髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽免疫原性验证.docx

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髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽免疫原性验证

ＸＸ大学毕业论文

题目：

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽免疫原性验证

学生姓名：

XXX学号：

XXXXXXXXX

指导教师：

XXX职称：

教授

专业：

生物技术

院（系）：

生物工程系

完成时间：

2011年5月25日

2011年5月25日

摘要

目的：

通过实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE）小鼠模型的建立，验证固相合成法制备的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）抗原肽免疫原性。

并通过观察EAE病理学变化，初步探讨多发性硬化（MS）的发病机制。

方法：

本实验室利用Fmoc固相合成法制备的MOG35~55抗原肽（纯度>95%）加完全弗氏佐剂（CFA）免疫C57BL/6小鼠，观察小鼠发病情况，并采用双盲法进行神经功能评分。

利用电子显微镜观察EAE小鼠的病理学变化，分别采用HE染色、LuxolFastBlue髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。

结果：

MOG35~55成功诱导了C57BL/6小鼠EAE模型。

免疫后15天起，小鼠开始陆续出现临床症状，至第21天发病率达100%。

电子显微镜下可见EAE小鼠脊髓中典型脱髓鞘现象，并伴随有典型的炎性细胞的浸润。

结论：

用本实验室合成的抗原肽MOG35~55诱导的C57BL/6小鼠EAE模型，发病率高，模型稳定，为进一步研究多发性硬化（multiplesclerosis,MS）的发病机制与治疗打下基础。

关键词：

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、实验性自身免疫性脑脊髓炎、动物模型、神经病理学

Abstract

Objective

Themodelofexperimentalautoimmuneencephalomyelitis（EAE）wasestablishedinfemaleC57BL/6micetovalidatetheimmunogenicityofmyelinoligodendrocyteglycoprotein（MOG）,toobservepathologicalchangesofEAE,andtoexplorethepossiblepathogenesisofmultiplesclerosis（MS）.

Methods

Eachmousewasinjecteds.coverflankswithMOG35-55,MycobacteriumH37Ra,andCFA,injectedi.pwithpertussistoxin.TheclinicalsymptomswereobservedandthepathologicalchangesofEAEwerestudiedwiththeelectronmicroscopy.Consecutivesectionswerestainedwithhematoxylin/eosin（HE）andLuxolFastBlue（LFB）,toassessinflammationanddemyelination.

Results

TheincidenceofEAEinimmunizationanimalreached100%,mostmicedevelopedclinicalEAEwithinabout15daysofimmunizationMOG35~55peptides.WithElectronmicroscopy,inflammatorycellsinwhitematteranddemyelinationwereobserved.Andthecomponentofaxonisdisappeared.

Conclusion

TheimmunogenicityofMOG35~55synthesizedbytheimprovedsolid-phasesynthesismethodwasidentifiedbytheinductionofEAEinC57BL/6micewithstableperformanceandhighincidence,whichmaybehelpfulinexploringthemechanismandtherapyofMultiplesclerosis（MS）.

KeyWords:

Myelinoligodendrocyteglycoprotein（MOG）,Experimentalautoimmuneencephalomyelitis（EAE）,Mousemodels,Pathologicalchanges

引言1

一、材料和方法2

1.试剂和仪器2

1.1.主要试剂2

1.2主要仪器2

2.实验动物2

2.1小鼠来源2

2.2饲养3

3.EAE小鼠模型的制备3

4.神经功能评分3

5.脊髓组织病理学检测取材3

6.溶液的配制3

7.H&E、LFB染色4

7.1H&E染色4

7.2LFB染色4

8.数据分析及统计学处理5

二、实验结果与分析5

1.临床评分5

2病理学检测结果6

2.1H&E结果6

2.2LFB的结果7

三、讨论8

参考文献10

致谢12

引言

实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE）是研究多发性硬化（multiplesclerosis,MS）的经典动物模型，是由同种型、同种异型、异种型神经组织抗原诱导的中枢神经系统（centralnervoussystem,CNS）白质免疫炎性脱髓鞘性模型。

其病理特征和MS相似，均表现为CNS白质脱髓鞘改变和炎性细胞浸润。

制备EAE动物模型的方法多种多样，可通过注射CNS髓鞘、特定的髓鞘蛋白或其选择肽段加完全弗氏佐剂主动诱导；或转移已致敏的CD4+T细胞进行过继免疫诱导。

诱导EAE由于不同的致敏原，动物品系或诱导方法可以诱导产生不同类型或不同程度的EAE，所以制备EAE动物模型的方法多种多样。

目前报道较多的EAE模型动物是Lewis大鼠、SJL/J小鼠、B10.PL小鼠和PL/J小鼠等。

但国内不易获得这些啮齿类动物，因而在制作EAE动物模型时均不作为首选。

C57BL/6小鼠也是具EAE敏感特性的品系之一，其对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的敏感抗原表位是35~55位氨基酸。

MOG35~55抗原肽含21个氨基酸，分子量为2582.4道尔顿，是唯一既能引起脱髓鞘抗体反应又能引起T细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白成分。

虽然MOG在髓鞘蛋白中含量很少，但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，故具有高度免疫原性。

近年来用MOG诱导的EAE逐渐成为国际上研究MS的主要模型。

参照国内外文献报道的方法，结合本实验室的条件加以改进，拟采用MOG35~55作为抗原，辅以腹腔注射百日咳毒素，以期成功构建C57BL/6小鼠EAE模型，来验证其免疫原性；并采用双盲法进行神经功能评分，利用电镜观察EAE小鼠的病理学变化，分别采用HE染色、LuxolFastBlue髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。

一、材料和方法

1.试剂和仪器

1.1.主要试剂

MOG35-55多肽MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK由本实验室合成，合成纯度HPLC>95%，完全弗氏佐剂（CFA,Chodrex），百日咳毒素（Pertussistoxin,Sigma），结晶紫Cresylviole（Sigma），碳酸锂（上海华硕精细化学品有限公司），坚牢兰Luxol-fast-blue（AlfaAesar），伊红Y（kermel），PBS缓冲液（0.01M，PH7.4），苏木素（郑州派尼化学试剂厂），多聚赖氨酸（Sigma），多聚甲醛（Kermel），无水乙醇，甘油。

其它试剂均为国产分析纯。

1.2主要仪器

TDL80-2B离心机（Anke），超净工作台（苏州净化设备有限公司），电子天平（Sartorius），微量移液器（德国Eppendorf公司），4°C冰箱（Siemens），微波炉（海尔），冰盒，2ml、5ml玻璃注射器（上海鸽牌玻璃厂），医用一次性三通管（德国贝朗医疗股份有限公司），OlympusBX51荧光显微镜（日本Olympus公司），Leica石蜡切片机（Leica，RM2145），手术器械（眼科剪、眼科镊、手术刀等）。

2.实验动物

2.1小鼠来源

健康6~8周龄的雌性野生型C57BL/6（H-2b）小鼠（SPF级）共16只。

体重16~18g，购自中国医学科学院血液学研究所实验动物中心，许可证号：

SCXK（津）2004-0001。

正常组：

8只，不作任何处理，EAE病理模型组8只，诱导EAE模型。

2.2饲养

在ＸＸ大学生物工程系SPF级动物房中饲养、繁殖，幼鼠至八周龄后进行实验。

3.EAE小鼠模型的制备

C57BL/6小鼠随机分为EAE组和正常组，各8只。

MOG35~55多肽用PBS稀释后与完全弗式佐剂（结核杆菌的终浓度为4mg/ml）按等体积混合，用注射器反复推拉成油包水的乳剂，每只小鼠注射0.2ml乳剂，其中MOG35~55多肽剂量为300μg/只，分别于鼠背部两侧皮下注射；在第1次免疫后0小时和48小时腹腔注射百日咳毒素稀释液0.1ml，200ng/只。

正常组不做任何处理。

4.神经功能评分

自免疫当天开始，每日称体质量，观察小鼠的摄食情况，并从初次免疫第0天起至第31天实验终止前，采用盲法，每天2人至少1次在同一时间按Benson评分标准，对EAE严重性进行临床评估，评分≥2分以上者（包括2分）进行发病率的计算。

1级：

尾部无力或蹒跚步态伴尾部有力；2级：

蹒跚步态伴尾部无力（共济失调）；2.5级：

共济失调伴部分单肢麻痹；3级：

单肢完全麻痹；3.5级：

单肢完全麻痹伴另一肢体部分麻痹；4级：

双肢完全麻痹；4.5级：

四肢麻痹；5级：

死亡。

5.脊髓组织病理学检测取材

在EAE模型发病的高峰期，将小鼠脱颈处死，迅速取其脊髓，置于4%的多聚甲醛中固定，0.1mol/lPBS24小时、70%酒精30分钟、95%酒精I60分钟、95%酒精II60分钟、100%酒精I60分钟、100%酒精II60分钟、60°C二甲苯I60分钟、60°C二甲苯II60分钟、60°C石蜡I60分钟、60°C石蜡II60分钟后包埋。

将石蜡包块用切片机连续切成3~4μm切片，分别作H&E染色、LFB髓鞘染色。

6.溶液的配制

6.1Harris苏木精的配制：

苏示精1g、硫酸铝钾15g、无水乙醇10ml、蒸馏水200ml先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1分钟后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g。

继续加热至浆夜变为紫红色。

用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。

6.2乙醇性伊红液Y的配制：

伊红Y0.5g、90%酒精100ml先将伊红溶于酒精，用玻棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。

6.3盐酸酒精分化液的配制：

浓盐酸0.5~1ml、75%酒精99ml。

6.4LFB的配制：

LFB1.0g、95%酒精100ml、10%冰醋酸5.0ml混匀、过滤。

6.50.05%碳酸锂的配制：