南京中医药大学翰林学院毕业论文仅供参考正能量勿剽窃.docx
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南京中医药大学翰林学院毕业论文仅供参考正能量勿剽窃
南京中医药大学翰林学院
本科生毕业论文
药学系药学专业2010年级
学号*********
学生姓名于一丁
实习单位盐城苏海制药有限公司
论文题目HPLC测定盐酸多西环素含量及有关物质
指导老师吴祥
起止时间2014.1.9—2014.6.1
2014年6月04日
HPLC测定盐酸多西环素含量及有关物质
药学100201131于一丁
摘要目的：
测定盐酸多西环素中有关物质的含量。
方法：
HPLC测定盐酸多西环素的含量，色谱柱为Agilent（PLRP-S柱，8um，250×4.6mm）;以0.05mol/l的草酸铵-二甲基二丙醇-0.2mol/l磷酸（65:
30:
5）【10】（用氢氧化钠调节pH为8.0）做为流动相;柱温：
60℃；波长设定：
270nm;流速：
1ml/min；进样量：
20ul；色谱工作站：
ChemStation色谱数据工作站。
结果：
（1）盐酸美他环素的含量≤2.0%
（2）盐酸β-多西环素的含量≤2.0%（3）美他环素峰的之前及多西环素峰（主峰）的后面的任一杂质均不得过0.5%。
（4）含C22H24N2O8（多西环素）为800～920（u/mg）【4】。
关键词高效液相色谱法；盐酸多西环素；有关物质；含量测定；
HPLCDETERMINATIONOFDOXYCYCLINEHYDROCHLORIDECONTENTANDRELATEDSUBSTANCES
AbstractObjective:
Todeterminethecontentofrelatedsubstanceshydrochloridedoxycyclinein.Methods:
HPLCdeterminationofthecontentofdoxycyclinehydrochloride,columnAgilent（PLRP-Scolumn,8um,250×4.6mm）;in0.05mol/lammoniumoxalate-dimethyl-propanol-0.2mol/lphosphate（65:
30:
5）（adjustedtopH8.0withsodiumhydroxide）asthemobilephase;columntemperature:
60℃;wavelengthsetting:
270nm;flowrate:
1ml/min;injectionvolume:
20ul;chromatographyworkstation:
ChemStationchromatographydataworkstation.Results:
（1）HClmetacyclinecontent≤2.0%
（2）ofhydrochloricacidβ-doxycyclinelevels≤2.0%（3）anddoxycyclinepeak（peak）backbeforemetacyclinepeakseithernottooimpurity0.5%.（4）IncludesC22H24N2O8（doxycycline）shouldbe800~920（u/mg）.
KeyWordsHighperformanceliquidchromatography;Doxycyclinehydrochloride;Relatedmaterial;Contentdetermination
1.前言
盐酸多西环素又叫长效土霉素，多西环素或者强力霉素。
盐酸多西环素呈粉末状，色泽呈现淡黄色或黄色，味苦无刺激性味道。
易溶于甲醇或水等极性很大的溶剂，微溶于乙醇当中，但不溶于氯仿这种极性较小的溶剂当中。
我们生活当中用的盐酸多西环素大多是其盐酸盐，理化性质较上述保持不变，但是作为盐酸盐的盐酸多西环素在水溶液当中的稳定性很不好，当水溶液为强酸性时，1%盐酸多西环素可以有多种解离常数，常见的分别是3.5,7.7,9.5。
由此可见，在这种状态下，该物质极易发生氧化反应【1】。
盐酸多西环素可以用于治疗因革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌造成的上呼吸道感染而导致的其它的炎症，比如常见的扁桃体发炎，淋巴结炎，老年人的慢性支气管炎。
当然盐酸多西环素还可用于治疗斑疹，伤寒，支气管肺炎等其他炎症。
在对于治疗霍乱也是有效果的。
在预防疟疾方面也起到了相当大的作用。
其药理作用主要是因为盐酸多西环素可以与敏感菌核糖体30S亚基的可逆性结合阻止细菌与蛋白质的氨酰tRNA结合，使蛋白质合成受阻【2】。
又因为盐酸多西环素的口服吸收好，其生物利用度高，脂溶性好，渗透组织能力强，可以迅速广泛分布生物体各处等特点，所以就又可用于生物疾病的预防与治疗上。
本次实验方法中采用高效液相作为分析仪器，在种种分析仪器中，高效液相由于其具有高效分离速度，分析速度快，反应灵敏，色谱柱还可以重复利用，流动相的配置选择广泛，流出组容易整合加上高效液相适用范围宽泛等特点而被分析工作者青睐。
目前国内外生产的高效液相型号种类有很多，比如著名的有waters，安捷伦，岛津等。
实习单位所采用的是安捷伦1260型号。
组成高效液相的几个部件分别为高压输压系统，进样系统，色谱柱分离加温系统，紫外氘灯检测器，后期数据分析处理系统等，依靠先进的分析仪器对药物分析起到了极大的推动作用。
为了实验方便以及按照药典的要求，在色谱柱的选取上，选择反向色谱柱，反向色谱柱是指一般采用非极性物质作为固定相，如C18，需要用水做流动相，可以加入甲醇，乙腈这些可以与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
反向色谱柱的选取主要适用于分离非极性或者是极性较弱的化合物，当然，为了控制样品在分析过程中会出现的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。
同样需要注意的是，C18的使用pH值通常为2.5~7.5，pH太高会使硅胶溶解，pH太低会使键合的烷基脱落【3】。
高效液相色谱的应用分析原理主要是当流动相携带这待测组分的混合物流经色谱柱中的固定相时，就会和固定相产生力的作用，这是因为组成混合物的各组分的理化性质不一样造成的，这样也就与固定相之间发生的力的作用也不一样了，所以在一同进入色谱柱后，在固定相中停滞的时间不相同，导致了先后不同次序的流出。
2.仪器与材料
2.1仪器
高效液相色谱仪：
1260VWD紫外检测器、1260BinpumpVL溶剂输送泵、12060TCC色谱柱恒温箱、1260ALS自动进样器（Agilent1260）
色谱柱：
填料：
PLRP-S柱，8um，250×4.6mm品牌：
Agilent
分析天平SartoriusBT125D（十万分之一级别，北京赛多利斯仪器系统有限公司生产）等。
2.2药品与试剂
美他环素的对照品：
大连美仑公司生产的批号为MB1088-S盐酸多西环素的标准品：
上海安谱科学仪器有限公司生产的批号CDCT-C13084280盐酸多西环素的供试品：
盐城苏海制药生产，批号140205001。
2-甲基-2-丙醇，色谱纯；硫酸氢化四丁基铵，化学纯；磷酸氢二钾，分析纯；氢氧化钠，分析纯；乙二胺四乙酸二钠，分析纯。
1mol/l氢氧化钠溶液，0.01mol/l盐酸溶液等。
3.实验方法
3.1试液的配制
3.1.1对照品溶液制备
美他环素的对照品贮备液的制备：
取盐酸美他环素的对照品12.0mg，精密称定，倒入10ml的量瓶中，添加0.01mol/l的盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀【4】。
对照品的溶液
（1）、
（2）的制备：
精密称定称取盐酸多西环素的标准品12.0mg，倒入10ml量瓶当中再添加0.01mol/l的盐酸溶液6ml，振摇5分钟或直接再用上述稀释液稀释至刻度，摇匀，平行制备两份。
对照品溶液的（3）的制备：
精密移取2ml对照品的溶液
（1）和2ml美他环素的对照品的贮备液，放在同一个100ml的量瓶中在添加0.01mol/l的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀【5】。
系统适用性的试液的制备：
取盐酸多西环素的标准品60mg，置10ml量瓶中，加0.01mol/l的盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密移取5ml，置25ml烧杯中，水浴加热60分钟，放在电炉上蒸发至近干（不得将残渣烧焦），再用0.01mol/l的盐酸溶液溶解并稀释至25ml，摇匀，即得【5】。
3.1.2供试品溶液的制备
精密称定盐酸多西环素样品大约120mg，放置在100ml的量瓶中在用0.01mol/l的盐酸溶液使之溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.5um滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，平行制备两份【5】。
3.2色谱条件与系统适应性实验
3.2.1色谱及检测条件
色谱柱：
填料：
PLRP-S柱，8um，250×4.6mm品牌：
Agilent
流动相：
称取2.72g的磷酸二氢钾,0.74g的氢氧化钠,0.50g的硫酸氢化四丁基胺,0.40g的乙二胺四乙酸二钠，置同一个1000ml量瓶中,加850ml的水振摇溶解后，再用水将60g的2-甲基-2-丙醇转移至上述1000ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，用1mol/l氢氧化钠溶液将其pH值调节至8.0±0.1【6】。
平衡时间：
至少1小时，基线稳定
流速：
1ml/min
柱温：
60℃
进样量：
20ul
检测波长：
270nm
色谱工作站：
ChemStation色谱数据工作站
3.2.2系统适应性实验
取系统适用性的试液和对照品的溶液
（1）分别进样，应符合下列要求：
（1）4-表多西环素峰的相对峰的保留时间约为4（为主降解产物）、美他环素的峰相对峰的的保留时间约为6、β-多西环素的相对峰保留时间约为7、多西环素的相对峰的保留时间为约9【6】。
（图1）
（2）4-表多西环素和多西环素峰的分离度应不得低于3.0【7】。
（3）对照品的溶液
（1）连续进样5次所记录色谱图中，按多西环素峰面积计算其标准相对偏差应不得过2.0%。
（图2）
1.4-表多西环素2.美他环素3.β-多西环素4.多西环素
图1系统适用性试液
分离度R=2（tR2-tR1）/（W1+W2）=2（8.969-4.287）/（0.6481+0.5730）=7.7>3.0符合规定。
对照品
（1）
连续的进样次序
峰面积
1
2.38E+04
2
2.39E+04
3
2.39E+04
4
2.39E+04
5
2.39E+04
图2对照品溶液
（1）连续进样5次所记录色谱图的峰面积
通过计算平均值为23878.26，标准偏差为29.59058972则标准相对偏差为0.12%。
RSD为0.12%<2.0%，符合规定。
3.2.3多西环素线性试验
精密吸取对照品溶液
（1）适量，制备成多西环素的浓度分别为24；48；72；96；120；144ug/ml的对照品品溶液，再精密吸取上述溶液各20ul进入高效液相中，测得峰面积分别是892166，1788346，2682667，3577572，4465894，5366160。
以多西环素的样品量浓度（ug/ml）作为横坐标，所测得的峰面积作为纵坐标，进行线性回归方程的分析【7】，如下表：
（图3）
样品浓度（ug/ml）
24
48
72
96
120
144
峰面积
892166
1788346
2682667
3577572
4465894
5366160
相关系数
R=1.0000
图3多西环素线性回归方程
经过计算所得的相关系数为1.0000＞0.990（药典要求），结果表明在24~144（ug/ml）范围内，多西环素的峰面积与之有着良好的线性关系。
3.3供试品溶液测定
取对照品溶液的（3）、供试品的溶液、对照品的溶液
（1）和
（2）分别依次进样，记录色谱图中多西环素峰的保留时间的1.7倍。
（见图4中的
，
，
，
）
对照品溶液（3）的液相色谱图
供试品的液相色谱图
对照品溶液
（1）的液相色谱图
对照品溶液
（2）的液相色谱图
图4
，
，
，
所对应的色谱图
3.4回收率试验与精密度试验
3.4.1回收率试验
精密移取盐酸多西环素
（1）溶液适量，添加盐酸多西环素标准品适量。
再用0.01mol/l的盐酸稀释成溶度为5,40,100ug/ml的添加溶液，测定，计算回收率【7】。
3.4.2精密度试验
用先前制备好的添加溶液，依照供试品的测定方法测定，连续进样5次，测定3天，以相同一天内测定的多西环素含量来计算日内变异系数，再以不同的日期测得的盐酸多西环素多西环素含量计算其日间的变异系数【7】。
数据如下：
添加后浓度（ug/ml）
实测值（ug/ml）
回收率（%）
日内变异系数（%）
日间变异系数（%）
5
4.98
99.6
0.42
0.96
40
40.03
100.08
0.21
0.87
100
99.92
99.92
0.09
0.83
由以上数据可以得知，本次实验测定方法回收率高，重现性好，适合用于测定盐酸多西环素的含量测定。
4.结果与讨论
4.1结果
4.1.1校正因子计算
通过供试品的溶液测定所得的图谱进行数据的分析，计算校正因子：
式中：
W1为美他环素的对照品贮备液中盐酸美他环素的标准品的称重；mg
W2、W3分别为对照品的溶液
（1）、
（2）中盐酸多西环素的对照品的称重；mg
A1、A2分别为对照品的溶液（3）进样1针所记录色谱图中，美他环素、多西环素的峰面积；
Ai3为对照品的溶液
（1）的进样第i针所记录色谱图中，多西环素的峰面积；
A4为对照品的溶液
（2）的色谱图中多西环素的峰面积；
f1、f2为对照品的溶液（3）进样1针所记录色谱图中，分别以美他环素、多西环素峰面积计算的校正因子【7】；
fi3为第i针对照品的溶液
（1）的所记录的色谱图中，以多西环素的峰面积计算的校正因子；
f4为对照品的溶液
（2）进样1针所记录色谱图中，以多西环素的峰面积计算的校正因子【8】；
P为盐酸多西环素的标准品的效价单位，u/mg。
最终所得数据如下：
峰面积
校正因子
A1
7.22133
f1
0.003323488
A2
4.33137
f2
0.005540972
A4
2.42E+04
f4
4.96E-05
A13
2.38E+04
f13
5.04E-05
A23
2.39E+04
f23
5.03E-05
A33
2.39E+04
f33
5.03E-05
A43
2.39E+04
f43
5.03E-05
A53
2.39E+04
f53
5.02E-05
f
0.000150448
f3
0.000251275
4.1.2含量计算
依靠上面的校正因子的数据进行含量的相关的计算：
盐酸美他环素%=
盐酸β-多西环素%=
其它未知的杂质%（以盐酸盐计）=
多西环素的含量=
式中：
f1、f2、为盐酸美他环素、盐酸β-多西环素的平均校正因子。
、
、
分别为供试品溶液中的美他环素、β-多西环素、多西环素的峰面积【8】。
为供试品溶液中的美他环素峰的前面和多西环素峰的后面任何一杂质的峰面积【9】。
W4为供试品的称重；mg。
所得数据如下：
峰面积
含量计算
A11
8.63716
盐酸美它环素（%）
2%
A12
5.22226
其他未知杂质（%）
0%
A13
1.60E+01
盐酸β-多西环素（%）
2%
A14
0.9385
多西环素含量
857.5810667
4.1.3结果判断
所算的的数据应符合以下要求：
（1）盐酸美他环素的含量≤2.0%。
（2）盐酸β-多西环素的含量≤2.0%。
（3）美他环素峰之前及多西环素峰（主峰）后面的任一杂质均不得过0.5%。
（4）含C22H24N2O8（多西环素）应为800～920（u/mg）【4】。
从计算结果看得出：
本次供试品标号为140205001是合格的。
4.2讨论
依靠具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、色柱可以反复使用、流动相可选择范围宽、流出组容易收集、适用范围广等优点的高效液相色谱法对实习药厂生产的盐酸多西环素进行含量测定与分析。
本次实验所采用的实验方法与液相参数符合实验规格，实验的系统适应性，线性关系考察，分离度，回收率以及精密度均符合药典规定。
通过实验与药典分析发现在0.05mol/l的草酸铵-二甲基二丙醇-0.2mol/l磷酸（65:
30:
5）为流动相的条件下【10】，样品分离良好，在270nm检查波长下出峰明显，所得数据经计算，符合药典要求。
致谢
在本次论文设计过程中，首先感谢我的学校，给了我到盐城苏海制药有限公司学习的机会。
更要感谢我的导师-吴祥老师。
在学习中，老师从选题到论文框架到开题报告，以及后面的实验和论文，都给予了细致的指导，提出了很多宝贵的意见与建议，老师用他严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、孜孜以求的工作作风和大胆创新的进取精神对我产生了非常重要影响。
他渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维也给了我深深的启发。
这篇论文得以顺利完成离不开吴老师的的精心指导和大力支持。
对此我再次对吴祥老师深表感谢。
感谢他三个多月以来在学习和工作中给予我的大力支持。
同时也感谢所有授我以业的老师，没有他们的教导，没有这些年知识的积淀，我没有这么大的动力和信心完成这篇论文。
感恩之余，也诚恳的请各位老师对我的论文多加批评多加指正，使我能够及时改正论文的不足之处，使之更加完善，给我的四年学业画上圆满句号。
最后，我要向百忙之中抽时间对本文进行审阅的各位老师表示衷心的感谢。
感谢你们的辛苦付出。
谢谢!
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