微生物实验讲义.docx

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微生物实验讲义

目录

实验一显微镜的使用及微生物形态的观察…………………1

实验二细菌的简单染色和革兰氏染色………………………8

实验三牛肉膏蛋白胨培养基的制备………………………13

实验四微生物的分离、纯化及培养特征观察……………21

实验五淀粉水解实验…………………………30

实验六空气中微生物的检测……………………………33

实验七大肠杆菌生长曲线的测定………………………38

主要参考文献……………………………………………………42

实验一显微镜的使用及微生物形态的观察

一、实验目的

1、学习并掌握油镜的原理和使用方法。

2、认识各种微生物的形态特征差异，学会生物图的绘制

二、实验内容

微生物的最显著特点就是个体微小，必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构，熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。

另外，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的形态结构的观察是微生物实验中十分重要的基本技术。

本实验着重于普通光学显微镜的结构和样品制作的介绍，同时进行细菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌的形态学观察。

其目的是在重点掌握明视野普通光学显微镜中油镜的使用的基础上，了解细菌等微生物形态结构的观察方法；初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知识，增强感性认识。

三、实验仪器、设备及材料

1、菌种：

枯草芽孢杆菌12-18h牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养物；大肠杆菌约24h牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养物；糖多孢红霉菌的高氏I号斜面培养物；酿酒酵母培养约2d的麦芽汁斜面培养物；白曲霉的马铃薯琼脂平板培养物。

2、溶液或试剂：

香柏油、二甲苯

3、仪器或其他用具：

显微镜、擦镜纸等。

四、实验原理

（一）显微镜的结构和光学原理

显微镜分机械装置和光学系统两部分，结构见图1-1。

1、机械装置

（1）镜筒：

镜筒上端装目镜，下端接转换器。

镜筒有单筒和双筒两种。

单筒有直立式和后倾斜式。

双筒全是倾斜式的，其中有一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。

两筒之间可调距离，以适应两眼宽度不同者调节使用。

（2）转换器：

转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。

不同规格的物镜分别安装在各孔上。

（3）载物台：

载物台为方形和圆形的平台，中央有一光孔，孔的两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移动，移动器的作用是夹住和移动标本用。

（4）镜臂：

镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。

镜臂有固定式和活动式两种。

（5）镜座：

镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。

（6）调节器：

调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。

可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。

调节器有装在镜臂上方或下方的两种，装在镜臂上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调焦距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。

图1-1显微镜的结构

2、光学系统及其光学原理

（1）目镜：

每台显微镜备有3个不同规格的目镜，例如：

5倍、10倍和15倍，高级显微镜除了上述三种以外，还有20倍的。

（2）物镜：

物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍（8×、10×、20×三种）、高倍（40×或45×）及油镜（100×）。

物镜的性能由数值孔径（NumericalAperture,N.A.）决定，数值孔径=n×sinα/2，其意为玻片和物镜之间的折射率乘上光线投射到物镜上的最大夹角的一般的正弦。

光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。

n是影响数值孔径的因素，空气的折射率n=1，水的折射率n=1.33，香柏油的折射率n=1.52，用油镜使光线入射α/2为60°，则sin60=0.87.从实验图1-2可知：

以空气为介质时，N.A.=1×0.87=0.87

以水为介质时，N.A.=1.33×0.87=1.16

以香柏油为介质时，N.A.=1.52×0.87=1.32

图1-2油浸的作用（引自周群英等编的《环境工程微生物学》）

显微镜的性能还依赖于物镜的分辨率，分辨率即能分辨两点之间的最小距离的能力。

分辨率用δ表示，δ=0.61×λ/N.A.（λ为波长），分辨率与数值孔径成正比，与波长成反比。

增大数值孔径，缩短波长可提高显微镜的分辨率，使目的物的细微结构更清晰可见。

事实上可见光的波长（0.38-0.7μm）是不可能缩短的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。

物镜上标有：

N.A.1.25、100×、“OI”、160/0.17、0.16等字样，其中N.A.1.25为数值孔径，100×为放大倍数，“160/0.17”中160表示镜筒长，0.17表示要求盖玻片的厚度，“OI”表示油镜，0.16为工作距离。

显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。

（3）聚光器：

聚光器安装在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，提高物镜的分辨率。

聚光器可上下调节，它中间装有光圈可调节光亮度，在看高倍镜和油镜时需调节聚光器，合理调节聚光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。

（4）反光镜：

反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镜。

它可自由转动方向。

反光镜可反射光线到聚光器上。

（5）滤光片：

自然光由各种波长的光组成，如只需某一波长的光线，可选用合适的滤光片，以提高分辨率，增加反差和清晰度。

滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等颜色。

根据标本颜色，在聚光器下加相应的滤光片。

3、油镜的工作原理

与其它油镜相比，油镜的使用比较特殊，需要在载玻片与镜片之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：

（1）增加照明亮度

油镜的放大倍数为100×，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。

从载玻片投过来的光线，因介质密度不同，有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。

所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与载玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（即香柏油，n=1.52）。

（2）增加显微镜的分辨率

由于香柏油的折射率比空气及水的折射率要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值要高于低倍镜、高倍镜等干镜。

若以可见光的平均波长为0.55μm计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不少于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。

五、实验步骤

（一）观察前的准备

1、显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3-4cm。

镜检时姿势要端正。

取、放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。

切忌用单手拎提，且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。

2、光源调节。

安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。

3、根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。

4、聚光器数值孔径值的调节调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。

有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。

使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。

因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应进行这样的调节。

在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。

当然，有关虹彩光圈、聚光器高度及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察结果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。

（二）显微观察

在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。

一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。

（1）低倍镜观察将枯草芽孢杆菌（或大肠杆菌、糖多孢红霉菌、酿酒酵母、白曲霉）的斜面培养物上挑取少许菌苔于载玻片上的水滴中，混匀并涂成薄膜，盖上盖玻片。

再将此玻片置于载物台，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。

下降10×物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图像清晰。

通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察玻片的各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。

在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。

（2）高倍镜观察在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。

对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节其使物像清晰，利用推进器移动载玻片仔细观察并记录所观察到的结果。

在一般情况下，当物像在一种物像中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。

利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或玻片。

（3）油镜观察在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。

在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中并几乎与标本相接。

将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能。

调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使用清晰准焦为止。

有时按照上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。

遇此情况，应重新操作。

另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。

（三）显微镜用毕后的处理

（1）上升镜筒，取下载玻片。

（2）用擦镜纸拭去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。

（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。

（4）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。

同时把聚光镜降下，以免将物镜与聚光镜发生碰撞危险。

六、实验报告要求

1实验名称、学生姓名、学号、班号和实验日期；

2实验目的和要求；

3实验仪器、设备与材料；

4实验原理；

5实验步骤；

6实验原始记录；

7实验结果及分析：

①分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、糖多孢红霉菌、酿酒酵母及白曲霉的形态，包括在三种情况下视野的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。

8讨论实验指导书中提出的思考题，写出心得与体会。

七、实验注意事项

1每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。

2认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需几下每次观察的现象和结果，以便分析。

3实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。

4实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇到盛菌的试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。

5实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。

若遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。

必要时用灭火机。

6使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。

对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。

7每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖0.5h擦去，如系芽胞杆菌，应适当延长消毒时间。

凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。

8每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于老师指定的地点进行培养。

实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携带出室外。

9每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。

10离实验室前将手洗净，注意关闭火、煤气、门窗、灯等。

此次实验的注意事项：

请注意实验步骤中段前打星号的字体加粗的段落！

八、思考题

（1）什么是物镜的同焦现象？

它在显微镜观察中有什么意义？

使用油镜为什么要先用低倍镜检查？

（2）在使用油镜观察时在载玻片和镜头之间加滴什么油？

起什么作用？

实验二细菌的简单染色法和革兰氏染色法

一、实验目的

1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握学习微生物染色原理

2、掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法

3、初步认识细菌的形态特征

4、巩固显微镜的使用方法

二、实验内容

为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。

用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。

发色基团赋予化合物的颜色特征，主色基团则给予化合物能够成盐的性质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。

染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。

在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属碱性染料。

这个实验着重于细菌的染色原理、染色的基本操作技术，同时也进行对大肠杆菌、枯草杆菌的形态学观察。

三、实验仪器、设备及材料

1、菌种：

枯草芽孢杆菌12-18h牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养物；大肠杆菌约24h牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养物。

2、染色剂：

草酸铵结晶紫染液、卢戈式碘液、95%乙醇、番红复染液。

草酸铵结晶紫染色液的配方：

溶液A：

结晶紫2g，体积分数95%的乙醇20mL；

溶液B：

草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。

溶液A和溶液B混合后，静置48h后使用。

卢戈氏碘液的配方：

碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。

先将碘化钾溶于少量蒸馏水，再将碘溶解在碘化钾溶液中，然后加入其余的水即成。

番红复染液的配方：

番红（番红花红O，藏红O）2.5g体积分数95%乙醇100mL，取20mL番红乙醇溶液与80mL蒸馏水混匀成番红稀释液。

3、仪器与其它用具：

显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，擦镜纸，生理盐水等。

四、实验原理

微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下，由于光源是自然光，使得微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态与结构，若增加其发差，微生物形态就可看得清楚。

通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。

微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。

所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。

两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基，呈碱性带正电。

在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。

经测定，细菌的等电点在pH=2-5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH〉7）或偏酸性（pH=6-7）的溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。

碱性染料有：

美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和番红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。

染色方法可分有简单染色法和复染色法。

简单染色法又叫普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。

复染色法即用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。

主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。

此处介绍革兰氏染色法。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。

本实验中介绍被普通采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。

革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法的基本步骤是：

先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。

经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细菌被染上复染剂的颜色（红色），则该菌属于革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。

事实上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小、透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。

革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

五、实验步骤

（一）细菌简单染色步骤

1、涂片

取干净的载玻片与实验台上，在正面边角做个记号并滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种（枯草芽孢杆菌或大肠杆菌）与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂片成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

（注：

活性污泥染色是用滴管取一滴活性污泥于载玻片上铺成一薄层即可）。

*载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。

2、干燥

最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。

但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。

3、固定

将已干燥的涂片正面朝上，在微小的火焰上通过2-3次，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上。

*热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。

4、染色

在载玻片上滴加染色液（草酸铵结晶紫），使染液铺盖涂有细菌的部位作用约1min。

5、水洗

倾去染液，斜置在玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至水呈无色为止。

*水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从在玻片的一端流下。

水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

6、干燥

自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干（将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，注意勿将细菌擦掉）。

7、镜检

用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。

（二）细菌的革兰氏染色

1、制片

同上，取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

*要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完成造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。

2、初染

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。

3、媒染

用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

4、脱色

用滤纸吸取玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

（注：

为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30s至45s，水洗）。

*革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。

脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。

5、复染

用番红复染液约2min，水洗。

6、镜检

干燥后，用显微镜观察。

六、实验报告要求

1实验名称、学生姓名、学号、班号和实验日期；

2实验目的和要求；

3实验仪器、设备与材料；

4实验原理；

5实验步骤；

6实验原始记录；

7实验结果及分析：

①根据简单染色的观察结果，绘出所看细菌的形态图。

②列表阐述2种细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。

③你的染色结果是否正确？

如果不正确，请说明原因。

8讨论实验指导书中提出的思考题，写出心得与体会。

七、实验注意事项

此次实验的注意事项：

请注意实验步骤中段前打星号的字体加粗的段落！

八、思考题

（1）你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？

其中最关键的环节是什么？

（2）革兰氏染色法中若只做1-4的步骤而不用番红染液复染，能否分辨出革兰氏染色结果？

为什么？

（3）微生物经固定后是死的还是活的？

如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？

如果加热温度过高，时间过长，又会怎么样呢？

（4）你认为革兰氏染色中，哪一部步骤可以省去而不影响最终结果？

在什么情况下可以采用？

（5）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?

（6）革兰氏染色中，初染前能加碘液吗？

乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？

（7）现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。

你怎么运用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性？

实验三牛肉膏蛋白胨培养基的制备

一、实验目的

1、熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作

2、明确培养基的配制原理

3、通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤

4、掌握高压蒸汽灭菌技术

二、实验内容

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物或积累代谢产物。

根据微生物的种类和实验目的不同，培养基按照成分的不同分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基；按照培养基物理状态又分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；按照培养基用途分为基础培养基、营养培养基（又称加富培养基）、鉴别培养基、选择培养基。

消毒和灭菌两者的意义有所不同。

消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，而灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体，芽孢和孢子。

在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。

消毒和灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。

而加热灭菌方法是最主要的，分为两种：

干热灭菌和高压蒸汽灭菌。

高压蒸汽灭菌比干热灭菌优越，因为湿热的穿透力和热传导都比干热的强，湿热时微生物吸收高温水分，菌体蛋白很易凝固变性，所以湿热灭菌效果好。

本实验是为实验三中的微生物纯种分离培养作准备，实验内容包括玻