黑曲霉发酵生产α淀粉酶1总结.docx
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黑曲霉发酵生产α淀粉酶1总结
产α-淀粉酶的黑曲霉上罐发酵技术和发酵动力学研究
摘要：
本实验通过对黑曲霉发酵生产α-淀粉酶上罐发酵技术和发酵动力学研究，每隔6h取一次发酵液
样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标，并绘制出变化趋势图，从而得到黑曲霉生产α-
淀粉酶过程中各项理化性质的改变，为工业生产提高发酵生产效率有指导意义。
关键词：
α-淀粉酶；黑曲霉；发酵；发酵动力学
THERESERCHONFERMENTATIONTECHNOLOGYAND
FERMENTATIONKINEYICSOFα-AMYLASEPRODUCTIONON
ASPERGILLUSNIGER
ABSTRACT:
Inthisstudy,AspergillusnigerFermentationonα-amylaseand
fermentationtankfermentationkinetics,6htakeabrothsampletestingitspHvalue,enzymeactivity,theamountofresidualsugarandbiomassfourphysiologicalindices,andeverydrawatrendchange,resultinginchangesAspergillusnigerα-amylaseproductionprocessofthephysicalandchemicalproperties,improvetheefficiencyoffermentationofguidingsignificanceforindustrialproduction.
KEYWORDS:
α-amylase;Aspergillusniger;fermentation;fermentationkinetics
α-淀粉酶普遍分布在动物、植物和微生物中，是一种重要的淀粉水解酶，它以随机作
用方式切断淀粉、糖原、寡聚糖或多聚糖分子内的
α-1，4葡萄糖糖苷键，产生麦芽糖、低
聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最广泛的酶制剂之一
［1］
。
耐酸性α-淀粉酶是在酸性条
件下水解淀粉的酶类，其最适
pH在4.0左右。
自从日本研究者
YasujiMinoda
［2］等人用黑
曲霉生产耐酸性
α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性
α-淀粉酶进行了研究，陆续发现枯草杆
菌、河内氏曲菌、青霉菌、酵母等都可以产生耐酸性
α-淀粉酶
［3-4］
。
通过黑曲霉发酵生产
α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。
初步了解
发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。
整个实验按照“菌种的培养
空消
实
消
接种
发酵
放罐”的发酵过程进行。
在整个发酵的过程中，每隔
6h取一次发
酵液样品检测其
pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。
最后将所测数据进行整理、
分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高
发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。
1材料与方法
1
1.1材料
1.1.1材料与试剂
原料：
黑曲霉
药品与试剂：
淀粉，蔗糖，柠檬酸氢二铵，KH2PO4,CaCl2，FeSO4˙7H2O，MgSO4˙7H2O，I2，
KI，K2HPO4，磷酸缓冲液（PH=6.0），稀碘液，浓硫酸，0.05%淀粉溶液，消泡剂（植物油）
蒸馏水
主要仪器和器材：
5L机械搅拌罐，高压蒸汽灭菌器，干热灭菌器，恒温培养箱，冰箱，水
浴锅，电磁炉，培养皿，三角瓶，小试管，大试管，移液枪，分光光度计
1.1.2培养基
可溶性淀粉75g，蔗糖75g，柠檬酸氢二铵80g，KH2PO415g，CaCl20.5g，FeSO4˙7H2O0.5g，
MgSO4˙7H2O0.5g，PH=5.0，消泡剂（植物油）2ml，加水定容至5L。
1.2方法
发酵罐机械搅拌发酵，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个
生理指标。
2实验内容
2.1实验步骤
2.1.1空消
先开启蒸汽发生器，自有蒸汽产生并排掉管路中冷凝水后，按以下步骤进行：
1．先关闭所有阀门，检查处是否关紧密封，打开罐上方排气口。
2．蒸汽先进空气系统，蒸汽→蒸汽过滤器→分过滤器，无论蒸汽走到哪一路得先放尾
阀，放出冷凝水，排掉冷空气，待有蒸汽冲出后调小，打开主阀。
3．再进罐体：
由主路进罐，然后通入取料管路，再入补料系统（两边）。
4．罐压升至所需温度（121℃）时开始计时，保温保压30min。
保压方式：
（1）调节主汽路进汽阀门控制进汽量；
（2）调节排气口排气量大小或尾
阀放汽量。
5．结束空消：
（1）逆着蒸汽进路关，先关近罐阀。
（2）同时准备好压缩空气确保蒸
汽一停即充入无菌压缩空气以维持空气系统及罐内的正压。
近罐空气阀的尾阀要一直微开
启。
2.1.2种子制备
接种黑曲霉于PDA液体培养基中，液体摇瓶培养。
2.1.3培养基配制、实消
可溶性淀粉75g，蔗糖75g，柠檬酸氢二铵80g，KH2PO415g，CaCl20.5g，FeSO4˙7H2O0.5g，MgSO4˙7H2O0.5g，PH=5.0，消泡剂（植物油）2ml，加水定容至5L。
关闭气路入罐阀，主汽路进汽→补料口进汽（方法同空消）→罐压升至0.12Mpa（121℃），保压、
2
保温30分钟→实消结束。
2.1.4冷却接种与发酵
待培养基冷却至28℃左右时，在加料口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打
开进料口，迅速接种。
将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。
2.2参数监测
每隔6h取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。
Ⅰ.pH的测定：
标准液校准pH计后，测定样品pH值。
Ⅱ.生物量的测定：
每次取20-30mL的发酵液，先用大离心机（5000rpm,3-5min）离心，
收集上清液，用小离心机（10000rpm，1min）用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然
后将所得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2h左右），然后测其干重，取平均值。
Ⅲ.酶活：
试剂：
（1）碘液：
称取0.5gI2和5.0gKI
研磨溶解于少量蒸馏水，定容至
100ml，于褐色试剂
瓶内保存，避免阳光直射。
（2）稀碘液：
取原碘液
1ml稀释100倍。
此溶液现配现用
（3）0.5%淀粉液：
称取干燥过的可溶性淀粉
0.5
克，加5ml缓冲液，搅拌混和，再徐徐倾
入70毫升煮沸的缓冲液中。
继续煮沸
2分钟，冷却至室温，定容至
100mL。
此溶液需要当
天配制
（4）磷酸缓冲液（pH6.0）：
0.2mol/LK
2HPO4（12.3mL）+0.2mol/LKH
2PO4（87.7mL）
方法：
取5ml0.5%的可溶性淀粉溶液，在
40℃水浴中预热10min，然后加入适当稀释
（6.0
的磷酸盐稀释缓冲液）的酶液0.5ml，反应5min
后，用5ml0.1mol/LH
2
SO终止反应。
取
4
0.5ml反应液与5ml
碘液显色，在
620nm处测光密度。
以
0.5ml
水代替0.5ml反应液
为空白，以不加酶液（加同样体积的缓冲液）的管为对照（即取
5ml0.5%的可溶性淀粉溶
液，在40℃水浴中预热
10min，然后加入
6.0的磷酸盐稀释缓冲液
0.5ml，反应5min后，
用5ml0.1mol/LH2SO4
终止反应。
取
0.5ml反应液与5ml
碘液显色）。
酶活力根据下式
计算：
酶活力（u/ml）＝（R0-R）/R0×50×D，式中
R0，R分别表示对照和反应液的光密度，
D
为酶的稀释倍数。
调整
D使（R0-R）/R0
在0.2-0.7
之间。
确定在
40℃、5min内水解1mg淀
粉的酶量为一个活力单位。
Ⅳ.残糖量的测定：
硫酸-蒽酮法测残糖含量
（1）原理
糖类与浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色与多糖含量有线性关系。
3
（2）试剂
①蒽酮试剂。
溶解0.2g蒽酮于浓硫酸（A.R.95.5%）100ml中，当日配制试用。
具体
实验过程中，应视样品分数多少来准备蒽酮试剂的配置量。
比如实测样品有50份，为了保
证结果的可靠性，安排个份样品试验重复数为3。
因为每个试验点实测需要4ml蒽酮试剂，
所以至少应配置的体积为4×3×50＝600ml。
此时还应考虑预实验和实验差错所消耗蒽酮
试剂量。
②标准糖试剂。
葡萄糖溶液（可加数滴甲苯防腐）
（3）操作及其注意事项
分别取0.1g/l的葡萄糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80ml，用蒸
馏水补到1.00ml，分别加入4.00ml蒽酮试剂，迅速进入冰水浴中冷却，各管加完后一起
浸入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。
自水浴重新煮沸开始计时，准确煮沸10min，
冷却后进行比色。
以光密度为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，制作标准曲线。
或使用计
算器进行一元回归得出计算式，以便于计算使用。
（4）样品含量测定
取糖浓度为50μg/ml左右的样品溶液1.00ml，一式3份分别置于不同试管中，对照加
入1.0ml蒸馏水，然后给各管加入蒽酮试剂，以标准曲线方法进行比色测定。
根据标准曲线
和样品浓度计算含量。
色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。
此外，试管在加入蒽酮试剂过程中，
移液管尖端在试管中所停留的高度对于加入蒽酮试剂的速度影响较大，而且对反应产生颜色
的深浅都会产生一定的影响。
因此，实验操作应该注意。
2.3后续工作
罐体清洗，药品整理归类，物品放好。
3数据处理
3.1葡萄糖标准曲线
4
3.2发酵液pH值的变化
发酵时间
0
9
14
20
24
33
38
44
48
53
62
（h）
pH
6.0
6.0
5.5
5.4
5.5
5.5
5.4
5.5
5.0
4.5
3.5
3.3生物量的变化
发酵时
9
14
20
24
33
38
44
48
53
62
0
间（h）
生物量
0.02600.04100.0930
0.03580.05090.07650.06980.07020.0907
0.1160
0
（g）
5
3.4残糖量变化
发酵时间
0
9
14
20
24
33
38
44
48
53
62
（h）
残糖量
2.26
2.075
1.306
0.539
1.880
2.284
1.040
1.230
1.054
0.976
0.83
（g/l）
0
0
3.5酶活变化
发酵
时间
0
9
14
20
24
33
38
44
48
53
62
（h）
酶活368576
804
1436
764
1351
2468
2279
2346
3469
6743
6
4实验结果分析
4.1pH值得变化：
发酵液的PH在发酵过程中总体趋势是逐渐下降的，且下降速度逐
渐加快。
实验中0-6h变化幅度不大，此时菌处于潜伏期内种代谢不旺盛，
故pH的变化不大。
12-18小时有所波动，可能是取样时出现误差，理论上应该是在
0=18小时变化不大。
18小
时过后，随后随着菌种的活化，菌种新陈代谢的旺盛
CO2的释放增加，pH值逐渐下降，且
下降速度逐渐加快。
4.2生物量变化：
理论上生物量整体上是呈上升趋势。
但是在
18小时时，出现生物量
很明显的增大，显然数据出现误差。
可能是烘干时没有干的彻底，
杂质掺入，或是统计数据
时出现错误。
在这之后，生物量出现缓慢上升趋势，
这是因为在发酵期间培养基的营养成分
是够黑曲霉生长所需的,它的增殖受到环境的影响不是很大
故其一直在增殖。
此外生物量曲
线出现较大的波动可能是操作的人员不同，实验手法也不一样，导致最终结果有所偏差。
4.3残糖的变化：
理论上应该是越来越小，但是实验中残糖的波动比较大，
归结原因可
能如下：
（1）操作不规范，稀释倍数不合理，也可能导致数据波动性较大
（2）由于本实
验是分批次进行的，因此实验操作者也不是唯一一个人，
不同的操作者都有不同的操作习惯，
步骤也不一定相同，可能也会导致数据波动
。
4.4α-淀粉酶的活力：
总体上是呈上升趋势，
0-36h内酶活测定数值比较小，因为在
发酵初期，有一段时间的延滞期，由于菌种的代谢慢，总量少。
36h后，由于菌种达到对数
期和稳定期黑曲霉的产酶能力加强，
酶活不断升高，且上升幅度也大大提高，
数量增加以后
产生的酶量便不断增加。
5注意事项
（1）通蒸汽前先关闭所有阀门
（2）粗过滤器不空消也不实消，要定期处理，所以必须关闭通向粗过滤器的阀门。
（3）活蒸汽，灭过头，即尾汽不能关死，要保证有活蒸汽放出，但不能太大，以免分压。
（4）罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。
7
（5）空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。
但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。
（6）进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。
6讨论
黑曲霉是最早发现能够产生α-淀粉酶的菌株，在日本、欧洲等过已经有用其进行工业
化应用的报道，是非常适合于工业化生产的菌株。
但是由于课题开展受时间、人员和实验手段的限制，本实验尚有很多不足之处，仍有许多需要进一步补充和完善的地方。
参考文献：
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132-136
书是我们时代的生命——别林斯基
书籍是巨大的力量——列宁
书是人类进步的阶梯———高尔基
书籍是人类知识的总统——莎士比亚
8
书籍是人类思想的宝库——乌申斯基
书籍——举世之宝——梭罗
好的书籍是最贵重的珍宝——别林斯基
书是唯一不死的东西——丘特
书籍使人们成为宇宙的主人——巴甫连柯
书中横卧着整个过去的灵魂——卡莱尔
人的影响短暂而微弱，书的影响则广泛而深远——普希金
人离开了书，如同离开空气一样不能生活——科洛廖夫
书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉——库法耶夫
书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者
———史美尔斯
书籍便是这种改造灵魂的工具。
人类所需要的，是富有启发性的养
料。
而阅读，则正是这种养料———雨果
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