基质细胞衍生因子1.docx

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基质细胞衍生因子1

基质细胞衍生因子

【摘要】为了研究基质细胞衍生因子-1和血小板第4因子（PF4）对扩增后脐血CD34+细胞归巢相关功能的影响，将纯化的脐血CD34+细胞接种入无血清培养液中，加入不同组合的细胞因子FST、FST+SDF-1、FST+PF4或FST+SDF-1+PF4，分别于培养第7、10、14天检测CD34+细胞扩增倍数、集落形成能力、细胞的黏附分子表达、总黏附性、趋化功能。

结果表明：

①加入SDF-1的实验组CD34+细胞及造血祖细胞集落扩增倍数高于对照组；②加入SDF-1明显上调扩增的CD34+细胞CD49e的表达，加入PF4明显上调扩增的CD34+细胞CD49e、CD54的表达，在扩增体系中加入SDF-1或PF4均能够明显提高扩增的CD34+细胞的总黏附性；③在扩增体系中加入SDF-1能够明显提高扩增的CD34+细胞的自发迁移率，但导致CXCR-4的表达和SDF-1诱导迁移率降低；而PF4能够明显提高扩增的CD34+细胞的CXCR-4的表达和SDF-1诱导迁移率；在扩增体系中同时加入SDF-1和PF4能够明显提高扩增的CD34+细胞自发迁移率和SDF-1诱导迁移率。

结论：

体外扩增体系中加入SDF-1和PF4能够上调部分归巢相关黏附分子的表达，保持扩增的CD34+细胞的黏附和迁移能力，有利于降低体外扩增对造血干/祖细胞归巢相关功能的不利影响，维持扩增的HSPC的归巢潜能。

【关键词】CD34+细胞

　　EffectsofStromalCell-derivedFactor1andPlateletFactor4ontheAdhesionCharacteristicsandChemotacticFunctionofExVivoExpandedUmbilicalCordBloodCD34+Cells

　　AbstractToinvestigatetheeffectsofstromalcell-derivedfactor1（SDF-1）andplateletfactor4（PF4）onthehoming-relatedfunctionofexpandedexvivoumbilicalcordbloodCD34+cells，purifiedcordbloodCD34+cellswereculturedinserum-freemediumcontainingaHGFcombinationofFL+SCF+TPO（FST）witheither100ng/mlSDF-1alone，100ng/mlPF4alone，orbothofthese2cytokines.TheexpansionrateofCD34+cells，colonyformation，homing-relatedfunctionsincludingexpressionofhoming-relatedadhesionmoleculesofexpandedCD34+cell，adhesionactivityandchemotacticfunctionofthere-selectedexpandedCD34+cellswereevaluatedatdifferenttimepoints.TheresultsshowedthatexpansionrateofCD34+cellsandexpansionmultipleofCFUinSDF-1groupswerehigherthanthoseincontrol.TheexpressionofCD49eontheexpandedCD34+cellswasremarkableup-regulated，incontrast，expressionofCXCR-4ontheexpandedCD34+cellswasremarkabledown-regulatedinSDF-1groups.TheexpressionofCD49e，CD54andCXCR-4ontheexpandedCD34+cellswereremarkablyup-regulatedinthePF4groups.InalltheSDF-1group，PF4groupandSDF-1plusPF4group，theabilityofexpandedCD34+cellsadheringtofibronectinlayerwerehigherthanthoseinthecontrolonday10.SpontaneousmigrationrateofexpandedCD34+cellsinSDF-1groupswerehigherthanthoseincontrol，whileSDF-1-inducedmigrationratewerelowerthanthoseincontrolonday10.SDF-1-inducedmigrationrateinPF4groupswerehigherthanthoseincontrolonday10.SpontaneousandSDF-1-induced

migrationrateofexpandedCD34+cellsintheSDF-1plusPF4groupswerehigherthanthoseincontrolonday10.Itisconcludedthat，SDF-1andPF4canup-regulateexpressionofadhensionmoleculesonexpandedCD34+cells，andretaintheadherentandmigrationabilityofexpandedCD34+cells，whichishelpfulforthehomingofexpandedCD34+cells.Inshort，SDF-1andPF4arehelpfulforthehoming-relatedfunctionoftheexpandedUCBHSPC.

　　KeywordsCD34+cell；umbilicalcordblod；stromalcell-derivedfactor1；plateletfactor4；adhesioncharacteristics；chemotacticfunction；ex-vivoexpansion

理想的体外扩增方案应该在扩增HSPC的同时保持其增殖、自我更新及向骨髓微环境归巢功能的完整。

我们曾报道过短期体外扩增并不影响HSPC的归巢相关功能，但随着扩增时间延长和部分归巢相关黏附分子的表达，黏附功能和迁移功能呈下降趋势［1］。

在此基础上我们进一步研究了在扩增体系中加入基质细胞衍生因子1和PF4对脐血分离出单个核细胞。

按照MACSCD34+细胞单选试剂盒（MiltenyiBiotchInc.）说明书分离纯化CD34+细胞。

　　体外扩增培养

　　将纯化的CD34+细胞根据试验目的按2×104/ml接种于5-15mlStemlineTMII无血清培养液中，加入早期作用因子FL+SCF+TPO（FST），其中含有50ng/ml的SCF、100ng/ml的TPO和FL，并于接种0天添加1次IL-320ng/ml，将培养瓶置于37℃、5％的CO2孵箱中培养14天。

培养第4天加入等体积新鲜培养液。

培养第7天、第10天变体积换液，维持换液后细胞浓度为2×105/ml左右，并添加与第4天相同浓度细胞因子的新鲜培养液，对换出的细胞分别进行有核细胞计数、集落测定，应用流式细胞仪进行细胞免疫表型检测。

于培养第10天收获部分扩增产物，然后按新鲜MNC分选步骤再次纯化CD34+细胞。

　　实验分组

　　FST组：

含有早期作用因子FST组合的无血清培养液；SDF-1组：

FST组成分+SDF-1；PF4组：

FST组成分+PF4；SDF-1+PF4组：

FST组成分+SDF-1+PF4。

细胞因子均购自Peprotech公司。

　　造血祖细胞集落分析

　　培养基为甲基纤维素培养基H4435（StemCellTech），内含细胞因子SCF50ng/ml，IL-3、IL-6、GM-CSF和G-CSF各为20ng/ml以及EPO3U/m1。

接种纯化的CD34+细胞500/m1、扩增后的NC1×104/ml，每份标本接种24孔板，复设3孔，每孔ml。

于37℃、5%的CO2孵箱中培养28天，在第14天计数CFU-GM、BFU-E和CFU-MIX，在第28天计数HPP-CFU。

　　流式细胞术分析

　　应用直标单克隆抗体双色荧光流式细胞术检测纯化的CD34+细胞以及不同扩增时间的CD34+细胞表面黏附分子的表达情况。

所用单克隆抗体分别为：

抗－CD34－FITC、抗－CD11a－PE、抗－CD49d－PE、抗－CD49e－PE、抗－CD54－PE、抗－CD62L－PE、抗－CXCR-4－PE，同时设立同型IgG双阴性对照，标记细胞用流式细胞仪（BectonDickinsonFACSVantage）分析。

　　扩增后脐血CD34+细胞总黏附性检测

　　用含20μg/ml人纤连蛋白的PBS包被96孔板。

将各组扩增后第10天富集的CD34+细胞悬浮于黏附缓冲液（含5g/LBSA的IMDM），调整细胞密度为1×105/ml，加入孔板，100μl/well。

每份标本分4组：

A组为不加细胞的空白组；B组为CD34+细胞组；C组为CD34+细胞添加SDF-1组；D组为CD34+细胞阳性对照组。

每组复设3个孔。

37℃孵育1小时，吸去B组和C组缓冲液和非黏附细胞。

100μl细胞悬液中加入MTT20μl（5mg/ml），37℃孵育4小时，离心弃上清，加二甲亚砜100μl/well，振荡混匀，用酶标仪（SLTSPECTRAⅡ型）在570nm处测吸光度（A570）。

公式

　　自发黏附率＝×100％

　　SDF-1诱导黏附率＝×100％

　　趋化试验

　　将扩增第10天富集的CD34+细胞悬浮于趋化缓冲液（含%BSA的IMDM）中，调整细胞密度为1×106／ml，在transwell板的上层添加细胞悬液100μl。

每份标本分2组：

A组下层添加趋化缓冲液600μl；B组下层添加含有SDF-1（100ng/ml）的缓冲液600μl。

每个实验组复设2孔。

37℃孵育4小时后用流式细胞仪测定细胞的迁移率，具体方法将transwell板下层的细胞收入管中，另取原细胞悬液100μl，加缓冲液500μl，振荡混匀，分别用流式细胞仪高速计细胞数20秒。

每孔计数3次，取平均值。

设对照组CD34+细胞迁移率为100%，实验组用对照组的相对百分数±标准差表示。

公式

　　自发迁移率＝×100％

SDF-1诱导迁移率＝×100％

　　统计学处理

　　应用SPSS统计软件包进行分析，结果以均值±标准差表示，组间比较采用配对t检验。

　　结果

　　SDF-1和PF4对脐血CD34+细胞扩增的影响

　　扩增第7、10、14天，各组间有核细胞扩增倍数比较显示，SDF-1组和SDF-1+PF4组NC数均高于FST组和PF4组，而SDF-1组与SDF-1+PF4组、FST组与PF4组比较无明显统计学差异。

在扩增第7天，各组间CD34+细胞扩增倍数无显着性差异，但在扩增第10天，SDF-1组和SDF-1+PF4组CD34+细胞扩增倍数高于FST组和PF4组。

在扩增第14天，SDF-1组和SDF-1+PF4组CD34+细胞扩增倍数高于FST组，SDF-1+PF4组高于PF4组，SDF-1组与PF4组比较P=。

各扩增时点SDF-1组与SDF-1+PF4组、FST组与PF4组间无显着性差异。

　　SDF-1和PF4对脐血CD34+细胞扩增中造血祖细胞集落形成的影响

　　扩增第7、10、14天，SDF-1组和SDF-1+PF4组的CFU-Mix、CFU-GM、HPP-CFU扩增倍数均明显地高于FST组和PF4组，SDF-1组与SDF-1+PF4组、FST组与PF4组之间无明显统计学差异。

在扩增第7、10天，各组间的BFU-E扩增倍数无明显统计学差异。

在扩增第14天，SDF-1组和SDF-1+PF4组的BFU-E扩增倍数明显地高于FST组，SDF-1组与PF4组比较P=，SDF-1+PF4组与PF4组比较P=，SDF-1组与SDF-1+PF4组、FST组与PF4组间无明显统计学差异。

Table1.Expansionmultipleoftotalnucleatedcells，CD34+cellsandvariouscoloniesduringtwo-weekexpansion（略）

　　SDF-1和PF4对脐血CD34+细胞扩增中黏附分子表达和黏附功能的影响

在扩增过程中，各实验组和对照组CD34+细胞群体中表达黏附分子CD49d、CD11a的CD34+细胞比例均在99％以上，各组间无明显统计学差异。

在扩增过程中，各实验组和对照组之间CD34+细胞的CD62L表达阳性率无明显统计学差异。

扩增第7、10、14天，SDF-1组、PF4组和SDF-1+PF4组CD34+细胞的CD49e表达阳性率均高于FST组，SDF-1组、PF4组和SDF-1+PF4组之间无明显统计学差异。

扩增第7、10、14天，PF4组和SDF-1+PF4组CD34+细胞的CD54表达阳性率均高于FST组，SDF-1组和FST组、PF4组和SDF-1+PF4组之间无明显统计学差异。

扩增第10天对各组扩增后再纯化的CD34+细胞的自发黏附率和SDF-1诱导黏附率进行比较，SDF-1组、PF4组和SDF-1+PF4组均明显高于FST组，SDF-1组、PF4组和SDF-1+PF4组的自发黏附率之间比较无显着性差异，但PF4组和SDF-1+PF4组的SDF-1诱导黏附率高于SDF-1组，PF4组与SDF-1+PF4组的SDF-1诱导黏附率无显着性差异。

Table2.ExpressionofadhesionmoleculesandCXCR-4onUCBCD34+cellsduringtwo-weekexpansionTable3.AdhesionrateandmigrationrateofUCBCD34+cellsafter10daysofexpansionexvivo

　　SDF-1和PF4对脐血CD34+细胞扩增中CXCR-4表达和迁移功能的影响

扩增第7、10、14天，PF4组CD34+细胞的CXCR-4表达阳性率均明显高于FST组、SDF-1组和SDF-1+PF4组，SDF-1组CD34+细胞的CXCR-4表达阳性率均低于FST组，SDF-1组和SDF-1+PF4组无明显统计学差异。

扩增第7天和第10天，SDF-1+PF4组和FST组CD34+细胞的CXCR-4表达阳性率无明显差异，但扩增第14天时SDF-1+PF4组CD34+细胞的CXCR-4表达阳性率明显低于FST组。

在扩增第10天对各组扩增后再纯化的CD34+细胞的自发迁移率和SDF-1诱导迁移率进行比较，SDF-1组和SDF-1+PF4组的自发迁移率明显高于FST组和PF4组，SDF-1组与SDF-1+PF4组之间比较，P=，PF4组和FST组之间比较无显着差异。

SDF-1组的SDF-1诱导迁移率低于FST组，PF4组和SDF-1+PF4组明显高于FST组和SDF-1组，PF4组和SDF-1+PF4组之间无显着差异。

　　讨论

　　我们以前的研究探讨了UCBCD34+细胞在扩增过程中归巢相关功能的变化，结果发现短期体外扩增并不影响HSPC的归巢相关功能，但随着体外扩增时间延长部分归巢相关黏附分子的表达、黏附功能特别是迁移功能呈明显下降趋势，有可能对扩增后CD34+细胞的归巢产生某些不利影响［1］。

SDF-1和PF4都属于趋化因子CXC亚家族成员，目前有研究提示，它们能够增强HSPC的归巢功能，其中SDF-1通过与其受体CXCR-4结合后能够激活焦点黏附物，使细胞骨架蛋白发生改变，增强细胞运动能力，增强β1整合蛋白介导的、与血管内皮细胞和胞外基质成分如FN的黏附［2，3］。

而PF4能够上调原代CD34+细胞CD49d、CD54和CXCR-4表达及其黏附功能［4］。

因此，我们将SDF-1和PF4加入到扩增体系中，研究其对扩增后脐血CD34+细胞黏附分子表达、黏附特性和趋化功能的影响，以期通过优化体外扩增因子组合方案在扩增UCBHSPC的同时保持其归巢相关功能。

SDF-1和PF4能否加入扩增体系中的前提是加入这两个因子不能影响我们已建立的体外扩增体系对UCBHSPC的扩增有效性。

有研究提示，SDF-1能够诱导造血干/祖细胞由G0期进入G1期，与SCF等生长因子联合可能对扩增人外周血CD34+细胞及促进集落形成产生协同作用［5］。

本实验结果显示，在我们建立的无血清无基质扩增体系中加入SDF-1（100ng/ml）的实验组，扩增14天后NC、CD34+细胞、造血祖细胞集落扩增倍数均高于FST组。

扩增第7、10、14天，PF4组与FST组的NC、CD34+细胞、造血祖细胞集落扩增倍数之间比较无差异。

这提示在扩增体系中加入SDF-1可在一定程度上增加扩增效率，而低剂量的PF4（100ng/ml）并不影响CD34+细胞及造血祖细胞集落数量的扩增有效性。

PF4+SDF-1组与SDF-1组的NC、CD34+细胞、造血祖细胞集落扩增倍数之间比较，差异无显着性，提示PF4和SDF-1之间无明显的协同效应。

研究证明，CD34+细胞通过黏附分子CD54和β1整合蛋白与血管内皮细胞和胞外基质成分如FN相互作用调控归巢功能［6，7］。

我们的前期研究已证明，体外扩增7天以后CD54的表达呈下降趋势，体外扩增10天以后脐血CD34+细胞的自发黏附率和SDF-1诱导黏附率也出现下降［1］。

本实验结果显示，扩增第7、10、14天PF4组和SDF-1+PF4组CD54的表达均高于FST组，SDF-1组和FST组间无差异，这提示PF4能够上调扩增后的脐血CD34+细胞CD54表达，而SDF-1对CD54的表达无明显影响。

在扩增体系中单独或联合加入SDF-1和PF4，在扩增第10天均能够增强扩增后的脐血CD34+细胞与FN的自发黏附率和SDF-1诱导黏附率。

我们进一步发现，扩增第7、10、14天，SDF-1组、PF4组和SDF-1+PF4组CD49e的表达均高于FST组，提示SDF-1和PF4能够增强扩增后的脐血CD34+细胞黏附FN能力与SDF-1和PF4能够上调CD49e的表达相关。

PF4组和SDF-1+PF4组的SDF-1诱导黏附率高于SDF-1组，这可能与PF4组和SDF-1+PF4组CD34+细胞的CXCR-4表达高于SDF-1组相关。

在扩增体系中同时加入PF4和SDF-1未能观察到对扩增后的脐血CD34+细胞的总黏附性和黏附分子表达产生明显的协同效应。

SDF-1和它的受体CXCR-4在CD34+迁移和归巢中起着重要作用，SDF-1和它的受体CXCR-4相互作用促进CD34+细胞迁移至骨髓微环境并定居下来［8］。

研究表明，SDF-1与CXCR-4结合后激活焦点黏附物使细胞骨架蛋白发生改变，从而增强细胞迁移能力［2］，本实验结果显示，扩增第10天时SDF-1组自发迁移率明显高于FST组和PF4组，提示在扩增体系中加入SDF-1能够增强扩增后的脐血CD34+细胞的自发迁移率。

但SDF-1组SDF-1诱导迁移率明显低于FST组和PF4组，进一步发现SDF-1组CXCR-4的表达率低于FST组和PF4组，提示在扩增体系中加入SDF-1可能导致扩增后的脐血CD34+细胞的SDF-1诱导迁移率进一步下降，这可能和SDF-1与其特异性受体CXCR-4长期作用导致CXCR-4在细胞表面表达下调相关。

扩增第10天，PF4组SDF-1诱导迁移率明显高于FST组和SDF-1组，但PF4组自发迁移率与FST组比较无明显差异，提示在扩增体系中加入PF4能够增强扩增后的脐血CD34+细胞的SDF-1诱导的迁移率，但并不能增强其自发迁移率。

进一步发现，PF4能够上调扩增后的脐血CD34+细胞的CXCR-4的表达，提示PF4通过上调扩增后的脐血CD34+细胞的CXCR-4的表达而增强扩增后的脐血CD34+细胞的SDF-1诱导迁移率。

本实验显示，扩增第10天，SDF-1+PF4组自发迁移率和SDF-1诱导迁移率均高于FST组，SDF-1+PF4组自发迁移率高于PF4组但与SDF-1组无明显差异，SDF-1+PF4组的SDF-1诱导迁移率高于SDF-1组，但与PF4组无明显差异，提示在扩增体系中同时加入SDF-1和PF4在扩增第10天能够同时提高扩增后的脐血CD34+细胞的自发迁移率和SDF-1诱导迁移率，这可能是SDF-1和PF4的作用相叠加的结果。

总之，SDF-1和PF4能够用于UCBHSPC体外扩增，在扩增体系中加入SDF-1和PF4能够上调经扩增的CD34+细胞的部分归巢相关黏附分子表达，增强经扩增的CD34+细胞的黏附和迁移能力，可能有利于经扩增的CD34+细胞的归巢。

【参考文献】

　　1ZhaiQL，QiuLG，LiQ，etal.Short-termexvivoexpansionsustainsthehoming-relatedpropertiesofumbilicalcordbloodhematopoieticstemandprogenitorcells.Haematologica，2004；89:

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　　2ZhangXF，WangJF，MatczakWE，etal.Januskinase2isinvolvedinstromalcell-derivedfactor-1alpha-inducedtyrosinephosphorylationoffocaladhesionproteinsandmigrationofhematopoieticprogenitorcells.Blood，2001；97:

3342-3348

　　3PeledA，GrabovskyV，HablerL，etal.ThechemokineSDF-1stimulatesintegrin-mediatedarrestofCD34+cellsonvascularendotheliumundershearflow.JClinInvest，1999；104:

1199-1211

　　4ZhangJ，LuSH，LiuYJ，etal.Plateletfactor4enhancestheadhesionofnormalandleukemichematopoieticstem/progenitorcellstoendothelialcells.Le