发酵期末总结.docx

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发酵期末总结

发酵工程

第一章（绪论）P1-8

发酵的定义：

人们把利用生物细胞在有氧或无氧条件下的生命活动来大量生产或积累生物细胞、酶类和代谢产物的过程统称为发酵。

P1（判断题）

六大营养要素：

碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水。

P56

判断是何种代谢产物P22-23（微生物书P106-145）

初级代谢产物：

初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸、多糖、脂类、维生素等。

P22（判断题）

次级代谢产物：

次级代谢产物是指生物生长到一定阶段后通过次级代谢合成的分子结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的小分子物质，如抗生素、生物碱、毒素、激素、色素等。

P23（判断题）

第二章（工业微生物菌种选育）P9-21

诱变育种：

通过诱变剂处理,提高菌种的突变频率,扩大变异幅度,从中选出具有优良特性的变异菌种。

P12-14

原生质体融合：

原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生全重组子的过程。

P14

基因工程育种：

基因工程育种是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的重要技术而发展起来的一门新兴应用科学，是一种自觉的、能像工程一样事先设计和控制的育种技术，可以完成超远缘杂交，是最新最有前途的育种方法。

P15

基因工程育种的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主要环节。

P16

自然选育：

自然选育指在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。

从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株，称为野生型菌株。

营养缺陷性菌株是野生型菌株经过人工诱变或自发突变失去合成某种成长因子的能力，只能在完全培养基或补充了相应的生长因子的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。

自然选育指在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。

紫外线诱变育种：

一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。

杂交育种：

？

生产菌种的常规保藏方法：

定期移植保藏法、液体石蜡保藏法、沙土管保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法、固体曲保藏法。

自然选育的作用：

在工业生产中可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。

致死率计算：

取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml，进行稀释分离，计算活菌细胞数。

第三章（发酵培养基）P56-75

培养基的基本作用：

1）满足菌体的生长。

2）促进产物的形成。

培养基按用途分为：

斜面培养基（目的：

使菌种迅速生长。

成分：

因菌种不同而异）

P60种子培养基（目的：

为获得一定质、量的菌种提供营养。

成分：

营养丰富，与发酵培养基接近）

发酵培养基（目的：

提供菌体生长繁殖，产物合成的营养。

成分：

完整，但不是很丰富）

碳源：

凡是能够提供微生物细胞物质和代谢产物中碳素来源的营养物质称为碳源。

P61

作用：

①提供微生物菌种的生长繁殖所需的碳成分。

②提供合成目的产物所必须的碳成分P61（工业中常用的葡萄糖由淀粉制备，葡萄糖为微生物能够直接利用的单糖）

速效碳源：

较迅速的被利用，有利于菌体的生长，如葡萄糖。

迟效碳源：

被菌体缓慢利用，有利于代谢产物的合成，如乳糖等。

氮源：

氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。

速效氮源：

较迅速的被利用，有利于菌体的生长。

如氨基酸、玉米浆等。

迟效氮源：

被菌体缓慢利用，有利于延长次级代谢产物的分泌期，如黄豆饼粉、花生饼粉等。

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵

若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。

正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。

生长因子：

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

P65（名词解释）

前体：

前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。

P66（苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%）（名词解释）

钾、钠、钙、铁离子：

P64（主要是铁离子：

青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml发酵罐必须进行表面处理）

产物促进剂：

所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

P66-67（名词解释）

培养基制备里的组分及灭菌方式：

灭菌：

在大规模发酵中应该尽可能的采取连续灭菌的操作，而且保证灭菌条件的稳定是保证发酵稳定的前提。

有时避免营养物质在加热的条件下，相互作用，可以将营养物质分开消毒。

Na2HPO4+CaCO3→CaHPO4+Na2CO3

有些物质由于挥发和对热非常敏感，就不能采用湿热的灭菌方法

生长繁殖代？

灰色链霉菌属放线菌。

碳源有葡萄糖、糖蜜、淀粉、蔗糖、甘露醇、有机酸。

氮源：

酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨等。

钠离子：

能维持细胞渗透压的功能；钾离子：

影响细胞膜透性；钙离子：

调节细胞透性、发酵液中磷酸盐含量。

（选择、判断）

葡萄糖能形成酸性物质，是生理酸性物质。

（x）

培养基灭菌判断？

第四章（灭菌）P76-91

灭菌：

采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。

（灭菌的实质：

杀菌：

指菌体虽死，但形体尚存。

溶菌：

指菌体杀死后，其细胞发生溶化）

消毒：

消毒一般是指采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。

P76

一般的灭菌方法P76-77

物理：

干热灭菌、湿热灭菌、过滤除菌、射线灭菌

化学药剂灭菌（常用的化学药物有甲醛、苯酚、高锰酸钾、洁尔灭、氯化汞等）

连续灭菌：

连续灭菌也叫连消，是指将培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续地加热灭菌、冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。

P83

发酵对无菌空气的要求是：

无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标。

发酵对无菌空气的无菌程度要求是：

只要在发酵过程中不因无菌空气染菌，而造成损失即可。

V/V/M：

单位时间（min）单位体积（m3）培养基中通入空气的体积（m3）。

（v:

空气体积、单位体积、m：

时间）

维持罐保温时间，该段时间的长短决定了连续灭菌的效果。

真正灭菌场所是维持罐P84

1：

采风口2：

粗滤器3：

空压机（加压）4：

一级冷却器5：

二级冷却器6：

分水器7：

贮罐8：

旋风分离器9：

丝网除沫器10：

加热器11：

总过滤器12：

分过滤器

流程：

高空采样（10m），首先通过粗滤器除去空气中的大颗粒（保护后面的设备），再把空气吸入空压机后压缩再推出去再经过冷却进行降温，这时空气是湿空气状态，再进入分水器将水滴处理掉，再用贮罐将湿空气贮藏起来，让空气有一个稳定的正压，再过旋风分离器将大水滴分离掉，再用丝网除沫器将水分除掉，再通入加热器加热后变成干空气，再进入总过滤器，通过分过滤器将空气输送到各个洁净间。

实验室常用滤器的孔径是0.45μm和0.22μm。

可以拦截细菌、放线菌、酵母和霉菌等通过。

第五章种子制备及扩大培养P93-101

种子扩大培养：

是指将保存在沙土管、冷冻管、斜面试管中的处于休眠状态的菌种接入试管斜面或液体培养基活化，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐、增殖罐等逐级扩大规模培养而获得大量生产性能优良的纯种过程。

种子扩大培养的目的：

1）获得纯而壮活力旺盛的菌种。

2）获得满足接种量要求的培养物。

3）在扩大过程中，对菌种进行驯化。

4）最终实现缩短发酵时间，保证生产水平。

种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

P96

接种量是指移入的种子液体积与接种后培养液总体积的比例。

P96

种子异常分析：

种子异常往往表现为：

1）菌种生长发育缓慢或过快。

2）菌丝结团。

3）菌丝粘壁

种子质量要求：

菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，处于活力旺盛期

种子质量控制措施：

1）菌种稳定性的检查。

（产生菌必须保持有稳定的生产能力）2）无菌检查。

（在种子制备过程中，每移种一步均需进行杂菌检查。

）P97-98

菌种保藏：

根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使菌种的代谢活动处于休眠状态。

（低温、干燥、真空）

1.定期移植保藏法（将菌种放置4℃冰箱保藏，每间隔一定时间需重新移植培养一次。

一般保存期为3~6个月）2. 液体石蜡保藏法（保存期约一年左右）3.沙土保藏法（保藏时间可达数年，甚至数十年。

）4.真空冷冻干燥保藏法（许多菌种用此法可保藏10年以上。

）5. 液氮超低温保藏法（注意“慢冻快融”。

为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂，如甘油和二甲亚砜）6.固体曲保藏法等P19-20

防止菌种的衰退：

1.控制传代次数2.选择合适的培养基3.采用不同类型的细胞进行传代4.采用有效的菌种保藏手段。

P18-19

菌种的复壮措施：

1.纯种分离2.淘汰衰退的个体3.选择合适的培养条件

发酵级数的确定：

级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。

若级数大，则难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。

接种量＝移入种子的体积／接种后培养液的体积

种龄：

种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

第八、九章P123-160

发酵过程的主要控制参数P123-124

物理参数：

温度、压力、搅拌转数、搅拌功率（kW）、空气流量（V/V/min）、浊度、料液流量

化学参数：

pH、基质浓度、溶氧浓度（ppm或饱和度%）、氧化还原电位（mv）、产物浓度（ug/mL或U/mL）、废气中的氧浓度和CO2浓度

生物参数：

菌丝形态、菌体浓度

A.分批发酵：

分批发酵是指在一封闭培养系统内含有初始限制量的基质的发酵方式。

B.补料分批发酵：

是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加培养基，使菌体或其代谢产物的生产时间延长。

青霉素发酵为例：

在青霉素发酵中，前期是菌体生长阶段，后期是产物形成阶段。

前期希望菌体能以最大比生长速率快速生长，后期则能限制生长和控制氧的消耗，使青霉素快速合成。

在前期过多的葡萄糖将导致有机酸积累和溶解氧下降，葡萄糖不足将使有机氮源中的碳被迅速利用而导致pH上升。

因此，可以用pH或溶氧为控制参数进行前期的葡萄糖补加，在后期一般采用控制溶氧和补加葡萄糖的操作方式。

C.连续发酵：

发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。

补料分批培养的优点体现在如下几个方面：

答题时应该扩充来写

（1）可以消除底物抑制。

（在生产过程中葡萄糖）

（2）可以达到高密度细胞培养。

（从稳定期考虑-----补料分批发酵。

增加营养物质，如氮，延长对数生长期，提高产量）

（3）延长次级代谢产物的生产时间。

（发酵过程中的次级产物代谢产物过多，营养消耗快，补料稀释有毒物质，延长稳定期）

（4）稀释有毒代谢产物。

（5）操作和控制都比较简单

细胞生长周期：

延滞期、对数期、稳定期、衰亡期

生物量的测定方法：

1.直接计数测定（血球计数板和细菌计数板）2.比浊法3.生理指标法4.活菌计数法（MPN和平板菌落计数法）微生物课本P151~153

菌浓测定方法：

测粘度、压缩体积法（离心）、静置沉降体积法、光密度测定法（OD660适合于细菌、酵母）

整个发酵过程选择一个温度并不一定是理想的。

有时应该采用变温培养。

例如：

P131

根据模拟计算机对发酵温度最佳点的计算，得到青霉素发酵的最适温度是起初5小时维持在30℃；随后降到25℃，培养35个小时；再降到20℃培养85小时；最后回升到25℃培养40小时放罐。

采用这种变温培养，在该试验条件下比25℃恒温培养所得青霉素产量高了14.7%。

（青霉素产生菌的生长温度为30℃，产生青霉素的最适温度为25℃）

发酵最适温度的选择：

1.根据菌种生长阶段选择。

2.根据培养条件选择。

3.根据菌生长情况。

P130-134

发酵过程pH变化的原因：

1.基质代谢

（1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。

糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一

（2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。

（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降

2.产物形成：

某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。

如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。

3.菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。

例子：

林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。

若不及时补糖、（NH4）2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。

对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，发酵不再继续。

发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。

pH对发酵的影响：

pH影响酶的活性、pH值影响细胞膜的透性、pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离、pH影响代谢方向

例子：

青霉素：

菌体生长最适pH3.5~6.0,产物合成最适pH7.2~7.4

四环素：

菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适pH5.8~6.0

溶解氧DO（dissolvedoxygen）：

溶氧（DO）是需氧微生物生长所必需。

在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。

P137

摄氧率（r）：

单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。

mmolO2·L-1·h-1。

P138

比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：

单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，mmolO2·g菌-1·h-1

氧饱和度＝发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度。

所以对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度>1.

如何提高溶氧（可以通过Kla和（C*-C）来调节）P141-143

1.从供氧方面考虑：

a.改变通气速率（供气量）b.提高罐压c.在通入的空气中掺入纯氧，提高氧分压d.提高设备的供氧能力（KLa）增加搅拌，改变供气方式（KLa反映了设备的供氧能力，一般来讲大罐比小罐要好。

）

2.从需氧方面考虑：

a.养料的丰富程度影响菌体的生长b.温度的影响

泡沫的定义：

泡沫是气体被分散在液体中的胶体体系，属于气液非均相体系.P144

发酵过程泡沫产生的原因及其控制：

1.发酵过程泡沫产生的原因及其控制2.培养基配比与原料组成3.菌种、种子质量和接种量4.灭菌质量P144-145

起泡的危害：

1.降低生产能力2.引起原料浪费3.影响菌的呼吸4.引起染菌5.消泡剂的加入会使下游工程的分离带来困难

什么是染菌？

（发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长繁殖）

发酵染菌后的措施P158

（1）种子染菌后的措施

一旦发现种子罐被杂菌污染，应立即停止按种，种子罐灭菌后排放，对与种子罐连接的物料、供气等所有管道进行彻底灭菌。

与此同时，将未受污染的正常种子接人发酵罐中，以保证生产的连续性。

如无各用的种子，则可选择一罐菌体生长旺盛的发酵液进行分罐发酵。

从而保证生产的正常进行。

（2）发酵前期染菌后的措施

①发酵初期发生染菌，培养基中的碳、氮源含量基本不变，可终止发酵，将培养基重新进行灭菌处理后，接人种子进行发酵。

②如果染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。

③如果染菌情况轻微而发现较晚时，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多,也可采取降温培养、调节PH、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。

（3）发酵中、后期染菌后的措施

①发酵中、后期发现染菌，可以适当地加人杀菌剂或抗生素，补加正常的发酵液，以抑制杂菌的生长，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其他措施进行处理。

②在接近发酵后期出现染菌现象，如杂菌量不大，可维续发酵。

如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可采取措施提前放罐。

③对于没有提取价值的发酵液，应加热至120℃以上，保持30min后排放废弃。

（4）染菌后对设备的处理

发生染菌的发酵罐要查明染菌原因，如果是设备问题要及时加以维修。

设备重新使用前要进行严格检查，并进行彻底清洗，空罐加热灭菌至120℃以上，保持30min后才能使用。

也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。

常用消泡剂的种类和性能：

1.常用的天然油脂类2.聚醚类消泡剂3.高碳醇、脂肪酸和酯类4.硅酮类P147-148

发酵终点判断：

生产需要考虑成本和生产能力

确定放罐时间，须考虑因素：

1、经济因素2、产品质量因素3、特殊因素

一般放罐的指标：

1、产物的产量2、过滤速度3、氨基酸的含量4、菌丝形态5、pH

6、发酵液外观和黏度

放线菌由于生长的最适pH为7左右，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。

青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。

不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。

P149

污染不同种类和性质的微生物的影响：

（1）污染噬菌体。

（2）污染其它杂菌。

特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。

P150

不同时间染菌对发酵的影响：

（1）种子培养期染菌。

（2）发酵前期染菌。

发酵前期最易染菌，且危害最大。

原因：

发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。

染菌措施：

可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。

如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。

（3）发酵中期染菌。

（4）发酵后期染菌P150

染菌对产物分离的影响P151

染菌原因分析：

1、设备渗漏。

（这类染菌占33.85％。

）2、空气带菌。

（空气带菌而造成的染菌分别为19.96％和26%。

）3、种子带菌（种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。

）4、灭菌不彻底。

（①升温快慢、保温时间长短。

②蒸汽总压是否达到要求标准。

③环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。

④原材料储存和保管。

发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量——有无灭菌的死角）5、技术管理不善P153--155

染菌情况分析:

1、单罐染菌。

不是系统问题，而是该罐本身的问题。

如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、分过滤器失效等。

2、多罐染菌。

系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底等。

3、前期染菌。

种子带菌、培养基灭菌不彻底。

4、中后期染菌。

料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗漏，一般不会是种子问题。

P155

染菌的防治：

1、防止种子带菌。

2、防止设备渗漏。

3、防止培养基灭菌不彻底。

4、防止空气引起的染菌。

5、发酵染菌后的措施。

①染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。

②凡染菌的罐要找染菌的原因。

③染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒。

。

P155~157

染噬菌体的防治：

（一）染噬菌体对发酵的影响：

各种发酵系统在污染噬菌体后，往往出现一些明显的异常现象，如：

碳源和氮源的消耗减慢，发酵周期延长，pH值异常变化，泡沫骤增，发酵液色泽和稠度改变，出现异常臭味，菌体裂解和减少，引起光密度降低和产物锐减等。

污染严重时，无法继续发酵，应将整罐发酵液报废。

（二）产生噬菌体的原因：

由于生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，造成了自然界中噬菌体增殖。

（三）染噬菌体的检测：

噬菌斑检验。

（四）噬菌体的防治

预防措施：

（1）杜绝噬菌体的各种来源。

应定期监测发酵罐、管道及周围环境中噬菌体的数量变化。

（2）控制活菌体的排放。

活菌体是噬菌体生长繁殖的首要条件，控制其排放能消除环境中出现特定的噬菌体。

（3）使用抗噬菌体菌株和定期轮换生产用菌。

（4）注意通气质量。

（5）严格执行会客制度。

氧饱和度＝？

实验课程内容：

1.火焰接种时，我们为什么要关闭尾气的排放，同时，加大通风量？

答：

罐内要保持正压状态，操作时动作要快，时间不宜过长，且不要在火焰上方进行其他操作，避免因操作因素造成污染，倒入种子液时应避免将种子液倒至接种口外以避免染菌，接种时要关闭门窗，尽量减少环境的空气流通。

（主要就是为了防止外界空气倒吸导致染菌）

2.发酵罐灭菌时，在降温过程中，为什么不等到温度降到常温，就通入了无菌空气？

答：

因为罐内还有压力，不能直接打开，要让压力表上显示为零，还有温度降到90℃，因为再不通入空气的话，里面的蒸汽会冷凝成水，造成压力变低，导致倒吸入外界空气而染菌。

原因防止染菌。

（可以自己组织语言扩充）