慢病毒包装.docx

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慢病毒包装

慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。

它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。

其中研究最多的是HIV-1慢病毒。

慢病毒载体（Lentivirusvector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。

目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。

与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。

慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。

在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。

慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。

包装质粒在巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒（vesicularstomatitisvirus，VSV）G糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。

用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。

第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。

第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有附属基因。

这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。

第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性：

一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR,使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，这样原始的HIV基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个（gag、pol和rev）。

因此第三代慢病毒载体系统更加安全。

目前慢病毒已被广泛地应用在RNA干扰研究中。

由于有些类型的细胞脂质体转染的效果差，转移到细胞内的shRNA半衰期短，体外合成的siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因此其应用也受到了较大的限制。

采用事先体外构建能表达shRNA的载体，然后包装成能表达shRNA的慢病毒颗粒，就能直接感染一些难对付的细胞，不仅方便易行，且可以达到基因表达的持久抑制效果。

基于慢病毒的慢病毒载体的研究已经发展到一定水平，因此用慢病毒作为基因转移载体的临床研究已经开始，在实验室和临床研究中，慢病毒具有特别的优点，尤其是能感染非分裂期的细胞、免疫反应小。

现在基于HIV的慢病毒载体的临床研究已经开始应用于人体。

吉凯基因向市场提供的慢病毒产品使用的是安全性能更高第三代慢病毒载体系统，包装质粒提供必要的慢病毒基因，来形成病毒粒子的结构蛋白和包装功能；包膜质粒提供包膜蛋白；载体质粒不仅表达目的基因，还提供包装信号和顺式作用原件。

吉凯基因向市场提供的慢病毒滴度可达到1E+8TU/mL，不必浓缩和纯化，就能感染目的细胞。

慢病毒感染目的细胞后用嘌呤霉素（puromycin）进行筛选，或通过GFP发出的绿色荧光来筛选。

让您对人、小鼠、大鼠等基因功能研究更加方便、快捷。

慢病毒使用操作手册

2011-10-2800:

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慢病毒操作注意事项安全性

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一、慢病毒的储存与稀释:

1.病毒的储存：

收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）

①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度

②反复冻融会降低病毒滴度：

每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。

2.病毒的稀释：

如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）。

混匀分装后4℃保存（请尽量在三天内用完）分装后使用。

二、慢病毒用于体外（InVitro）实验：

感染培养原代细胞和建系细胞。

慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI值）以及在体（InVivo）注射所需要的病毒量。

如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。

慢病毒感染目的细胞预实验

1.慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：

①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞（HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。

②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。

③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。

如：

病毒滴度为>1X108TU/ml即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。

2.以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。

第一天，准备细胞：

在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。

第二天，准备病毒：

取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。

亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。

第二天，感染目的细胞：

病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验。

a使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基。

b吸去培养基的培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液）。

c在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液。

d混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO2）孵育过夜。

注：

感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。

亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中。

慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高MOI值可以提高病毒的感染效率，但是当MOI高于20时，我们建议在培养基中加入ploybrene（8μg/ml左右）来提高病毒的感染效率。

第三天，更换培养液：

一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在8-12小时更换为宜）。

第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。

第六天，感染效率检测：

在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率；如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带MarkerGene的，可以通过Real-timeRT-PCR检测目的基因的表达来拍评估感染效率。

注意：

有些慢病毒载体上带有GFP绿色荧光蛋白，使用者可以在病毒感染96小时后用倒置荧光显微镜观察GFP绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况。

如果慢病毒载体携带其他MarkerGene如RFP\BFP可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况。

慢病毒表达时间较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染后96小时后观测荧光表达。

感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。

感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液，以保证细胞良好的生长状态。

三、慢病毒使用安全使用规范

慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒因此没有毒性作用。

但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，不建议使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。

除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。

使用时请参照如下所示进行实验：

1．病毒操作时最好使用生物安全柜。

如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机。

2．病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。

3．操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液或1%SDS中浸泡过夜后弃去。

4．用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：

拧紧培养瓶或盖紧培养板。

用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。

离开显微镜实验台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。

5．如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心，而且尽量使用组织培养室内的离心机。

6．脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。

四、悬浮细胞感染方法概要

1.根据细胞的量将细胞在1.5ml管中离心收集然后用100-200ul的无血清培养液稀释细胞沉淀，以细胞完全浸没在培养基中为准。

2.按照MOI换算病毒颗粒数量，吸取病毒液加入细胞中，将1.5ml管放在37℃度培养箱中孵育30分钟。

3.将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里。

4.加入足够量的新鲜培养液。

5.12小时后换液。

6.96小时后观察细胞阳性率。

五、相关专业术语：

MOI：

病毒感染复数传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。

其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。

噬菌体的数量单位为pfu。

一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfunumber/cell。

后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，本手册中提到的MOI都是沿用这个概念。

然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。

能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。

六、细胞培养器皿的相关参数

Flask/Dish

Surface（mm）

Cellnumber

MediaVolume

96wellplate

50

1.5-5.0×10

100μl

48wellplate

100

3.0×104-1.0×10

200μl

24wellplate

200

8.0×104-2.0×10

500μl

12wellplate

401

1.6-4.0×10

1.0