仪器分析复习重点南京工业大学生物与制药工程学院.docx
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仪器分析复习重点南京工业大学生物与制药工程学院
仪器分析重点GC
1、GC仪和HPLC仪在结构原理上有何异同?
答:
同:
气源→→色谱柱→检测器→记录仪
进样
异:
(1)气源用气泵或贮气瓶供气;
(2)要让被测样品组分充分气化,相关通路中应具备高温(100~400℃)环境。
2、能够在GC上检测的化合物,应具哪些主要的理化特性?
答:
具有易挥发性、高温不分解、不能与载气发生反应。
3、GC常用载气有哪些?
答:
N2、H2、Ne
4、固定相、吸附剂、担体、固定液有何异同?
常见的气-固吸附色谱有哪些?
常见的担体、固定液有哪些?
答:
一、固定相主要分二大类:
(1)固体固定相
(2)液体固定相
气-固(吸附)色谱固定相吸附剂分类:
吸附剂
(1)非极性吸附剂:
如活性炭
(2)极性吸附剂:
如硅胶、氧化铝、分子筛等
气-液色谱(分配色谱)固定相
(1)固定液
(2)惰性担体
担体:
又称为载体,是一种化学惰性的多孔固体颗粒,作用是提供惰性表面,支持固定液,使固定液以薄膜状态分布在其表面。
二、常见的气-固吸附色谱
(1)非极性吸附剂:
如活性炭
(2)极性吸附剂:
如硅胶(较强极性)、活性氧化铝(弱极性)、分子筛等
三、常见的担体有:
(1)硅藻土型(红色硅藻土白色硅藻土)
(2)非硅藻土型
常见固定液
第一类:
非极性固定液
多数是饱和烷烃,如:
异角鲨烷。
固定液和组分分子间的作用力是色散力,主要用于分离烃类和非极性化合物
第二类:
弱极性固定液
主要是含甲基的硅氧烷类。
固定液和组分分子间的作用力为色散力。
第三类:
中等极性固定液
种类多、应用广,如硅氧烷(OV-17)等
5、GC检测器可分为哪几种类型(英文缩写),其工作原理是什么?
哪些属于浓度型检测器,哪些属于质量型检测器?
答:
(1)热导池检测器(TCD)
检测原理:
基于不同的物质有不同的导热系数
(2)(氢)火焰离子化检测器(FID)
原理:
根据气体的导电率与该气体中所含带电离子的浓度呈正比这一事实而设计的。
一般情况下,组分蒸汽不导电,但在能源作用下,组分蒸汽可被电离生成带电离子而导电。
(3)电子捕获检测器(ECD)
原理:
第一步:
形成约10-8A的基流
N2+β→N2++e-
第二步:
电子捕获
AB+e-→AB-+E
AB+e-→A·+B-+E
第三步:
生成中性化合物
AB-+N2+→AB+N2
A-或B-+N2+→中性分子→由载气带出
(4)火焰光度检测器(FPD)
原理:
利用在一定外界条件下(即在富氢条件下燃烧)促使一些物质产生化学发光,通过波长选择、光信号接收,经放大把物质及其含量和特征的信号联系起来。
按输出信号与组分含量关系:
(1)浓度型检测器(热导池检测器、电子捕获检测器)
(2)质量型检测器((氢)火焰离子化检测器、火焰光度检测器)
6、各种检测器一般用什么载气?
氢焰检测器、火焰光度检测器涉及到哪几种气体?
答:
热导池检测器(TCD:
用N2作载气,灵敏度较低,He、H2,灵敏度高
(氢)火焰离子化检测器(FID):
选用N2作载气
电子捕获检测器(ECD):
载气一般为N2或Ar
火焰光度检测器(FPD):
N2
氢焰检测器涉及:
H2、O2、N2
火焰光度检测器涉及:
H2、O2、N2
7、各种检测器在性能上各有什么特点?
各有什么缺点?
各有什么侧重应用?
答:
(1)热导池检测器(TCD)
由于结构简单,性能稳定,通用性好,而且线性范围宽,价格便宜,因此是应用最广,最成熟的一种检测器。
其主要缺点是灵敏度较低。
(2)(氢)火焰离子化检测器(FID)
特点:
灵敏度很高,比热导检测器的灵敏度高约103倍;能检测大多数含碳有机化合物;死体积小,响应速度快,线性范围也宽;结构不复杂,操作简单,是目前应用最广泛的色谱检测器之一
缺点:
不能检测永久性气体;燃烧会破坏离子原形,无法回收
(3)电子捕获检测器(ECD)
特点:
电子俘获检测器是选择性很强的、浓度型检测器
具有灵敏度高、选择性好
对电负性物质特别敏感
分析痕量电负性有机物最有效的检测器
广泛应用于农药残留量、大气及水质污染分析,以及生物化学、医学、药物学和环境监测
缺点:
是线性范围窄,只有103左右,且响应易受操作条件的影响,重现性较差
(4)火焰光度检测器(FPD)
它是一种对含磷、硫有机化合物具有高选择性和高灵敏度的质量型检测器,检出限可达10-12g(对P)或10-11g·(对S)
用于大气中痕量硫化物以及农副产品,水中的毫微克级有机磷和有机硫农药残留量的测定。
8、GC试验条件涉及哪些因素?
答:
一、分离效果指标
1、柱效能
2、选择性
3、总分离效能指标――分离度(又称为分辨率)
4、基本分离方程(n、α、k、R之间的关系)
二、色谱分离操作条件的选择
1、载气及流速
2、固定液的配比(又称为液担比):
影响CLu
3、柱温的选择
4、气化温度的选择
5、色谱柱长和内径的选择
6、进样时间和进样量的选择
7、检测室温度
8、样品的预处理:
分解法和衍生法
9、载气的流速一般为多少?
柱温的选择原则?
答:
一、流速大小:
若需用流速大的载气可用分子量小,扩散系数大的H2或He,减小气相传质阻力;若需载气流速小的载气,则可用分子量大,扩散系数小的N2或Ar为载气,减小分子扩散的影响
对于填充柱,N2的最佳实用线速为10~20cm/s,
H2的最佳实用线速为15~20cm/s
二、柱温的选择
1.在能保证R的前提下尽量使用接近或略低于组分的平均沸点的温度。
2.绝不能高于固定液使用温度。
3.宽沸程样品应采用程序升温
10、固定液的选择及用量,组分的流出先后(要会举一反三)。
答:
固定液用量及其配比的选择:
①固定液用量太少,易存在活性中心,致使峰形拖尾;且会引起柱容量下降,进样量减少
②常采用固定液和载体总重量之比来表示,简称液载比,在填充柱色谱中,液担比一般为5%~25%。
固定液选择及其组分流出先后关系:
(i)分离非极性物质:
一般选用非极性固定液
组分和固定液分子间的作用力主要是色散力
试样中各组分按沸点由低到高的顺序出峰
常用的有:
角鲨烷(异三十烷)、十六烷、硅油等
(ii)分离中等极性物质:
一般选用中等极性固定液
组分和固定液分子间作用力主要是色散力和诱导力。
试样中各组分按沸点由低到高的顺序出峰
(iii)分离极性物质:
选用极性固定液
组分和固定液分子间的作用力主要是定向力
待测试样中各组分按极性由小到大的顺序出峰
例:
用极性固定液聚乙二醇(PEG)-600,分析乙醛、丙烯醛气体混合物的情形就是这样,乙醛的极性比丙烯醛小,故先出峰
11、如何应用GC法进行化合物的定性鉴别和定量测定?
答:
详见Word版资料(第四章中定性鉴别与定量测定)
12、掌握内标法计算方法。
2、答:
内标法:
选择适宜的物质作为待测组分的参比物,定量加到样品中去,根据待测组分和参比物在检测器上的响应值之比和参比物加入量进行定量分析的方法。
关键:
选择合适的内标物
内标物的选择原则:
A、内标物必须是原样品中不存在的物质,其性质尽量与待测组分相近(同系物、异构体)
B、内标物不能和被测组分起化学反应,要能完全溶于被测样品中;
C、内标物的峰尽可能接近待测组分的峰,或位于几个待测组分的中间,但必须和样品中的所有峰完全分离;
D、内标物的加入量应和待测组分相近。
待测组分(i)的量mi为:
设样品的总量为m,则待测组分i的质量分数为
内标法的特点:
★无归一化法的限制,即只要被测组分能出峰,不和其他峰重叠,不管其他组分是否出峰或是否重叠,都可以用内标法进行定量分析
★定量准确,受操作条件影响较小
★可部分补偿待测组分在样品前处理时的损失
★若加入几种内标物,还可提高定量分析的精度
★内标物的选择比较困难,同时内标物称量要求准确,操作麻烦
·内标标准曲线法
从内标公式可知
如果每次称取同样量(m)的试样,每次加入相等量(ms)的内标物,则上式中m,ms,fi’均为常数,计算公式可写为:
例:
取二甲苯生产母液1500mg,母液中合有乙苯、对二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯及溶剂和少量苯甲酸,其中苯甲酸不能出峰。
以150mg壬烷作内标物,测得有关数据如下:
物质壬烷乙苯对二甲苯间二甲苯邻二甲苯
Ai/cm298709512080
f`m1.020.971.000.960.98
求:
各组分的含量。
解:
母液中苯甲酸不能出峰,所以只能用内标法计算。
由各组分的绝对校正因子计算得壬烷、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯的相对校正因子分别为1.00,0.95,0.98,0.94,0.96。
根据内标法计算公式,对于乙苯有:
同样可以计算出对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯的质量分数分别为9.5%,11.5%,7.84%。
HPLC
1、按功能结构高效液相色谱仪可分为那几个大部分?
答:
分为五个部分:
梯度淋洗系统、高压输液泵与流量控制系统、进样系统、分离住与检测系统。
2、根据分离原理,高效液相色谱仪的检测器分为哪几大类?
哪些是通用检测器,哪些是选择性检测器?
哪些是浓度型检测器,哪些是质量型检测器?
答:
紫外检测器、荧光检测器、电导检测器、示差检测器(选择性检测器、浓度型检测器)
示差检测器、蒸发光散射检测器(ELSD)(通用型检测器。
质量型检测器)
3、各种检测器的检测原理?
流速对各种检测器的检测信号强度和峰面积有何影响?
答:
(1)紫外检测器(选择性检测器)
原理:
基于被分析组分对特定波长紫外光或可见光的选择性吸收。
吸光度与试样组分浓度之间的定量关系符合朗伯-比尔定量。
(2)荧光检测器(选择性检测器)
原理:
化合物受到紫外光的照射后,吸收辐射能,发出比吸收波长长的特征辐射,这种特征辐射光线就是荧光,测定发出的荧光能量即可定量
(3)电导检测器(选择性检测器)
原理:
根据某些物质在溶液中可分生电离从而引起溶液电导率的变化的特性进行检测。
(4)示差检测器(通用型检测器)
原理:
示差折光检测器是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折光指数之差来测定样品浓度
浓度型响应信号与流速无关,峰面积与流速有关(流速越快,峰宽越小,峰面积越小)
响应信号与流动相中组分的浓度有关的检测器称为浓度型检测器。
响应信号与耽误时间内进入检测器中组分的量的多少有关的检测器称为质量型检测器。
质量型检测器的响应值与流量成正比、峰面积与流速无关。
输出信号:
HPLC图,以时间为横坐标,以信号强度mv为纵坐标。
4、检测器的性能指标有哪些?
理解各种指标的含义,比较检出限D、最小检测量Q0异同?
答:
衡量检测器性能的主要指标:
灵敏度、检测限和检测器的线性范围
(1)灵敏度:
单位浓度或质量的组分通过检测器时所产生的响应信号R的大小叫灵敏度。
(2)检测限D定义:
某组分的峰高(mV)恰为噪音的2倍(或3倍)时,单位体积(或时间)引入检测器的试样量。
(3)最低检出量
最小检测量Q0表示检测器能产生和噪音相鉴别的信号时,进入色谱柱的最小物质量(或浓度)
对于质量型检测器:
对于浓度型检测器:
5、
什么叫吸附平衡常数,吸附平衡常数与组分流出先后的关系?
理论上组分从色谱柱中流出曲线呈什么形状?
答:
吸附平衡常数:
①一定温度下,各组分在两相间的K不同,在色谱柱中的移动速度不同,使得原来K仅有微小差异的各组分在经过反复多次的分配后,产生很大的分离效果
②K小的组分,较早流出色谱柱
③K大的组分,较晚流出色谱柱
理论上组分从色谱柱中流出曲线呈正态分布。
6、根据分离原理,色谱可分为那几大类?
理解其分离原理。
答:
1、吸附色谱法(adsorptionchromatography)
根据吸附剂表面对不同组分物理吸附能力的强弱差异进行分离的方法。
2、分配色谱法(partitionchromatography)
根据不同组分在固定相中的溶解能力和在两相间分配系数的差异进行分离的方法。
3、离子交换色谱法(ionexchangechromatography)
根据不同组分离子对固定相亲和力的差异进行分离的方法。
4、排阻色谱法(sizeexclusionchromatography)又称凝胶色谱法(gelchromatography)
根据不同组分的分子体积大小的差异进行分离的方法。
其中:
以水溶液作流动相的称为凝胶过滤色谱法;以有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透色谱法
5、亲和色谱法(affinitychromatography)
利用不同组分与固定相共价键合的高专属反应进行分离的方法
7、什么叫固定相,什么叫流动相,什么叫正相色谱,什么叫反相色谱?
答:
试样混合物在色谱仪中的分离是在色谱柱中的两相之间进行的,分离过程也就是随着试样中各组分在色谱分离柱中的运动,组分在两相间不断重复进行着分配过程,其中的一相固定不变,称为固定相(可以是无机固体吸附剂或有机化合物液膜),另一相是携带混合物流过此固定相的流体(可以是气体、液体、超临界流体),称为流动相。
(1)正相色谱——固定液极性>流动相极性
极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱,适于分离极性组分
(2)反相色谱——固定液极性<流动相极性
极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱,适于分离非极性组分
8、常见的所谓C18柱是什么意思?
以C18柱的HPLC属于正相色谱还是反相色谱?
是吸附色谱还是分配色谱?
固定液是什么?
固定液的支持载体是什么?
固定液与支持载体是怎么连接的?
答:
C18柱,即十八烷基键合硅胶柱又称ODS柱,是最常见的反相柱。
以C18柱的HPLC属于反相色谱,是分配色谱。
固定液是十八烷基化合物,支持载体是硅胶。
将十八烷基通过化学反应键合到硅胶表面的硅羟基上。
9、
离子交换色谱中,固定相上的离子交换功能基团有哪些?
了解交换能力的大小。
答:
阳离子交换树脂
(1)强酸性
(2)弱酸性
阴离子交换树脂
(1)强碱性
(2)弱碱性
10、准确理解基本术语,基线、噪音、保留值、保留体积、相对保留时间、相对保留体积、
死时间、死体积、峰高、峰宽、半峰宽、分离度、拖尾因子、理论板数、峰面积。
答:
详见书本P68
11、
为什么半峰宽不等于峰宽/2,分离度,理论板数的计算。
答:
半(高)峰宽:
峰高一半处的色谱峰宽度,
分离度:
相临两组分间峰顶间距离是峰底宽平均值的几倍(衡量色谱分离条件优劣的参数)
12、按极性大小顺序,写出4~5种常见的HPLC流动相用溶剂?
答:
常用溶剂的极性顺序为:
水(极性最大)、甲酰胺、乙睛、甲醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃、醋酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿、环己烷、己烷、…
13、当流动相中含有水时,其比例不得大于多少?
答:
HPLC中,流动相中含水比例不得大于95%,即有机溶剂的比例不得低于5%.
14、用C18柱的HPLC中,甲醇:
水(2:
8)、甲醇:
水(4:
6)、甲醇:
水(6:
4)三种流动相,哪种洗脱能力强,哪种洗脱能力弱?
在同一C18色谱柱上,对于同一的组分来说,用哪种流动相时组分的保留时间短,哪种流动相时组分的保留时间长?
答:
C18柱,反相色谱柱中,流动相的极性越小,组分流出速度越快,反之越慢。
甲醇:
水(6:
4)(组分保留时间短)的洗脱能力强;甲醇:
水(2:
8)组分保留时间长)的洗脱能力弱
15、在同一C18色谱柱上使用同一流动相,下列几种化合物,哪个保留时间长、哪个保留时间短?
哪个先出峰、哪个后峰?
苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醇、甲苯、对羟基甲苯。
答:
在反相色谱中,极性大的组分先流出,极性小的组分后流出;
极性大小:
对羟基苯甲酸>对羟基苯甲醇>对羟基甲苯>苯甲酸>苯甲酸>苯甲醇>甲苯
保留时间逐渐增加,对羟基苯甲酸保留时间最短,先出峰。
16、用硅胶柱的HPLC中,二氯甲烷:
甲醇(2:
8)、二氯甲烷:
甲醇(4:
6)、二氯甲烷:
甲醇(6:
4)三种流动相,哪种洗脱能力强、哪种洗脱能力弱?
在同一硅胶柱上,对于同一组分来说,用哪种流动相时组分的保留时间短,用哪种流动相时组分的保留时间长?
答:
硅胶色谱柱正相色谱柱中流动相的极性越大,组分流出速度越快,反之,越慢。
二氯甲烷:
甲醇(2:
8)极性大(保留时间短),洗脱能力强;二氯甲烷:
甲醇(6:
4)极性小(保留时间长),洗脱能力弱;
17在同一硅胶柱色谱上使用同一流动相,下列几种成分化合物,哪个保留时间长、哪个保留时间短?
哪个先出峰,哪个后出峰?
苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醇、甲苯、对羟基甲苯。
答:
正相色谱中,极性小的组分先流出、极性大的组分后流出。
甲苯先流出、保留时间短;对羟基苯甲醇后流出,保留时间长;
18、如何应用HPLC法进行药物成分的定性鉴别和定量测定?
答:
一、定性鉴别
HPLC中用保留值定性的方法
保留值定性的主要方法:
★直接与已知标准物对照
★某一未知峰和已知标准物的保留值完全相同-----可能是
★改变色谱柱或流动相,保留时间仍完全相同--------基本是
利用文献的数据进行对比和定性分析
注意HPLC的柱填充技术的复杂性,定性受到限制
最简单的方法:
标准添加法
前提:
要有标准物
判断的标准:
加入标准样后,使未知样色谱峰增高,改变色谱条件,未知峰仍能增高
2、定量分析方法:
内标法、外标法、标准加入法(详见Word版资料P5)
19、常见HPLC柱的规格尺寸,流动相的常见流速?
答:
内径2~6mm,常见的有:
4、6mm;长15~50cm,常见的有15、20、25cm
常见的流速:
60ml/min
UV可见吸收光谱法
1、光谱的分区,紫外、可见、红外光的波长范围?
答:
通常所说的紫外-可见吸收光谱是指200~800nm(近紫外、可见光区分子吸收光谱)。
紫外-可见光区(P250):
100~200nm 远紫外区;200~400nm 近紫外区; 400~800nm 可见光区;
红外光:
0.75~2.5μm近红外;2.5~50μm中红外;50~1000μm远红外;
2、分子内部的运动形式有哪些?
各种运动形式能级及其能级的大小顺序?
答:
分子的内部运动可分为:
分子内价电子(外层电子)运动、分子内原子的振动、分子饶其重心的转动,分别对应能级:
电子能级、分子振动能级、分子转动能级。
分子转动能级≦分子振动能级≦电子能级
3、可见-紫外吸收光谱带较宽的原因?
答:
λ=c/ν
频率越大,波长越短,能量越强;
频率越小,波长越长,能量越弱;
电磁波的能量与频率成正比、与波长成反比。
分子的“电子光谱”是由许多线光谱聚集在一起的带光谱组成的谱带,称为“带状光谱”。
紫外光谱曲线上的吸收峰都是宽峰,这是由于电子跃迁与振转次能级的变化相互叠加所致。
4、电子能级跃迁可同时伴有哪些能级的跃迁,基团振动能级的跃迁可同时伴有哪些的跃迁?
答:
电子能级跃迁可同时伴有振动能级、转动能级
基团振动能级的跃迁可同时伴有转动能级
5、分子轨道的能量高低顺序?
答:
成键轨道与反键轨道:
σ<π6、各类分子轨道上的电子能级跃迁的难易?
答:
→*>n→*→*>n→*
7、有机化合物的可见紫外吸收,主要依赖于哪些轨道上的电子的跃迁?
答:
有机化合物结构与紫外信息的关系
(1)200-400nm无吸收峰。
饱和化合物,单烯。
(2)270-350nm有吸收峰(ε=10-100)醛酮n→π*跃迁产生的R带。
(3)250-300nm有中等强度的吸收峰(ε=200-2000),芳环的特征吸收(具有精细解构的B带)。
(4)200-250nm有强吸收峰(ε104),表明含有一个共轭体系(K)带。
不饱和醛酮:
K带230nm,R带310-330nm
260nm,300nm,330nm有强吸收峰,3,4,5个双键的共轭体系。
8、红外、可见-紫外光线照射物质分子各可引起分子哪些能级跃迁?
答:
9、什么叫生色团?
什么叫助色团?
写出常见多的生色团、助色团及它们的电子跃迁类型。
答:
(1)生色团(发色团):
具有轨道的不饱和官能团称为发色团
有机化合物:
具有不饱和键和未成对电子的基团
具n电子和π电子的基团
产生n→π*跃迁和π→π*跃迁
跃迁E较低
✓例:
C=C;C=O;C=N;—N=N—
注:
当出现几个发色团共轭,则几个发色团所产生的吸收带将消失,代之出现新的共轭吸收带,其波长将比单个发色团的吸收波长长,强度也增强
(2)助色团:
本身无紫外吸收,但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团
有机物:
连有杂原子的基团
例:
—OH,—OR,—NH2,—NR2—,—X
当这些基团单独存在时一般不吸收紫外-可见区的光辐射。
但当它们与具有轨道的生色基团相结合时,将使生色团的吸收波长长移(红移),且使吸收强度增强(助色团至少要有一对与生色团电子作用的孤对电子)
10、什么叫红移?
什么叫紫移?
答:
由于化合物结构变化(共轭、引入助色团取代基)或采用不同溶剂后
吸收峰位置向长波方向的移动,叫红移(长移)
吸收峰位置向短波方向移动,叫蓝移(紫移,短移)
11、什么叫K吸收带?
K吸收带有什么特点?
(P256)
答:
K带:
由共轭双键的π→π*跃迁产生
✓(—CH=CH—)n—CH=C—CO—
•λmax>200nm,εmax>104
•共轭体系增长,λmax↑→红移,εmax↑
•溶剂极性↑,
对于—(—CH=CH—)n—λmax不变
对于—CH=C—CO—λmax↑→红移
12、什么叫R吸收带?
R吸收带有什么特点?
答:
R带:
由含杂原子的不饱和基团的n→π*跃迁产生
✓C=O;C=N;—N=N—
•E小,λmax250~400nm,εmax<100
•溶剂极性↑,λmax↓→蓝移(短移)
13、什么叫E吸收带?
E吸收带有什么特点?
答:
E带:
由苯环环形共轭系统的π→π*跃迁产生
✓芳香族化合物的特征吸收带
•E1180nmεmax>104(常观察不到)
•E2200nmεmax=7000强吸收
•苯环有发色团取代且与苯环共轭时,E2带与K带合并一起红移(长移)
14、什么叫B吸收带?
B吸收带由什么引起?
有哪些特点?
答:
B带:
由π→π*跃迁和苯环的振动的重叠引起的产生
✓芳香族化合物的主要特征吸收带
•λmax=254nm,宽带,具有精细结构;
•εmax=200
•极性溶剂中,或苯环连有取代基,其精细结构消失
15、溶剂对紫外吸收光谱有哪些影响?
甲醇、乙晴、乙酸、二氯甲烷、苯的最低使用波长极限?
答:
溶剂效应:
Ø对λmax影响:
N-π*跃迁:
溶剂极性↑,λmax↓蓝移
π-π*跃迁:
溶剂极性↑,λmax↑红移