届二轮复习基因工程与细胞工程学案全国通用.docx
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届二轮复习基因工程与细胞工程学案全国通用
2019届二轮复习基因工程与细胞工程学案
考点一 基因工程
强化学思知能 学有所思，思有深度
[知识·核心·热点]
熟记基因工程的四个操作步骤（填空）
1．目的基因的获取途径：
2.基因表达载体的构建——重组质粒的构建：
①表达载体的组成：
目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。
②启动子和终止子：
启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。
3．将目的基因导入受体细胞：
4.目的基因的检测与鉴定：
①导入检测：
DNA分子杂交技术（使用DNA探针）
③个体生物学水平鉴定：
如对转基因作物进行抗虫或抗病等接种实验。
[范例·调研·方法]
【典例1】 （2016·江苏卷）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。
请回答下列问题：
（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用BclⅠ和Hind_Ⅲ两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过（DNA）连接酶作用后获得重组质粒。
为了扩增重组质粒，需将其转入处于感受态的大肠杆菌。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙。
（3）若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶都不能（填“都能”“都不能”或“只有一种能”）切开。
（4）若用Sau3AⅠ酶切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
1．抓信息：
限制酶、识别序列、重组质粒、PCR、引物。
2．点思路：
【学发挥】——高考大题长句表达专项练
利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化。
题组冲关调研 练有所得，得有高度
1．知识性失误（判断正误）
（1）启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用（ × ）
提示：
启动子在转录过程中起作用，终止密码子在翻译过程中起作用。
（2）携带链霉素抗性基因受体菌的筛选必须通过分子检测（ × ）
提示：
携带链霉素抗性基因受体菌的筛选，可用含链霉素的培养基进行培养，能存活的受体菌即含有相应的抗性基因。
（3）用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸（ × ）
提示：
限制性核酸内切酶只能切割特定的脱氧核苷酸序列，而烟草花叶病毒的核酸是核糖核苷酸。
（4）自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程（ × ）
提示：
噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上属于基因重组。
（5）构建人胰岛素基因表达载体，表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点（ × ）
提示：
表达载体的复制启动于复制原点，胰岛素基因的表达启动于启动子。
（6）重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接（ × ）
提示：
重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子的碱基能够互补配对。
（7）应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达（ × ）
提示：
应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在，但不能检测基因的表达。
（8）动物的生长激素基因转入植物后不能表达（ × ）
提示：
不同生物共用一套遗传密码，所以动物生长激素基因转入植物后也能表达。
（9）从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。
目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽（ √ ）
（10）采用蛋白质工程进一步改造AFB1解毒酶的基本途径是：
从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（ √ ）
2．（2018·新课标全国卷Ⅰ）回答下列问题：
（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Cohen）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。
该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达（答出两点即可）。
（2）体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白（或答噬菌体蛋白）组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。
在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。
为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
解析：
本题主要考查基因工程的相关知识。
（1）体外重组的质粒可以进入受体细胞，且重组质粒在不同细胞中能正常表达，说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同，生物界共用一套遗传密码。
（2）基因工程中，受体细胞为大肠杆菌细胞时，常用Ca2＋处理大肠杆菌，使之处于感受态，即Ca2＋参与的转化法。
噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。
因噬菌体的宿主是细菌，故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。
（3）为防止目的基因表达的蛋白质被破坏，可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。
3．（2018·新课标全国卷Ⅱ）某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。
某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1 GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1和E4。
使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。
（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：
将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。
解析：
（1）构建基因表达载体时，使用的限制酶不能破坏融合基因。
选用产生不同黏性末端的两种限制酶，可以防止自身环化，并且保证融合基因和质粒正确连接。
（2）在牛的皮肤细胞中观察到绿色荧光，说明L1基因已经表达，即在该皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。
（3）培育转基因的克隆牛需将含目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中。
（4）为检测克隆牛的不同组织细胞中是否含有融合基因，需提取不同组织细胞的核DNA作为PCR模板，用PCR方法进行鉴定。
4．（2018·江苏卷）为生产具有特定性能的α淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备α淀粉酶，实验流程见图。
请回答下列问题：
（1）利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。
（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。
（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中②的设定与引物有关，⑥的设定与扩增片段的长度有关。
（填序号）
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间
（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含8个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有13种。
（5）获得工程菌表达的α淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
根据上述实验结果，初步判断该α淀粉酶活性最高的条件为pH为8.5，缓冲液为50_mmol/L_Tris HCl。
解析：
（1）由题干信息可知某种海洋细菌含有α淀粉酶基因，因此在扩增α淀粉酶基因前需先从细菌中提取细菌的基因组DNA。
（2）由于引物的作用是引导子链的延伸，将脱氧核苷酸连接到引物上时，是与引物的3′端相连的，由此确定需在引物的5′端加上限制性酶切位点。
常在两条引物上加入不同的限制酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，防止自身相连。
（3）进行PCR扩增时，退火的温度与引物长短和碱基种类有关。
延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。
（4）密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基，该mRNA上5′端为AUG（起始密码子），因此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基，可得出共有8个密码子。
由于虚线框后的第一个密码子已经固定为U，因此还有2个碱基未知，共可能有的种数为4×4＝16，又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子，因此决定氨基酸的密码子最多有13种。
（5）据表格数据可知：
α淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50mmol/LTris HCl的条件下相对活性为99.5%，初步判断此条件下酶活性最高。
5．（2018·天津卷）甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。
我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
（1）改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。
以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用PCR技术扩增，并将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。
与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽（或蛋白质），因此不能产生子代病毒。
将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
（2）构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。
设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与
（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa）。
将该基因与载体连接后导入宿主细胞。
提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
（3）利用转基因宿主细胞制备疫苗。
将
（1）中的重组质粒导入
（2）中的转基因宿主细胞，并在补加非天然氨基酸（Uaa）的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。
特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是D（单选）。
A．病毒的DNA聚合酶B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶D．宿主的RNA聚合酶
（4）上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。
与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起细胞免疫，增强免疫保护效果。
解析：
本题主要考查基因工程的相关知识。
（1）利用PCR技术体外扩增DNA。
若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列，则改造后的基因转录合成的mRNA中，终止密码子提前出现，将不能控制合成完整长度的多肽（或蛋白质）。
（2）目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。
可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定，以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。
（3）由
（2）知，转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tRNA，该tRNA的反密码子可与终止密码子配对，并可携带非天然氨基酸（Uaa），所以培养基中需补加非天然氨基酸（Uaa）。
病毒中的基因进行转录时，识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。
（4）因该病毒疫苗具有侵染性，故可引起细胞免疫。
6．（2017·新课标全国卷Ⅰ）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。
已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。
回答下列问题：
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A。
（2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。
因为与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养（答出两点即可）等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是蛋白A的抗体（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
解析：
本题主要考查基因工程的相关知识。
（1）从人的基因组文库中获得的基因A中含有内含子，而大肠杆菌属于原核生物，故大肠杆菌不能切除基因A初始转录产物中与内含子对应的RNA序列，故基因A在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。
（2）由于病毒对宿主细胞的感染具有特异性，噬菌体只能寄生在细菌细胞中，不能感染家蚕细胞，故应选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。
（3）与真核生物相比，大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点。
（4）检测基因A是否翻译出蛋白A，一般用抗原—抗体杂交的方法，即用蛋白A的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交，观察是否出现杂交带。
（5）肺炎双球菌转化实验的实质是S型菌的DNA进入R型菌体内，并可在R型菌体内完成表达，这证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，为基因工程奠定了基础。
7．（2017·新课标全国卷Ⅱ）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。
通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。
回答下列问题：
（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。
提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子（答出两点即可）。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
解析：
本题考查基因工程的相关知识。
（1）由于嫩叶组织细胞比老叶细胞易破碎，所以适于作为提取几丁质酶的mRNA的实验材料。
由于植物组织中存在的RNA酶能将RNA分解，所以实验过程中要添加RNA酶抑制剂以降低RNA酶的活性，保护提取的RNA不被分解。
（2）以mRNA为材料获得cDNA的过程为逆转录，即以mRNA为模板、以4种脱氧核糖核苷酸为原料，在逆转录酶的催化下，遵循碱基互补配对原则，合成cDNA的过程。
（3）由于目的基因无复制原点，也无基因表达所需的启动子和终止子，所以需与质粒构建重组质粒后再导入受体细胞。
（4）DNA连接酶可以催化两个DNA片段的黏性末端或平末端连接形成磷酸二酯键。
（5）几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中，但是植株抗真菌病的能力没有提高，从中心法则角度分析，可能是转基因植株细胞中几丁质酶基因不能转录或不能进行翻译导致的。
8．（2017·新课标全国卷Ⅲ）编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
（1）现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子。
（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为模板，加入了dNTP作为合成DNA的原料。
（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：
将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：
当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是进行细胞传代培养。
细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是维持培养液的pH。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少C（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
解析：
本题主要考查基因工程技术和动物细胞培养技术的原理。
（1）分析编码蛋白乙的DNA序列可知，起始端无ATG，转录出的mRNA不含起始密码子，所以直接利用该DNA片段构建的表达载体在宿主细胞中不能翻译出蛋白乙。
（2）进行PCR扩增时，需要在反应体系中加入热稳定DNA聚合酶、引物、模板DNA、原料dNTP（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）等。
（3）①因为动物细胞培养具有细胞贴壁和接触抑制的现象，当细胞浓度达到a时，若要使T淋巴细胞继续增殖，则需分瓶进行细胞传代培养；在培养箱中培养细胞时需提供一定的气体环境，其中CO2的作用是维持培养液的pH。
②由图2可知，加入蛋白丙刺激T淋巴细胞增殖的效果明显比蛋白甲、乙低；结合图1中蛋白丙与蛋白甲、乙的DNA序列可知，缺少C片段所编码的肽段，会降低蛋白刺激T淋巴细胞增殖的效果。
9．（2017·天津卷节选）玉米自交系（遗传稳定的育种材料）B具有高产、抗病等优良性状，但难以直接培育成转基因植株，为使其获得抗除草剂性状，需依次进行步骤Ⅰ、Ⅱ试验。
Ⅰ.获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如下图。
（1）为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是A（单选）。
①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点
②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
③酶切后，G基因形成的两个黏性末端序列不相同
④酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
A．①③ B．①④
C．②③D．②④
（2）下表是4种玉米自交系幼胚组织培养不同阶段的结果。
据表可知，细胞脱分化时使用的激素是2,4 D，自交系乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。
（3）农杆菌转化愈伤组织时，T DNA携带插入其内的片段转移到受体细胞。
筛选转化的愈伤组织，需使用含除草剂的选择培养基。
（4）转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化愈伤组织也可能在选择培养基上生长。
含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。
用K分别处理以下愈伤组织，出现蓝色的是BD（多选）。
A．无农杆菌附着的未转化愈伤组织
B．无农杆菌附着的转化愈伤组织
C．农杆菌附着的未转化愈伤组织
D．农杆菌附着的转化愈伤组织
（5）组织培养获得的转基因植株（核DNA中仅插入一个G基因）进行自交，在子代含G基因的植株中，纯合子占。
继续筛选，最终选育出抗除草剂纯合自交系A。
Ⅱ.略
解析：
Ⅰ.
（1）利用双酶切可有效防止出现限制酶切割后的产物（目的基因、载体）发生自身环化及目的基因与载体的任意连接现象。
这要求每种限制酶在Ti质粒内只有一个切割位点，含目的基因的DNA片段被两种限制酶切割形成的黏性末端碱基序列不同。
（2）细胞脱分化形成愈伤组织。
表格信息显示，使用了2,4 D促使细胞脱分化。
作为转化受体的幼胚，不仅要易脱分化，而且还要易再分化生芽、生根，故乙的幼胚最适合培养成愈伤组织作为转化受体。
（3）构建的基因表达载体中有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因（除草剂抗性基因位于T DNA片段上），因利用农杆菌转化法转基因时，只有T DNA整合到植物细胞染色体DNA上，故需使用含除草剂的培养基筛选转化的愈伤组织。
（4）因“含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达”，只有细胞内含有报告基因（成功转化）的愈伤组织，用K处理后出现蓝色，故选BD。
（5）转基因植株相当于携带G基因的杂合子，转基因植株自交，后代有3/4植株携带G基因，其中纯合子占1/3。
10．（2017·江苏卷）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。
PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
（1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点。
设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表变性，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。
退火温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。
退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有②③（填序号：
①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。
解析：
本题主要考查目的基因的获取及PCR技术的有关知识。
（1）依据题中表述现象分析，mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程，由mRNA直接逆转录形成的DNA为cDNA。
（2）构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶，因此推测在引物中需要增加适当的限制酶识别的位点。
设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形成碱基互补配对。
（3）图中步骤1代表变性。
（4）退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基互补配对。
由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强，因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量而定。
（5）温度过高不利于引物与模板结合；引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。
11．（2016·新课标全国卷Ⅰ）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。
有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。
结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。
被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有能自我复制、具有标记基因（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅
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