啤酒酵母选育.docx
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啤酒酵母选育
啤酒酵母选育
紫外诱变及其突变株的性能测试
1材料与方法
1.1材料
菌种:
四铃啤酒酵母
仪器:
分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。
培养基:
麦芽汁培养基,麦芽汁固体培养基。
(麦芽汁由四铃啤酒厂提供)
1.2试验方法
1.2.1酵母菌的活化
取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养,于28℃恒温培养箱培养14h,得到正常生长时期的酿酒酵母菌悬液。
然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上,采纳28℃恒温培养14h,得到完全活化的正常生长的酵母菌。
1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定
1.2.2.1菌悬液的制备
取1OmL菌液离心收集菌体,洗涤2次后,菌体悬浮于1OmL生理盐水中,制得菌悬液。
取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中,摇匀,130r/min振荡培养,每隔2h取试管3个,放入冰箱,全部培养终止用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值,以空白的麦芽汁培养液为对比,按照所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。
(此图视为参考)
1.2.3紫外线诱变试验
用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释,使菌种的浓度达到lx106个/mL。
(此处菌悬液浓度的确定采纳三种方法:
1.显微镜直截了当计数法;2.平板菌落计数法;3.光电比浊计数法)
备注:
平板直截了当计数法:
如果过少菌液不易涂布开,过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流淌,不易形成单菌落,且培养周期长,耗时多,工作量大,然而也是我们的强项,能够锤炼大一的动手能力。
2:
显微镜直截了当计数法:
比较直观,我们能够直截了当显微观看,多人工作计数。
耗时较短,且工作量较小,同时我系其他实验组采纳此方法计数,可供参考。
3:
光电比浊法:
尽管绘制标准曲线要求较高,然而工作量较小,且一次绘制好标准曲线好后,以后能够用,准确率较高。
比较三种方法,我倾向于第一种和第三种,二者相比较,能够校正方案。
实验步骤:
打开30W紫外灯预热30min,使其功率达到稳固。
1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀,28℃活化培养14h。
2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min,弃上清液加入4mL生理盐水洗涤,在电磁振荡仪上震荡10min左右,重复2次,制成5mL悬液,用血球计数板在显微镜下直截了当计数,调整细胞浓度。
3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释,分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板,约为10-3、10-4、10-5,每一个梯度3个平板,每一个平板加0.2mL菌液,进行培养后平板计数法,作为对比。
4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中,加入一无菌磁力转子,置于磁力搅拌器上。
530W紫外灯下30cm处照耀,调整照耀时刻。
此次预设为0,30,45,60,90,120,180,600.(单位s)
6取一定稀释梯度的紫外照耀菌液0.1(视具体情形而定)用无菌涂布棒涂布平均,每组做三个平行线培养记录菌落数,运算各照耀时刻下的致死率。
(选在75%-80%)。
致死率=未经照耀菌落数-紫外照耀菌落数
未经紫外照耀菌落数
7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养,然后重复1-5,再重复第5步,挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养,连续进行5次,
28℃培养20h左右,运算其突变率和致死率。
(上述时刻等数字视为参考数值)
1.2.3.1初筛
诱变后选择在麦芽汁固体培养基上生长良好,菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。
1.2.3.2复筛
供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵,测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。
同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。
双乙酰含量测定:
初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml120Bx麦芽汁发酵8d后,测定发酵液中的双乙酰含量,选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵,将双乙酰含量明显降低的4株菌分不编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3和FB-E4。
结果见表1
表1发酵液中双乙酰含量的比较
菌株FBFB-E1FB-E2FB-E3FB-E4
双乙酰含量(mg/L)0.12330.07060.09260.07760.0870
降低率(%)042.724.937.129.4
(此处绘制表格样式视为参考)
降低前驱物质α-乙酰乳酸的生产量
措施:
改良酵母菌种
提升麦汁中α-氨基氮含量,能够抑制合成酶的活性
2加速双乙酰的还原
措施:
提升酵母的细胞密度(增大酵母菌的接种量)
提升还原温度(封罐后高温还原)
限制后期酵母的出芽率(封罐)
国标中关于啤酒中双乙酰的量的要求
二级啤酒:
0.2mg/L一级啤酒:
0.13mg/L
方法:
国标GB4927-2001检测
培养条件:
恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。
原理:
双乙酰的测定方法采纳比色法。
邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法,因此,此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量,结果偏高。
但此法快速简便。
用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来,加邻苯二胺,形成2,3—二甲基喹喔琳,其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸取峰,可进行定量测定。
1仪器:
带有加热套管的双乙酰蒸馏器,蒸汽发生瓶(2000mL或3000mL)或者锥形瓶,平底烧瓶,容量瓶25mL
2试剂和溶液
盐酸溶液(4moL/L),邻苯二铵溶液:
10g/L(称取邻苯二铵0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10mL摇匀,放于阴暗处,注意此溶液即用即配)
消泡剂
3实验步骤
(1)把双乙酰蒸馏器安装好,把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。
(2)将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下,使出口尖端浸没在水面下,外加冰水冷却。
(3)加热蒸汽发生器至沸,通汽加热夹套,备用。
(4)于100mL量筒中加入2~4滴消泡剂,再注入5℃左右未除气啤酒100mL。
(5)待夹套蒸馏器下端冒大汽时,打开进样口瓶塞,将啤酒迅速注入蒸馏器内,再用约10mL蒸馏水冲洗量筒,同时倒入,迅速盖好进样口塞子,用水封口。
(6)待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时,将排气夹子夹住,开始蒸馏,到馏出液接近25mL时取下容量瓶,用水定容至25mL,摇匀(蒸馏应在3分钟内完成)。
(7)分不吸取馏出液10mL于两支比色管中。
一管作为样品管加入0.5mL邻苯二胺溶液,另一管不加作空白,充分摇匀后,同时置于暗处放置20-30分钟,然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液,于空白管中加2.5mL4N盐酸溶掖,混匀。
(8)在335nm波长处,用1cm比色皿以空白作对比测定样品吸光度。
(9)运算:
双乙酰(mg/L)=A335×2.4(用20mm石英比色皿时,吸光度与双乙酰的换算系数)
注:
若用20mm的石英比色皿则换算系数则为1.2
1.2.4不同菌株的发酵性能测试(CO2失重法)
将发酵摇瓶置于26度恒温环境中,每天称重1次(直至日失重小于0.5g为止),因每瓶用于发酵的麦芽汁体积相同,因此只需运算发酵后单位时刻内CO2的开释量,发酵6d,以CO2产生量为纵坐标,发酵时刻为横坐标,绘制C02产生量曲线。
1.2.6不同菌株发酵发酵液中残留总糖含量测定
从8个发酵后的发酵瓶中各取0.2mL发酵液并稀释500倍,用硫酸-苯酚法测定发酵液中残留总糖的含量。
附录:
硫酸-苯酚法
1)葡萄糖标准液的配制
准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg,蒸馏水准确定容500mL得到0.04mg/L的葡萄糖液。
2)试剂
1)浓硫酸:
分析纯,95.5%
2)80%苯酚:
80克苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20克水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。
3)6%苯酚:
临用前以80%苯酚配制。
(每次测定均需现配)
4)15%三氯乙酸(15%TCA):
15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。
5)5%三氯乙酸(5%TCA):
25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中长期储存。
6)6mol/L氢氧化钠:
120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。
7)6mol/L盐酸
表1标准曲线的制作步骤
管号012345678
葡萄糖0.00.40.60.81.01.21.41.61.8
蒸馏水2.01.61.41.21.00.80.60.40.2
苯酚液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0
浓硫酸5.05.05.05.05.05.05.05.05.0
取8支洁净的具塞试管按表2方法操作,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,以0号作为空白调零,在最大吸取波长处测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标,从而来绘制标准曲线。
1.制作标准曲线:
准确称取标准葡聚糖(或葡萄糖)20mg于500ml容量瓶中,加水至刻度,分不吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8,各以蒸馏水补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却,室温放置20分钟以后于490nm测光密度,以2.0ml水按同样显色操作为空白,横坐标为多糖微克数,纵坐标为光密度值,得标准曲线。
2.样品含量测定:
①取样品1克(湿样)加1mL15%TCA(三氯醋酸)溶液研磨,再加少许5%TCA溶液研磨,倒上清液于10毫升离心管中,再加少许5%TCA溶液研磨,倒上清液,重复3次。
最后一次将残渣一起到入离心管。
注意:
总的溶液不要超出10毫升。
(既不要超出离心管的容量)。
②离心,转速3000转/分钟,共三次。
第一次15分钟,取上清液。
后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。
最后滤液保持18毫升左右。
③水浴,在向比色管中加入2毫升6mol/L盐酸之后摇匀,在96℃水浴锅中水浴2小时。
④定容取样。
水浴后,用流水冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠摇匀。
定容至25毫升的容量瓶中。
吸取0.2ml的样品液,以蒸馏补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。
每次测定取双样对比。
以标准曲线运算多糖含量。
1.2.7不同菌株产酒精能力(酒精度)测试
快速氧化法
乙醇在酸性条件下,通过量的、一定浓度的重铬酸钾作用,氧化生成醋酸。
再将剩余的的重铬酸钾经硫代硫酸钠还原。
由反应过程中,通过消耗的硫代硫酸钠的量运算酒精含量。
试剂:
重铬酸钾溶液、硝酸溶液、碱性碘化钾溶液、淀粉溶液、硫代硫酸钠标准溶液
方法:
在蒸馏器的接收瓶中,加入10.00ml重铬酸钾溶液和25ml硝酸溶液。
并将空气冷凝器的出口插入此溶液中。
在蒸馏瓶中加入12ml水和1.00ml试样。
接好装置,迅速加热至沸,并连续煮沸3分钟,蒸馏即告完成。
在同意瓶中,加入300ml水、10ml碱性碘化钾溶液及10ml淀粉溶液,在电磁搅拌器搅拌下,用硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡青色的淀粉终点。
通过如下公式运算酒精含量。
酒精(%,V/V)=(20.00-0.6575V)/Vs
式中V——硫代硫酸钠标准溶液滴定量
Vs——试样取样量
方法二:
2.2蒸馏—密度瓶法
2.2.1仪器
全玻璃蒸馏器(500mL)、恒温水浴(精度±0.1℃)、容量瓶(100mL)、移液管(100ml)分析天平(感量0.1mg)、天平(感量0.1g)、25ml附温度计密度瓶
2.2.2操作方法
用100mL容量瓶准确量取试样100ml,置于蒸馏瓶中,用50ml水分三次冲洗容量瓶,洗液并入蒸馏瓶中,加玻璃珠数粒,装上蛇型冷凝管,用原100ml容量瓶接收馏出液(外加冰浴),慢慢加热蒸馏,收集约96ml馏出液(蒸馏应在30-60分钟内完成),取下容量瓶,调温到20℃,补水定容,混匀。
用25mL附温度计密度瓶测试样馏出液20℃的相对密度,按照相对密度查表,得到试样馏出液的酒精度(%,V/V),即为试样的酒精度。
2.3蒸馏装置
2.3.2试剂
重铬酸钾溶液、优级纯无水乙醇
2.4操作方法
2.4.1标准曲线的制备
吸取1ml无水乙醇于100ml容量瓶中,稀释至刻度,混匀。
分不吸取此稀释液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50ml容量瓶中,各加15.0ml重铬酸钾溶液,加水至刻度,混匀。
此标准系列相当于试样中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00(V/V)的酒精。
以空白标准作参比,在波长610nm,用1cm比色皿测定其余各标准的吸光度。
用吸光度对酒精浓度作图,绘标准曲线。
2.4.2试样的测定
在500ml蒸馏烧瓶中,加入100.0ml试样。
按1.2方法进行蒸馏,最后加适量水将蒸馏液补足为100.0ml。
吸取1.0ml蒸馏液于50ml容量瓶中,按标准曲线的制备的操作测定其吸光度,由标准曲线查出酒精含量(%、V/V)。
1.2.8α-氨基氮含量的测定
水合茚三酮是一种氧化剂,可使氨基酸脱羧氧化,而本身被还原成还原型水合茚三酮。
还原型水合茚三酮再与末还原的水合茚三酮及氨反应,生成蓝紫色缩合物,颜色深浅与游离α–氨基氮含量成正比,可在570nm下比色测定。
(1)样品稀释适当稀释样品至含1~3μgα–氨基氮/mL(麦汁一样稀释100倍,啤酒50倍,啤酒应先除气)。
(2)测定取9支10mL比色管,其中3支吸入2mL甘氨酸标准溶液,另3支各吸入2mL试样稀释液,剩下3支吸入2mL蒸馏水。
然后各加显色剂1mL,盖玻塞,摇匀,在沸水浴中加热l6分钟。
取出,在20℃冷水中冷却20分钟,分不加5mL碘酸钾稀释液,摇匀。
在30分钟内,以水样管为空白,在570nm波长下测各管的光密度。
运算:
α–氨基氮含量(μg/mL)=(样品管平均O.D./标准管平均O.D.)×2×稀释倍数
讲明:
式中
(样品管平均O.D./标准管平均O.D.):
表示样品管与标准管之间的α–氨基氮之比;
2:
标准管的α–氨基氮浓度(μg/mL),即(0.1072×14/75)×100;
方法二:
α-氨基氮的测定(茚三酮法)
1、实验试剂
a显色剂
100克磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)
60克磷酸二氢钾(KH2PO4)
5.00克水合茚三酮
3.00克果糖
用水溶液溶解后稀释至1升(此溶液在低温下用棕色瓶可储存2周,pH应为6.6-6.8。
操作时能够按比例配成100ml)。
b稀释溶液:
2克碘酸钾溶于600ml水中,再加入96%乙醇400ml.
c标准溶液:
溶107.2mg甘氨酸于100ml水中,0℃贮藏。
用时按要求稀释。
该溶液含有200mgα-氨基氮/升。
2、实验操作
取糖化的麦芽汁1.00ml(或者是其他的合适量,使稀释后的浓度为1-3mgα-氨基氮/升),放入100ml的容量瓶中,稀释到刻度,摇匀。
标准甘氨酸溶液稀释液:
取1.00ml标准溶液,在100ml的容量瓶中稀释到刻度。
取麦芽汁稀释溶液、水、标准的甘氨酸溶液(三个)稀释液各2.00ml,放入比色管中,(水用于空白对比),各比色管中分不加入1.00ml的显色剂,摇匀,在沸水中加热16min。
(现在应该预备20℃的水浴)
20℃水浴中冷却20min。
加入5.00ml的碘酸钾稀释溶液,摇匀,在30min内于570nm处测定吸光度值。
3、运算
游离的α-氨基氮(毫克/升麦芽汁)=2×100×样品溶液吸光度值/标准溶液平均吸光度
1.2.9絮凝性的测定
良好的絮凝性不仅能够减少发酵液的澄清时刻,降低酵母分离的能源消耗,还可防止酵母细胞长时刻悬浮于发酵液中致使细胞自溶,有损啤酒风味。
方法:
取发酵度试验沉淀的酵母,通过洗涤和离心,称取1.0g置于带刻度的锥形离心管内,使其悬浮在10mLpH4.5的醋酸缓冲液(O.5lg硫酸钙,6.8g冰醋酸用水稀释到1L)中,静置5min后,将此悬浮液重新连续摇动,使酵母重新全部悬浮起来,静置观看酵母凝聚沉降速度。
表2不同菌株絮凝性的比较
菌株FBFB-E1FB-E2FB-E3FB-E4
本斯值(ml)3.02.83.02.83.2
分不称取不同菌株酵母在离心管中摇匀,静置沉降时,形成一清晰界面逐步下降。
酵母在沉降时形成一清晰界面,讲明该酵母是凝集性酵母,从图2可见发酵度较高的菌株凝集性能稍差(做本试验时,室温若超过20℃,这对酵母的凝集性可能稍有阻碍)。
1.2.10还原性糖的测定
斐林试剂比色法测定还原糖(临时不采纳)
二、材料、仪器设备及试剂
1.分光光度计;2.分析天平(感量1/10000);3.水浴锅;4.具塞刻度试管;5.刻度吸管;6.容量瓶;7.离心机
1.斐林试剂A液:
40gCuSO4.5H2O溶解于蒸馏水定容至1L。
2.斐林试剂B液:
200g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6.5H2O)与150gNaOH溶于蒸馏水中,并定容至1升。
A、B两液分不贮存,使用前等体积混合。
3.0.1%葡萄糖标准液:
取80℃下烘至恒重的葡萄糖0.1000g,加蒸馏水溶解,定容至100ml。
4.0.1moL/LNaOH。
5.甲基红指示剂:
0.1g甲基红溶于250mL60%乙醇中。
6.10%Pb(Ac)2。
7.饱和Na2SO4(20℃19.5g)。
三、实验步骤
2.对含蛋白质较多的样品,此间可加10%Pb(Ac)2,除去蛋白质,至不再产生白色絮状沉淀时,加饱和Na2SO4除去余外的铅离子。
3.样品测定:
吸取6ml待测液,加4ml斐林试剂,其它操作与标准曲线相同,在590nm波长下读取吸光度。
以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度,在标准曲线上查出糖含量.
按下式运算还原糖的百分含量:
还原糖(%)=查得的糖毫克数×样品总体积×稀释倍数/(测定时取用体积×样品重×1000)×100
方法2:
试剂与材料(临时采纳此方法)
1.斐林试剂
甲69.3CuSO4.5H2O1000mL50mL/组
乙346g酒石酸钾钠+100gNaOH1000mL50mL/组
2、1%次甲基蓝
1g次甲基蓝+100mL水/班棕色瓶子储存
3、0.2%标准G2gG105度烘干到恒重加水到1000mL2000mL/班
4、碱式滴定管5、样品溶液:
待测G液
样品1:
稀释20倍,1000mL/班
样品2:
稀释50倍,1000mL/班6、电炉
操作方法:
1、斐林试剂标定
A取甲液5mL+乙液5mL,(注意:
甲液与乙液混合可生成氧化亚铜沉淀,应将甲液加入乙液,使开始生成的氧化亚铜沉淀重溶)置于250mL三角瓶中加入10mL水,并从滴定管加入0。
2%的标准G若干毫升(约23mL)。
(量操纵在后滴定时消耗G在0.5—1.0mL)
B电炉上加热至沸,并坚持微沸2分钟,加2滴1%次甲基溶液,趁沸以每两秒1滴的速度连续为滴加葡萄糖标准溶液用0.2%标准G滴定至蓝色消逝,有红棕色沉淀,溶液清亮为终点止。
记录耗用的G量V0,必须在1min内完成。
2、定糖预备试验
同1法取斐林试剂,加10mL样品液,摇匀于电炉上加热至沸腾,保持微沸2min,加2滴1%次甲基蓝,用0.2%G滴定至蓝色消逝。
记录耗用的G量为V1
3、样品中还原糖测定
同上法吸取斐林试剂加10mL样品液(预先稀释),补加(V0-V1)mL水,并从滴定管中预先加入(V1-1)mL0.2%G,摇匀至电炉上加热至沸,保持2min微沸,加入2滴1%次甲基蓝,连续用G滴定至蓝色消逝。
记录消耗的标准G体积为V毫升。
4、体积运算
还原糖含量(以G计)(g/mL)
=(V0-V)*0.002*1/10*n
V0----斐林试剂标定值,mL
V------样品糖液测定值,mL
0.002----标准GS液浓度,g/mL
10-----样品糖液体积,mL
n-----样品稀释倍数
备注:
方案中几处指标采纳多种方法,确实是为了提升测量数据的准确率,同时比较检测方法的容易性、工作量、试剂的种类,以确定最终的方案。