淀粉酶发酵条件的优化2Word格式.docx

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3.2试剂

蛋白胨、酵母膏、NaCI、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、MgCl26H2O、CaCb2H2O

4.实验方法步骤及注意事项

4.1试验方法步骤

4.1.1种子培的配制

蛋白胨1.0%[

酵母膏1.0g%LpH5.5

NaCI0.5%一

将菌种接种到装有种子培养基的250mL三角瓶内，于37C,200rpm,培养16h。

4.1.2单因子分析

4.1.2.1碳源浓度对发酵产酶的影响

在六只250ml三角瓶中，依次加入0.35g（0.5%）、0.70g（1.0%）、1.05（1.5%）、1.40g（2.0%）、1.75g（2.5%）、2.10g（3.0%、葡萄糖，然后在六只三角瓶中都力卩入0.7gNH4NO3、0.07gKH2PO4、0.035gMgCl26H2O、0.007gCaCl22H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0,高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，相同培养条件下（37C,72h，200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。

4.1.2.2氮源浓度对发酵产酶的影响

在六只250ml三角瓶中，依次加入0.35g（0.5%）、0.70g（1.0%）>

1.05（1.5%）、1.40g（2.0%）、1.75g（2.5%）、2.10g（3.0%）NH4NO3，然后在六只三角瓶中均加入1.4g葡萄糖、0.07gKH2PO4、0.035gMgCl26H2O、0.007gCaCl22H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0,高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，相同培养条件下（37C,72h,200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。

4.1.2.3培养基pH对产酶的影响

在七只三角瓶中各加入1.4g葡萄糖、0.7gNH4NO3、0.07gKH2PO4、0.035gMgCl26H2O、0.007gCaC22H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，pH依次调至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5,高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，相同培养条件下（37C,72h,200rpm）摇瓶发酵，测定酶活。

4.1.2.4发酵时间对产酶的影响

在六只三角瓶中各加入1.4g葡萄糖、0.7gNH4NO3、0.07gKH2PO4、0.035gMgCl26H2O、0.007gCaC22H2O和70ml蒸馏水，搅拌溶解，调pH至6.0,高压灭菌，冷却后各接入11.2ml（16%）的种子培养基，摇瓶发酵（37C,200rpm）48h、60h、72h、84h、96h、108h,测定酶活。

4.1.3酶活的测定

4.1.3.1稀释酶液

4.1.3.2

操作步骤

空白管

样品管A

样品管B

步骤1

吸取1.8mL淀粉底物溶液

步骤2

I50E保温5分钟

50r保温5分钟

步骤3

加入待测酶液0.2毫升

步骤4

50C精确保温10min

50E精确保温10min

50T精确保温10min

步骤5

加入3mLDN黴剂终

止反应

加入3mLDNSC剂终

加入3mLDNS试剂终

步骤6

混合均匀

步骤7

加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min

沸水浴煮沸5min

步骤8

流水冷却

步骤9

加蒸馏水10mL混匀

步骤10

0®

onm比色

OD40nm比色

4.1.4正交试验

4.141根据碳源浓度、氮源浓度、pH、接种量对酶活性的影响，每个因素选取

三个水平（水平即在因素的允许变化范围内，要进行试验的“点”）进行正交试验。

A碳源浓度

B氮源浓度

C接种量

DpH

1

最优一0.5%

最优一2%

最优一0.5

2

最优

3

最优+0.5%

最优+2%

最优+0.5

4.1.4.2按照正交表L9表（L是正交表的代号，L右下角的数字表示试验次

数）进行试验。

试验号

A

B

C

D

4

5

6

7

8

9

4.1.4.3进行方差分析

4.1.4.4得出最佳方案

4.2注意事项

⑴灭菌锅使用时，先检查是否有水，再接通电源。

⑵试管上编号：

贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落。

⑶移液枪的使用：

向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头，实验结束后要及时清洗枪头。

⑷精确记时：

每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理。

⑸煮沸和用流水冲洗时要避免试管进水。

⑹接种时要保证在无菌环境下操作。

⑺分光光度计使用时应提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检。

⑻测酶活时，将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室。

⑼读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30%酒精

中。

⑽水浴锅中的水量要超过试管中的液面。

（11）接种后应振荡接种瓶，使菌种充分与培养基混合。

（12）正交试验设计时，确定因素应根据试验目的，选取主要因素，略去次要因素；

确定因素的水平时，应尽可能的保持各因素的水平数相同，以方便试验数据的处理。

5•实验数据处理方法

5.1酶活的计算

酶活=[（0.9511x+0.0493）X1000Xn]/（tXVXM）

（其中，0.9511X+0.0493:

葡萄糖的标准曲线方程；

x:

OD值；

n：

稀释倍数；

t:

反应时间；

V:

酶液的体积；

M葡萄糖的分子量）

0.1%葡萄糖的标准曲线y=0.9511X+0.0493

R=0.9919

5.2正交试验结果的分析利用SPSS寸正交试验结果进行方差分析，得出实验的最佳方案。

6.参考文献

[1]余龙江.发酵工程原理与技术应用.北京：

化学工业出版社，2006

[2]陈守文.酶工程.北京：

科学出版社，2008

[3]安戈等.1株酸性a-淀粉酶产生军的鉴定及发酵条件优化.安徽农业科学，2009

[4]刘建军,姜鲁燕.根霉PE-8菌株的选育及其淀粉降解酶类的研究1998（02）⑸孙君社.酶与酶工程及其应用•北京：

化学工业出版社.2006

⑹李春喜等•生物统计学（第四版）•北京：

科学版社.2008二.实验报告

1.实验现象与结果

1.1实验现象

⑴发酵培养基经灭菌后颜色会发生变化，由原来的白色变为亮黄色。

⑵摇瓶培养后，三角瓶中溶液的上方会出现一圈沉淀物。

⑶沸水煮沸5min后，溶液的颜色加深，并且空白管中溶液的颜色比其余两管的

要浅一些。

⑷做正交试验时，摇瓶培养后三角瓶中出现了一些球状物

1.2实验结果

1.2.1碳源（葡萄糖）浓度对发酵产酶的影响

碳源浓度（%

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

A管的OD值

1.152

1.515

1.725

1.987

3.764

2.931

B管的OD值

1.234

1.496

1.656

2.001

3.988

2.656

平均值:

1.193:

1.5055

1.6905

1.994

3.876

2.7935

酶活

32.888

41.144

46.032

54.050

103.771

73.803

1.2.2氮源（NH4NO3）浓度对发酵产酶的影响

N源浓度（%）

0.042

-0.057

-0.094

0.032

0.055

0.004

0.043

-0.023

-0.020

0.051

0.057

0.005

平均值

0.043:

-0.040:

-0.057:

0.056

0.0045

5.010「

4.958「

5.698「

2.977

123培养基pH对产酶的影响

PH

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

A管的0叫「

0.019

-0.011

0.023

1.247

1.752

「1.379

「1.083

0.013

0.021

1.441

1.680

1.391

1.291

0.016

0.022

1.344

1.716

1.385

1.187

1.792

1.951

36.877

46.705

「37.960

「32.729

1.2.4发酵时间对产酶的影响

发酵时间（h）

48

60

72

84

96

108

A管的ODfi

0.113

P1.500

1.523

0.149:

0.191

0.135

B管的ODfi

0.115

1.621

1.630

0.158

0.194

0.178

0.114

1.446

1.577

0.154

0.195

0.157

4.381

:

39.572

43.033

5.438:

6.521

5.517

1.2.5正交试验

125.1各个因素选取的三个水平

水平

（%

（ml）

14

16

18

1.2.5.1正交试验的结果

1号试验结果

编号7试管

总体均值

2.197

2.102

2.150

2.104

2.164

2.148

2.156

1.989

2.023

2.006

2号试验结果

编试管

总平均值

2.165

2.264

2.215

2.144

2.112

2.151

2.132

2.041

2.131

2.086

3号试验结果

编号*--一试管

0.183

0.181

0.182

0.179

0.172

0.176

0.174

0.177

0.180

号试验结果

编号试管

1.739

2.296

2.018

1.093

1.375

0.690

1.033

0.421

1.765

5号试验结果

编号管

0.249

0.355

0.302

1.168

1.686

2.012

0.849

1.201

1.135

0.168

6号试验结果

编号、一试管

1.315

1.295

1.305

1.287

1.274

1.30

1.292

1.281

7号试验结果

编号、〜试管

1.076

1.075

1.073

1.067

1.069

1.068

1.072

1.081

1.077

8号试验结果

1.875

1.883

1.879

1.808

1.763

1.729

1.746

1.795

1.802

1.799

9号试验结果

编号J试管

1.965

2.016

1.991

1.981

1.897

2.114

1.997

1.896

1.947

正交表

OD平均值

（U/min.ml）

酶活平均值

58.171

56.956

58.330

54.367

59.889

58.022

57.696

56.480

6.178

6.090

5.966

6.125

54.684

37.864

28.661

30.246

9.348

12.985

23.800

5.808

35.847

35.530

35.371

29.799

29.736

29.585

29.823

51.012

49.129

47.478

48.898

53.971

53.715

52.808

123.2正交方差分析结果

TestsofBetween-SubjectsEffects

DependentVariable:

酶活（U/min.ml）

Source

TypeIIISumofSquares

df

MeanSquare

F

Sig.

1CollectedModel

8547.064°

1068.383

30.466

.000

Intercept

38539.302

1098.982

TY

1156.816

578.408

16.494

DY

496.166

248.083

7.074

.005

JZL

6278.346

3139.173

89.516

615.736

307.868

8.779

.002

Error

631.227

35.068

Total

47717.594

27

CorrectedTotal

9178.291

26

a.RSquared=.931（AdjustedRSquared=.901）

SPSS分析结果整理如下:

方差来源

平方和

自由度

方差

显著性

极显著

误差

总和

2•对实验现象、实验结果的分析及其结论

2.1对实验现象的分析

由于发酵培养基的成分在灭菌的过程中会发生变化，因此培养基的颜色灭菌

前后会有一定的变化。

摇瓶培养后，三角瓶中溶液的上方有一圈沉淀物，说明已

经发生了酶促反应，培养基中已有淀粉酶的存在了。

沸水浴会使酶失活，而样品

管中的酶液与底物在这之前已发生了反应，而空白管中的底物还来不及反应就已

失活，故空白管中溶液的颜色要比样品管中溶液的颜色浅。

摇瓶培养后三角瓶中

出现了一些球状物，说明培养基已被污染。

2.2对实验结果的分析

2.2.1碳源浓度对发酵产酶的影响当碳源浓度为2.5%时，淀粉酶的活性最高。

2.2.2氮源浓度对发酵产酶的影响当氮源浓度为2.5%时，淀粉酶的活性最高。

2.2.3培养基pH对产酶的影响

当pH为5.5时，淀粉酶的活性最高。

2.2.4发酵时间对产酶的影响

当发酵时间为为72h时，淀粉酶的活性最高。

2.2.5正交试验结果分析

当碳源浓度为2.0%、氮源浓度为2.5%、接种量为16ml、pH为5.5时，淀粉酶的活性最咼。

226方差分析

碳源浓度、氮源浓度、接种量、pH对酶活的影响都达到了极显著的水平。

2.3结论：

淀粉酶发酵条件的最优组合：

碳源浓度为2.0%、氮源浓度为2.5%、接种量为16ml、pH为5.5。

2.实验总结

3.1本次试验的成功之处及其原因分析

本次实验虽然步骤繁多但经过各个小组的分工合作基本都完成了实验要求，

大体上达到了实验的目的，得出了淀粉酶产生菌的发酵条件的最佳方案。

究其原

因我认为有以下几点：

⑴小组成员间良好的分工合作，既节约了时间又按质完成了实验。

⑵老师对实验步骤的耐心讲解。

⑶实验过程中遇到问题时，及时向老师和同学请教，以免犯下不可弥补的错误。

⑷实验过程中按照实验步骤仔细、耐心地进行操作，不急于求成。

⑸课前做了一定的准备。

3.2本次试验的失败之处及其原因分析

本次试验的失败之处在于酶活的测定误差较大，有时会出现负值，有时A、

B两管的差距会有些大，而且酶活不是很高。

这可能是由于我们在操作时一些细节做得不够，如计时和液体量吸取时的精确性。

此外，在做正交试验时，摇瓶培养后三角瓶中出现了一些球状物，这说明淀

粉酶产生菌已被污染，这很有可能是由于在无菌操作时出了问题。

3.3对自我的评价

通过本次实验，我深刻地认识到了分工合作的重要性，良好的分工合作有助于我们更高效地完成实验，而且也让我知道了课前做好预习的重要性，因为课前

做好了预习有助于跟上老师的节奏，更好地理解实验内容、完成实验。

此外，本次实验还使我深深地体会到了“细节决定成败”这一句话，因为在本次试验中只有规范地使用移液枪，精确地计时，才能得到准确的实验结果。

另外，由于操作时没有严格地在无菌条件下进行以致于有两瓶淀粉酶产生菌被污染，因此如果有

机会重做这个实验，我一定会严格按照实验步骤进行操作，更加地注意一些细节，争取做得更好。

除此之外，由于本次实验要求对结果进行方差分析，这也就帮我们巩固了生物统计学的知识，加强了我们的数据处理能力，体会到生物统计学的重要性。

教师评语及评分：

签名: