整理专题一微生物的利用.docx

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整理专题一微生物的利用

最新考纲

1．微生物的分离与培养

2．某种微生物数量的测定

3．培养基对微生物的选择作用

4．利用微生物发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用

考纲解读

1．培养基的种类、营养要求及配制原则

2．无菌技术的具体操作及应用

3．运用相关技术解决微生物的分离与培养等实际问题

知识点一　微生物的培养

　议一议：

高温灭菌的原理是什么？

　想一想：

接种过程为什么要在酒精灯的火焰旁进行？

　查一查：

什么是菌落？

它有什么用途？

知识点二　微生物的利用

分解纤维素的微生物的分离——纤维素分解菌的筛选

　想一想：

什么叫选择培养基？

看一看：

纤维素分解菌筛选的原理是什么？

1．培养基的配制原则

（1）目的要明确：

配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。

（2）营养要协调：

注意各种营养物质的浓度和比例。

（3）pH要适宜：

各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需pH不同。

2．培养基的营养构成

（1）各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐；

（2）不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。

3．配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项

（1）倒平板的适宜温度是50℃左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固；

（2）平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

4．两种纯化细菌的方法的比较

项目

优点

缺点

适用范围

平板划

线法

可以观察菌落特征，对混合菌进行分离

不能计数

适用于好氧菌

稀释涂布

平板法

可以计数，可以观察菌落特征

吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延

适用于厌氧菌和兼性厌氧菌

小贴士

自我校对：

①营养物质　②生长繁殖　③水　④碳源　⑤氮源　⑥无机盐　⑦特殊营养物质　⑧氧气　⑨温和　

有害的微生物　⑪芽孢　⑫孢子　⑬煮沸消毒法　⑭巴氏消毒法　⑮所有的微生物　⑯灼烧　⑰干热　⑱高压蒸汽　⑲接种环、涂布器　⑳平板划线　

稀释涂布平板　

酒精灯火焰　

固体斜面　

菌落　

4℃　

不长　

污染　

甘油管藏　

－20℃　

选择培养基　

尿素　

稀释涂布平板法　

显微镜直接计数　

×M　

被测试的条件　

非测试因素　

纤维素　

CMC—Na　

微生物　

倒平板　

发酵产纤维素酶　

葡萄糖

议一议：

高温可以使菌体细胞内的蛋白质、核酸变性失活，从而达到灭菌的目的。

想一想：

因为这里是一个无菌区，可以避免杂菌污染。

查一查：

菌落是单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，形成的一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。

不同细菌的菌落在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面的特征不同，它可以作为鉴别菌种的重要依据。

想一想：

选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。

目的是培养、分离出特定微生物。

看一看：

刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。

微生物的培养与应用

1．微生物的实验室培养

（1）培养基

①概念：

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

②分类和应用

划分标准

培养基种类

特　点

用　途

物理

性质

液体培养基

不加凝固剂

工业生产

半固体培养基

加凝固剂，如琼脂

观察微生物的运动、分类、鉴定

固体培养基

微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种

化学

成分

天然培养基

含化学成分不明确的天然物质

工业生产

合成培养基

培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成）

分类、鉴定

用途

选择培养基

培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长

培养、分离出特定微生物（如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐）

鉴别培养基

根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品

鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽）

③培养基配方及营养要素

基本营养要素：

各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。

此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。

营养要素

来源

功能

碳源

无机氮源

CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物

①构成细胞中的物质和一些代谢产物；②既是碳源又是能源

有机碳源

糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等

氮源

无机氮源

无机氮：

NH3、铵盐、硝酸盐、N2等

将无机氮合成含氮的代谢产物

有机碳源

牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸

合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物

生长因子

维生素、氨基酸、碱基

①酶和核酸的组成成分；②参与代谢过程中的酶促反应

提醒　①微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。

②对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。

③有些培养基不需要添加特殊营养物质，生物自己能合成，如大肠杆菌能合成某些维生素，作为特殊营养物质。

④制备：

计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。

（2）微生物培养的无菌技术

进行无菌操作主要是为了防止外来杂菌的入侵，重点是消毒和灭菌。

①消毒和灭菌的区别

使用方法

结果

常用的方法

消毒

较为温和的物理或化学方法

仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）

煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法等

灭菌

强烈的理化因素

杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌

②三种常用灭菌方法的比较

灭菌方法

适用材料或用具

灭菌条件

灭菌时间

灼烧灭菌

接种环、接种针或其他金属工具

酒精灯火焰的充分燃烧层

直至烧红

干热灭菌

玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等

干热灭菌箱内，160℃～170℃

1h～2h

高压蒸汽灭菌

培养基等

高压蒸汽灭菌锅内100kPa，121℃

15min～30min

2.微生物的纯化培养及菌种的保藏

（1）原理：

在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。

（2）方法：

平板划线法、稀释涂布平板法。

方法

平板划线法

稀释涂布平板法

注意事项

（1）接种环的灼烧

①第一次划线前：

杀死接种环上的微生物，避免污染培养物

②每次划线前：

杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端

③划线结束后：

杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者

（2）灼烧接种环之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种

（3）划线时最后一区域不要与第一区域相连

（4）划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破

（1）稀释操作时：

每支试管及其中的9mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1cm～2cm处

（2）涂布平板时

①涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃

②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精

③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体

目的

在培养基上形成由单个菌种繁殖而来的子细胞群体——菌落

培养

平板冷凝后倒置培养，使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上水珠落入培养基造成污染

★★　本考点内容常以环境污染为背景考查微生物的生存条件及分离、纯化和培养条件等，复习中引起关注。

【典例1】►（2011·新课标全国）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。

某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。

请回答下面的问题。

（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上。

从功能上讲，该培养基属于________培养基。

（2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即________和________。

（3）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________。

（4）通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和________。

无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。

解析　

（1）欲筛选出能降解原油的菌株，则培养基中应只含有原油而无其他碳源，不能降解原油的细菌则在此培养基上不能生存，这类培养基为选择培养基。

（2）分离纯化菌种时，接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法，使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落，以便于纯化菌种。

（3）降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈就越大。

答案　

（1）原油　选择　

（2）平板划线法　稀释涂布平板法

（3）强　（4）干热灭菌　高压蒸汽灭菌　火焰

知识拓展　

（1）高温加热灭菌，其原理就是使细菌体内蛋白质变性，而达到杀灭细菌的作用。

（2）化学药剂的灭菌消毒方法，其作用原理是使细菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内，因此化学方法难以消灭孢子和芽孢。

（3）体积分数为70%的乙醇杀菌效果最强。

浓度过低，杀菌力弱；浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其内，杀菌效果受影响。

对刚洗刷后未干的器皿，则可选择75%的酒精进行消毒。

【训练1】►（2007·江苏生物，22）不同的微生物对营养物质的需要各不相同。

下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是（　　）。

A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素

B．碳源物质也是该微生物的能源物质

C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质

D．水是该微生物的营养要素之一

解析　以CO2为唯一碳源可知该微生物为自养型微生物，可以利用CO2合成有机物，该无机碳源不能为微生物提供能量，其能源来自于光能或分解有机物释放出的化学能。

答案　B

【训练2】►如右图是微生物平板划线示意图。

划线的顺序为1、2、3、4、5。

下列操作方法正确的是（　　）。

A．操作前要将接种环放在火焰旁灭菌

B．划线操作须在火焰上进行

C．在5区域中才可以得到所需菌落

D．在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌

解析　在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法是在火焰上灼烧，接种时划线操作是在火焰旁进行。

在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落。

答案　D

特定微生物的数量的测定

1．测定微生物数量的方法

（1）直接计数法：

常用的是显微镜直接计数法。

（2）间接计数法：

常用的是稀释平板计数法。

2．测定微生物数量方法的实际应用

（1）土壤中好氧型细菌的计数

①制备土壤稀释液：

取土壤表层3～5cm处的土样；制备系列稀释液。

第五章　环境影响评价与安全预评价②取样及倒平板：

该实验的接种方法是稀释涂布平板法。

③培养。

④观察记录结果：

每克土壤样品菌数＝某稀释倍数的菌落平均数×

。

（一）安全评价的内涵

（2）检测天然水源中细菌总数和大肠杆菌菌落数

『正确答案』A细菌总数通常是指1g或1mL检测样品中所含细菌菌落的总数。

大肠杆菌菌落数通常是指每100g或100mL检测样品中所含细菌的实际数值。

（3）检测某种食品中的细菌总数和大肠杆菌菌落数

1）规划实施对环境可能造成影响的分析、预测和评估。

主要包括资源环境承载能力分析、不良环境影响的分析和预测以及与相关规划的环境协调性分析。

一般说来，大肠杆菌菌落总数越多，说明食品的卫生质量越差。

（4）土壤中分解尿素细菌的计数

某些细菌中含有尿素分解酶，能将培养基中的尿素分解成氨，该物质的水溶液会使酚酞指示剂呈现红色。

（6）评价结论。

3．制备系列稀释液的方法

2.环境影响评价工程师职业资格制度将1g土样放入99mL无菌水中，制成102倍的稀释液，用1mL无菌移液管吸取上述浓度的溶液0.5mL，移入装有4.5mL无菌水的试管中，即配制成103倍的稀释液，用同样的方法可以配制成104、105、106倍的稀释液。

将待测样品进行稀释的目的是使微生物细胞分散开，使实验结果更接近真实值。

【典例2】►（2009·广东中山一中测试）用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是（　　）。

大纲要求A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230

B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238

C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163

4）按执行性质分。

环境标准按执行性质分为强制性标准和推荐性标准。

环境质量标准和污染物排放标准以及法律、法规规定必须执行的其他标准属于强制性标准，强制性标准必须执行。

强制性标准以外的环境标准属于推荐性标准。

D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233

解析　在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B不正确。

C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

1.筛选环境影响：

环境影响被筛选为三大类，一类是被剔除、不再作任何评价分析的影响，如内部的、小的以及能被控抑的影响；另一类是需要作定性说明的影响，如那些大的但可能很不确定的影响；最后一类才是那些需要并且能够量化和货币化的影响。

答案　D

知识拓展　

（1）为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

（2）在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目，如果某个平板的菌落数与其他差别甚远，说明该平板操作过程中出现失误，应舍弃。

（3）统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

因此，统计结果用菌落数而不是活菌数来表示。

【训练3】►（2011·烟台模拟）可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是（　　）。

A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂

B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂

3）迁移。

D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

解析　在以尿素为唯一氮源的培养基中，不能分解尿素获得氮源的细菌不能生长，而分解尿素的细菌能利用尿素作氮源，将尿素分解为氨，使pH升高。

若培养基中加入酚红指示剂，指示剂将变红。

此培养基既属于选择培养基，又属于鉴别培养基。

答案　A

培养基对微生物的选择分析

1．分离微生物的方法

从混合样品中获得某种微生物的方法通常有两种：

（1）利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使它成为一种加富培养基。

（2）利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物，经培养后，原来占优势的微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增殖，在数量上占优势。

2．选择培养基及应用实例

（1）选择培养基：

在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长，目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。

（2）选择培养基应用实例

①培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。

④当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。

如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。

⑤改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。

★★　本部分知识常与前面两考点综合在一起考查，单科试卷中多有涉及，理综考试中多以填空形式出现。

【典例3】►通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。

在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌。

利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出（　　）。

①大肠杆菌　②霉菌　③放线菌　④固氮细菌

A．④②③B．①②③C．①③④D．③④

解析　缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，而固氮细菌能生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌，霉菌能生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌，放线菌能生长。

答案　A

【训练4】►（2011·宝鸡调研）关于纤维素分解菌选择培养的正确叙述是（　　）。

A．可以增加纤维素分解菌的浓度

B．可以减少纤维素分解菌的浓度

C．所用培养基是固体培养基

D．所用培养基是平板培养基

解析　选择培养是增加纤维素分解菌的浓度，所用的培养基是液体培养基，以便于下一步的稀释涂布操作。

答案　A

1．（2011·重庆卷）下列有关细菌培养的叙述，正确的是（　　）。

A．在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌

B．在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长

C．向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长

D．在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动

解析　菌落就是由单个细菌或同种细胞繁殖成的具有一定形态结构特征的子细胞群体，一个菌落就是一个种群，所以单个菌落就只有一种细菌。

青霉素能抑制细菌的细胞壁的形成从而抑制细菌的繁殖。

破伤风杆菌是厌氧型的生物。

半固体培养基中可以观察细菌的运动。

答案　D

2．（2009·安徽理综，6）下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（　　）。

A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时

D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

解析　检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24～48小时，在确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的一组平板为代表进行计数。

答案　D

3．（2011·山东卷）研究发现柚皮精油和乳酸菌素（小分子蛋白质）均有抑菌作用，两者的提取及应用如图所示。

（1）柚皮易焦糊，宜采用________法提取柚皮精油，该过程得到的糊状液体可通过________除去其中的固体杂质。

（2）筛选乳酸菌A时可选用平板划线法或________接种。

对新配制的培养基灭菌时所用的设备是________。

实验前需对超净工作台进行________处理。

（3）培养基中的尿素可为乳酸菌A生长提供________。

电泳法纯化乳酸菌素时，若分离带电荷相同的蛋白质，则其分子量越大，电泳速度________。

（4）抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈。

可通过测定透明圈的________来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。

解析　本题考查选修1相关知识，对于柚皮精油的提取一般用压榨法，再采用过滤去除其中的固体杂质；对于筛选菌种一般用固体选择培养基，通常接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法，培养基灭菌通常用高压蒸汽灭菌，对于工作台一般消毒的方法处理，通常用紫外线消毒，尿素为微生物提供氮源和碳源，电泳法纯化乳酸菌素时，若分离带电荷相同的蛋白质，则其分子量越大，电泳速度越慢；抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈，可通过测定透明圈的大小来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。

答案　

（1）压榨　过滤　

（2）稀释涂布平板法　高压蒸汽灭菌锅　紫外线消毒　（3）碳源和氮源　越慢　（4）大小（直径）

4．（2007·宁夏理综，32A）某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。

实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。

请回答与此实验相关的问题。

（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了________和________。

除此之外，培养基还必须含有的基本成分是________和________。

（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是___________________________________________。

（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37℃。

要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。

（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。

一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。

（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐________细菌，这种培养基被称为________。

解析　蛋白胨来源于动物原料，含有维生素、糖和有机氮等营养物质，此培养基主要是为微生物提供氮源，微生物的培养基一般都要含有水、碳源、氮源、无机盐。

实验室的灭菌方法一般有灼烧灭菌（适合于接种工具的灭菌）、干热灭菌（适合于耐高温的、需要保持干燥的物品的灭菌）、高压蒸汽灭菌（适合于培养基等物体的灭菌）。

要想使微生物快速繁殖，就要置于适宜的条件下，特别是温度要适宜，所以要置于恒温培养箱中，对照实验就是要设置一个无菌的加以比较，进行观察。

不同的细菌形成的菌落具有不同的形态，细菌菌落的特征是识别不同细菌的主要依据。

菌落是由一个细菌细胞繁殖而来的，菌落多则说明细菌的数目多。

加入了特定的物质，用于筛选各种特定细菌的培养基就是选择培养基。

例如加入了NaCl就可以用于筛选耐盐细菌。

答案：

（1）氮源（碳源不作要求）　碳源　无机盐　水　

（2）高压蒸汽灭菌　（3）恒温培养箱　无菌水　（4）多　高　（5）盐（或NaCl）　选择培养基

5．（2010·山东理综，34）生物柴油是一种可再生的清洁能源，其应用在一定程度上能够减缓人类对化学燃料的消耗。

科学家发现，在微生物M产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油（如下图）。

（1）用于生产生物柴油的植物油不易挥发，宜选用________、________方法从油料作物中提取。

（2）筛选产脂肪酶的微生物M时，选择培养基中添加的植物油为微生物生长提供________，培养基灭菌采用的最适方法是________法。

（3）测定培养液中微生物数量，可选用________法直接计数；从微生物M分离提取的脂肪酶通常需要检测________，以