活菌数呈现线性的关系。

图3.1OD420值与活菌数的关系

3.2单因素试验结果

在固定氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g、pH7.0、100mL水的前提下，通过四个单因素实验确定葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾的最适含量。

实验结果如下。

3.2.1葡萄糖含量对枯草芽孢杆菌生长量的影响

为确定葡萄糖的最适含量，在蛋白胨0.34g、牛肉膏0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，分别加入0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g的葡萄糖含量，35℃下培养18h，检测其OD420值，根据标准曲线换算，以确定葡萄糖的最佳含量。

结果见表3.2及图3.2。

表3.2葡萄糖含量对枯草芽孢杆菌生长的影响

葡萄糖含量（g）

活菌数（107）

OD420

0.32

2.279

0.163

0.34

2.201

0.157

0.36

2.487

0.179

0.38

2.708

0.196

0.40

2.617

0.189

图3.2葡萄糖含量对枯草芽孢杆菌生长的影响

图3.2显示，当葡萄糖含量为0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g时，其测得的OD420分别为0.163、0.157、0.179、0.196、0.189。

所以可以得出，随着葡萄糖含量的增大，OD420值也随之增加，直到葡萄糖含量为0.38g时，菌含量达到最高值，为2.708×107CFU/mL，之后随着葡萄糖含量的增加，菌含量值逐渐减小。

这是由于当碳源含量过高时，反而抑制微生物的生长，因此葡萄糖的最适含量为0.38g。

3.1.2蛋白胨含量对枯草芽孢杆菌生长量的影响

为确定蛋白胨的最适含量，在葡萄糖0.34g、牛肉膏0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，分别加入0.32g，0.34g，0.36g，0.40g的蛋白胨含量，35℃下培养18h，检测其OD420值，以确定最佳的蛋白胨含量。

结果见表3.3及图3.3。

图3.3显示，当蛋白胨含量为0.32g，0.34g，0.3i6g，0.38g，0.40g时，其测得的OD420分别为0.204、0.231、0.253、0.256、0.206。

所以可以得出，随着蛋白胨含量的增大，OD420值也随之增加，直到蛋白胨含量为0.38g时，菌含量达到最大值，为3.488×107CFU/mL，之后随着蛋白胨含量的增加，菌含量值逐渐减小。

这是由于碳源及氮源含量过高时，反而会抑制微生物的生长，因此蛋白胨的最适含量为0.38g。

表3.3蛋白胨含量对枯草芽孢杆菌生长的影响

蛋白胨含量（g）

活菌数（107）

OD420

0.32

2.812

0.204

0.34

3.163

0.231

0.36

3.449

0.253

0.38

3.488

0.256

0.40

2.838

0.206

图3.3蛋白胨含量对枯草芽孢杆菌生长的影响

3.1.3牛肉膏含量对枯草芽孢杆菌生长量的影响

为确定牛肉膏的最适含量，在蛋白胨0.34g、葡萄糖0.34g、磷酸二氢钾0.33g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，分别加入0.32g，0.34g，0.36g，0.40g的牛肉膏含量，35℃培养18h，检测其OD420值，以确定最佳的牛肉膏含量。

结果见表3.4及图3.4。

图3.4显示，当牛肉膏含量为0.32g，0.34g，0.36g，0.38g，0.40g时，其测得的OD420分别为0.187、0.194、0.184、0.220、0.178。

所以，由表3.4可以得出，随着牛肉膏含量的增大，OD420值也随之增加，直到牛肉膏含量为0.38g时，菌含量达到最大值，为3.020×107CFU/mL，之后随着牛肉膏含量的增加，菌含量值逐渐减小。

这是由于碳源含量过高时，反而会抑制微生物的生长，因此牛肉膏的最适含量为0.38g。

表3.4牛肉膏含量对枯草芽孢杆菌生长的影响

牛肉膏含量（g）

活菌数（107）

OD420

0.32

2.591

0.187

0.34

2.682

0.194

0.36

2.552

0.184

0.38

3.020

0.220

0.40

2.474

0.178

图3.4牛肉膏含量对枯草芽孢杆菌生长的影响

3.1.4磷酸二氢钾含量对枯草芽孢杆菌生长量的影响

为了确定磷酸二氢钾的最适含量，在蛋白胨0.34g、牛肉膏0.34g、葡萄糖0.34g、氯化钠0.33g、淀粉0.33g、硫酸锰0.02g的情况下，分别加入0.31g，0.32g，0.33g，0.34g，0.35g的磷酸二氢钾的含量，35℃培养18h，检测其OD420值，以确定最佳的磷酸二氢钾的含量。

结果见表3.5及图3.5。

图3.5显示，当磷酸二氢钾含量为0.31g，0.32g，0.33g，0.34g，0.35g时，其测得的OD420分别为0.175、0.189、0.247、0.218、0.187。

所以，由表3.5可以得出，随着磷酸二氢钾含量的增大，OD420值也随之增加，直到磷酸二氢钾含量为0.38g时，菌含量达到最大值，为3.371×107CFU/mL，之后随着磷酸二氢钾含量的增加，菌含量值逐渐减小。

这是由于无机盐含量的过高，反而会抑制微生物的生长，因此磷酸二氢钾的最适含量为0.33g。

表3.5磷酸二氢钾含量对枯草芽孢杆菌生长的影响

磷酸二氢钾含量（g）

活菌数（107）

OD420

0.31

2.435

0.175

0.32

2.617

0.189

0.33

3.371

0.247

0.34

2.994

0.218

0.35

2.591

0.187

图3.5磷酸二氢钾含量对枯草芽孢杆菌生长的影响

3.2正交试验结果

参照单因素实验，确定氯化钠加入量为0.33g、淀粉加入量为0.33g、硫酸锰加入量0.02g、pH为7.0、水加入量为100mL，以影响枯草芽孢杆菌生长量的葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾为四个影响因素，取各自三个水平进行正交实验，因素水平表见表3.6。

表3.6正交试验设计直观分析表

序号

A葡萄糖/g

B蛋白胨/g

C牛肉膏/g

D磷酸二氢钾/g

OD420

活菌数（107）

1

1（0.36）

1（0.36）

1（0.36）

1（0.32）

0.109

1.577

2

1

2（0.38）

2（0.38）

2（0.33）

0.187

2.591

3

1

3（0.40）

3（0.40）

3（0.34）

0.191

2.643

4

2（0.38）

1

2

3

0.154

2.162x107

5

2

2

3

1

0.168

2.344x107

6

2

3

1

2

0.009

2.770x106

7

3（0.40）

1

3

2

0.237

3.241x107

8

3

2

1

3

0.243

3.319x107

9

3

3

2

1

0.198

2.140x107

K1

0.487

0.500

0.361

0.485

K2

0.331

0.518

0.539

0.433

K3

0.678

0.398

0.596

0.588

K1

0.162

0.167

0.120

0.162

K2

0.110

0.173

0.180

0.144

K3

0.226

0.133

0.199

0.196

R

0.116

0.040

0.079

0.052

因素主次顺序A>C>D>B

优水平A3B2C3D3

优组合A3B2C3D3

通过实验结果的直观分析，8号组合A3B2C1D3的菌体含量最高；但是经过计算分析的最优水平为A3B2C3D3。

所以为了确定最优水平组合，分别按照这两个水平组合的培养基配方，配制BPG液体培养基，35℃下培养18h，测定其OD420值，确定最优水平。

实验结果如表3.7。

表3.7追加实验数据比较结果

水平组合

活菌数（107）

OD420

A3B2C3D3

3.631

0.267

A3B2C1D3

3.280

0.240

由表3.7可得，枯草芽孢杆菌最适生长量的最优组合为A3B2C3D3。

4.结论及讨论

本文选用BPG液体培养基来培养枯草芽孢杆菌，配方为牛肉膏3.4g，蛋白胨3.4g，NaCl3.3g，葡萄糖3.4g，淀粉3.3g