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第七章分子生物学其它实验技术

实验一M13克隆和DNA序列分析

一、原理和用途

DNA的序列分析是DNA分子克隆研究中最重要的方法之一，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片段的操作方面，都有着十分广泛的实用价值。

根据DNA序列，可以得知限制性酶切位点；可以了解蛋白质的编码区和上、下游调控序列，进而研究编码基因的表达；可以确定基因诱变后特异的碱基变化；在疾病基因诊断中，可提示疾病的分子缺陷，并确认某个位置的碱基突变，从而找出疾病发生的机制。

目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（1977）发明的化学修饰法。

这两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。

目前应用广泛的是M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA测序法。

M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）测序法的基本原理是：

M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体，但它在感染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染新的宿主菌。

把一段待测DNA用遗传工程方法插入双链的M13复制型DNA中，经过培养扩增，在培养物的上清液中可以提取到单链的M13噬菌体的DNA。

该单链DNA已含有插入待测DNA的序列，作为单链模板。

在待测DNA的3´端人工合成一段引物，在DNA聚合酶I作用下，复制链延长。

2’，3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）掺入到核苷酸生长末端，取代了脱氧核苷（dNTP）之后，由于ddNTP没有3’-OH基团，所以核苷酸链就不再能够继续延长（终止了链的合成），这种复制延长的终止是随机的，于是形成分子量、长度、大小不等的片段。

然后再电泳分离，自显影，读图分析碱基序列。

例如在同一个反应试管中，加入同一种DNA合成的引物和模板，DNA聚合酶，ddTTP，dTTP，以及其它3种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP和dCTP），其中dATP是带32P放射性标记的，那么经过适当的温育之后，将会产生出不同长度的DNA片段混合物。

它们全都具有同样的5’-末端，并在3’末端的ddTTP处终止。

将这种混合物，加到变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，就可以获得一系列全都以3’-末端ddTTP为终止残基的DNA片段的电泳谱带模式。

使用其它核苷酸的抑制物，如ddATP，ddCTP，ddGTP，并分别在不同反应试管中温育，然后连同第一个ddTTP反应，平行加到同一变性凝胶上作电泳分离，最后再通过放射自显影技术，检测单链DNA片段的放射性条带。

结果可以从放射性X光片上，直接读出DNA的核苷酸顺序。

由于M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）测序法采用的是DNA分子克隆的方法，即将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到一种合适的载体分子上。

使用这样的克隆程序的本身，就可以保证所有来自同一个重组体克隆的后代，都含有一种同源的插入序列。

另一个突出优点是，序列测定反应中所必须的引物序列是M13mp载体上多克隆位点两侧的已知序列（正向引物和负向引物），所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物，此引物称做“通用引物”（universalprimer），这样就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。

DNA碱基序列测定的方法还有很多，近年来还应用荧光标记代替了同位素标记，它是用4种不同最大吸收峰的荧光物质标记4种不同碱基，这样就可用仪器代替人工读图谱，再经过计算机处理，序列测定可完全自动化，效率大为提高，这样连成一体的仪器称为全自动测序仪。

二、实验材料

外源DNA和M13噬菌体载体。

三、溶液与缓冲液

1．M13mp系列载体

2．E.coliJML01及感受态细胞

3．TE缓冲液

4．T4DNA连接酶及缓冲液

5．DATP

6．SOB培养基：

100mL中含2.0gTryptone，0.5gYeastextract，0.05gNaCl，1.5％琼脂，混匀后加入KCl0.186g（pH7.0）。

7．100mmol/LIPTG：

24mgIPTG溶于lmLddH2O。

8．2％X-gal（M/V）：

溶于二甲基甲酰胺。

9．2×YT培养基：

100mL中含1.6g胰蛋白胨，1.0g酵母粉，0.5gNaCl，1.5％琼脂（pH7.0）。

10．0.7％YT上层琼脂：

YT液体培养基中入0.7％琼脂。

11．LB培养基：

100mL中含1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母粉，1.0gNaCl，1.5％琼脂（pH7.0）。

12．PEG

13．3mol/LNaAc

14．M13引物：

互补于M13克隆位点3’端DNA单链的人工合成的17个碱基的寡核苷酸片段。

15．[α-32P]dATP。

16．DNA聚合酶I（Klenow片段）。

17．10%过硫酸胺

18．TEMED

19．尿素

20．按表7－1加入4种dNTP底物混合物。

表7－1四种测序反应管中4种dNTP加入量

混合物

dATP

（mol/L）

dCTP

（mol/L）

dGTP

（mol/L）

dTTP

（mol/L）

1.96

245

1.94

322

1.94

322

1.94

322

21．4种ddNTP：

0.125mmol/LddATP

0.5mmol/LddCTP

0.5mmol/LddGTP

1.0mmol/LddTTP

22．上样液：

0.1%二甲基苯蓝

0.1％溴酚蓝

95％甲酰胺

10mmol/LEDTA

23．40％（W/V）丙烯酰胺:

N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（19:

1）：

丙烯酰胺38g

N，N’-亚甲基双丙烯酰胺2g

溶于ddH2O

定容至l00mL。

24．5×TBE：

Tris54.0g

Na2EDTA·2H2O0.93g

硼酸27.5g

加ddH2O至800mL

用硼酸调pH至8.0（约加2.5g）

用ddH2O定容至1L。

四、仪器设备及耗材

恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液器，吸头，EP管。

五、实验方法

1．外源DNA在M13噬菌体载体的克隆

（1）将适量的M13载体DNA与待克隆的外源DNA片段混合，两种DNA的体积合计不得超过7.5L；不足时，可加TE（pH8.0）将体积补足至7.5L。

加入1Ll0×T4DNA连接酶缓冲液和1L10mmol/LATP。

混匀后取出1L放于另一个含有9LTE（pH8.0）的管中，贮存于4℃备用。

注意：

10L连接反应液中应含M13DNA20ng（0.004pmol／L），待测插入片段取20ng～100ng（0.004pmol／L～0.02pmol／L），这种组合可得到适量的重组体，适于大多数克隆实验。

同时进行两个对照反应，其中：

①同等量的载体DNA，无外源DNA；②同等量的载体DNA和适量的对照DNA，后者应在以往的实验中曾成功地克隆于M13噬菌体（例如用识别四核苷酸序列并可产生合适粘端的限制酶消化的λ噬菌体DNA）。

（2）在步骤

（1）的每个反应中各加入0.5L的T4DNA连接酶，略加振荡，于16℃温育4～6h。

（3）从－70℃冰箱中取出一份冻存的E.coliJML01感受态细菌（每管100L），于室温融化，然后冰浴10min。

（4）吸取5L连接反应液，加入到感受态细胞中，混匀，立即置冰浴中45min。

（5）42℃热激90s，立即将管放回冰浴之中，2min后加入175LSOB培养液，轻轻振荡混匀。

（6）将上述混合培养物涂布在预先用20LIPTG（100mmol/L）和100LX-gal（20mg/mL）的LB琼脂平板上。

（7）将平皿倒置，于37℃培养8～12h，观察白色噬菌斑。

2．制备重组M13单链DNA模板

（1）挑取白色单菌落，接种于5mL2×YT液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

次日按1％比例稀释，继续培养至对数生长期。

（2）取2mL培养液加入10mL培养管中，再加入单个噬菌斑，于37℃振荡培养5～8h。

（3）将培养液转入1.5mLEppendorf管中，10000r/min离心10min。

（4）将上清液转入新的1.5mLEppendor管中，10000r/min再离心10min。

（5）吸取1.2mL上清液，加入到300LPEG溶液中，振荡混匀，室温或于4℃静置15min。

（6）10000r/min离心15min（沉淀M13颗粒），吸弃上清液，再离心2min，弃上清液。

（7）加入200LTE缓冲液，振荡，分散病毒颗粒。

（8）加入200L平衡酚，混匀，12000r/min离心5min。

（9）吸取180L上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:

24:

1），混匀，同上抽提1次。

（10）吸取160L上清液，加入1/10体积的3mol/LNaAc、2.5体积无水乙醇，于-70℃放置30min，沉淀单链DNA。

（11）10000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀用70％乙醇洗1次，离心5min，吸去上清液，再离心2min，吸去残余上清液，真空抽干沉淀。

（12）加入10LTE溶解沉淀，备用。

3．测序反应

（1）取4支1.5mL的Eppendorf管，标记A、C、G、T，分别加入以下试剂，备用。

A管：

1LXA、1L0.125mmol/LddATP，

C管：

1LXC、1L0.5mmol/LddCTP，

G管：

1LXG、1L0.5mmol/LddGTP，

T管：

1LXT、1L1.0mmol/LddTTP。

（2）于另一个1.5mLEppendorf管中加入4L重组M13单链DNA模板、2LL引物、1Ll0×聚合酶反应缓冲液，ddH20补至总体积12.4L，混匀。

置55℃～65℃保温10min，室温放置缓慢冷却，使引物与模板退火。

（3）加入lL[α-32p]dATP、1L大肠杆菌DNA聚合酶I（Klenow片段）、瞬时离心混匀。

（4）各取3L分别加入A、C、G、T管中，瞬时离心混匀。

（5）30℃水浴保温15min，各加入1L0.5mol/LdATP，瞬时离心混匀，再于30℃水浴保温15min。

（6）各管加入上样液4L，混匀，于95℃变性3min，速置冰中备用

4．测序凝胶板的制备、核苷酸链的电泳分离及放射自显影

（1）电泳用玻璃板处理

1确定凝胶接触面（制胶面），做上标记。

2制胶面用洗液处理，水冲净，洗洁净擦洗，水彻底冲净，竖起凉干。

3将凹槽玻璃板制胶面硅化（第一次使用的玻璃板需硅化2次），自然干燥。

（2）制胶模

1将玻璃板平放于实验台上，玻璃板间左右两侧边缘夹放0.4mm厚的边条。

2用胶带封住两侧及底边，夹子夹紧，30度水平夹角倾斜放置。

（3）配制6％聚丙烯酰胺凝胶溶液

1取12mL40％（W/V）丙烯酰胺:

N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（19:

1），37g尿素、16mL5×TBE、适量ddH2O，微加热溶解后定容80mL。

2真空抽气10min。

3加入300L10％过硫酸胺、20LTEMED，混匀。

（4）灌胶

1混匀后，立即缓缓平稳地将溶液灌入胶膜中，不能出现气泡。

2将鲨鱼齿梳平端插入凹槽胶中深约0.5～1.0cm。

3胶凝固后，除去下端封边的胶带，将胶板安置在垂直板电泳槽上，上、下槽内加入TBE缓冲液。

4小心将鲨鱼齿梳拔出，用TBE缓冲液洗槽，可加入1滴溴酚蓝观察胶面是否平整。

观察后，更换槽内缓冲液，将梳子反过来插入，齿尖正好与胶面接触，不得深入胶内。

（5）预电泳：

2000V电压，预电泳1h。

（6）上样。

（7）电泳：

用移液器小吸头将核苷酸序列测定反应液，按ACGT的次序把4管内的产物加到聚丙烯酰胺-尿素凝胶板点入鲨鱼齿梳齿间，可分两次上样，第一次上样3.5L，2000V电压电泳2h后，第二次将剩余样品全部上样，3000V电压电泳6～7h。

（8）加X光片：

取下胶板，掀起带凹槽玻璃板，胶上铺一层保鲜膜，去除气泡，于暗室中压片，-20℃曝光过夜（暗盒上最好压上重物，以便使X-光片与胶贴紧）。

（9）X光片的显影、定影：

将曝光完毕后的X-光片在暗室置于水中湿润，然后置于显影液中显影，直至条带清晰显示为止。

用水淋洗片刻后置于定影液中定影15min以上，取出干燥。

（10）读片：

从第二次上样的底部找到插入片段与载体连接处的限制性酶切序列（此顺序是已知的），以此为起点，从下往上读就是新合成链5’向3’的碱基序列（见图7-1），其互补链就是原插入M13的待测DNA3´至5´的碱基序列。

每次可读出200～300个核苷酸序列。

六、作业与思考题

1.序列分析过程中的终止效应是如何产生的？

2.如何根据放射自显影X-光片上的条带确定测序的核苷酸序列?

实验二Western印迹分析（I）

一、原理和用途

Western印迹分析（Westernblotting）是将蛋白质经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后转移到固相支持物上，然后用特异性抗体进行特异酶联免疫反应（ELISA）检测的免疫学方法。

它是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法，具有很高的灵敏度，能达到标准的固相放射免疫分析水平。

粗蛋白提取物中，小于50ng的抗原可以测出，在较纯的制剂中，可测出1～5ng抗原。

其原理是：

转化的外源基因正常表达时，转基因细胞中含有一定量的目的蛋白。

从转化细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质胺分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点。

然后加入特异抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的二抗，最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。

根据检出结果，可得知被检细胞内目的蛋白表达与否、浓度大小及大致的分子量。

在基因工程中，Western印迹分析是非常有用的技术，特别对转基因高等生物的研究中，可用于检测

（1）外源基因在转基因个体中的表达活性；

（2）外源基因在转基因个体中表达的器官组织特异性；（3）外源基因在转基因个体中的表达调控。

本实验以转基因植物的基因表达检测为例，介绍Western印迹分析的基本方法。

二、实验材料

转基因及非转化植物相同器官或部位的组织材料。

三、溶液与缓冲液

1．蛋白提取缓冲液：

25mmol/LTris·HCl（pH7.5）

10mmol/LKCl

20mmol/LMgCl2

lmmol/LDTT

lmmol/LPMSF（现加）

2．100％丙酮溶液（含0.09％β-巯基乙醇）。

3．样品缓冲液：

50mmol/LTris·HCl（pH6.8）

2％SDS

10％甘油

5％β-巯基乙醇

0.1％溴酚兰

4．30％单体贮液：

称取29.2g丙烯酰胺（Acr），0.8g甲叉双丙烯酰胺（Bis），ddH2O定容至100mL，4℃保存。

5．10％过硫酸铵：

一般现配现用。

称1g过硫酸铵，ddH2O定容至10mL。

6．浓缩胶缓冲液：

Tris3.03g

ddH2045mL

10％SDS2mL

用浓盐酸调pH至6.8，

ddH2O定容至50mL，复调pH至6.8。

7．4×分离胶缓冲液：

1.5mol/LTris·HCl

0.4％SDS，pH8.8

8．4×浓缩胶缓冲液：

0.5mol/LTris·HCl

0.4％SDS，pH6.8

9．10％SDS：

称取5gSDS，加双蒸水至50mL。

10．TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）。

11．10×电极缓冲液：

甘氨酸144g

Tris30g

10％SDS100mL

加蒸馏水至1000mL

12．固定液：

95％乙醇131mL

冰乙酸25mL

加蒸馏水至250mL

13．浸泡液：

95％乙醇79mL

醋酸钠17g

25％戊二醛1.25mL

硫代硫酸钠0.5g

加蒸馏水至250mL。

14．银染液：

AgNO30.25g

甲醛50L

加蒸馏水定容至250mL。

15．显色液：

碳酸钠6.25g

甲醛25L

加蒸馏水定容至250mL

16．脱色液：

乙醇250mL

冰乙酸80mL

加蒸馏水定容至1000mL

17．考马斯亮蓝染液：

0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250mL脱色液中。

在使用前边搅拌边加热至60℃。

18．第一抗体：

用被检蛋白质制备的兔抗血清。

19．第二抗体：

用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG。

20．转移缓冲液：

380mmol/L甘氨酸

50mmol/LTris

0.1％SDS

20％甲醇

加水至1000mL

21．封闭液：

含3％牛血清白蛋白（BSA）的TNT缓冲掖。

22．TNT缓冲液：

10mmol/lTris·HCl（pH8.0），

150mmol/LNaCl

0.05％Tween20

23．DAB显色液：

10mmol/LTris·HCl（pH7.6）

0.3％CoCl2

0.6％二氨基联苯胺（DAB）

30％H2O2。

24．碱性磷酸酶缓冲液：

100mmol/LNaCl

50mmol/LMgCl2

100mmol/LTris·HC1（pH9.5）

25．NBT/BCIP显色液：

碱性磷酸酶缓冲液10mL，加0.075％氯化硝基四氮唑蓝（75mgNBT溶于1mL二甲基甲酰胺）33L，0.075％5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（50mgBCIP溶于1mL二甲基甲酰胺）11L。

四、仪器设备及耗材

高速低温离心机，电泳仪，垂直平板电泳槽，摇床，洗脱仪，转移电泳槽，硝酸纤维素膜（NC膜），其它：

离心管、Tip头、一次性PE手套。

五、实验方法

1．植物可溶性蛋白的提取（4℃下进行）

（1）分别从转基因及非转化植物相同器官或部位剪取2g材料，用蒸馏水洗净，投到置4℃冰浴的研钵中；

（2）分别加入2倍体积的4℃下存放的蛋白提取液，研磨至匀浆；

（3）10000r/min离心，取上清液；

（4）加入5倍体积的冷丙酮（含0.09％的β-硫基乙醇），置－20℃1h；

（5）12000r/min离心，收集沉淀；

（6）冰冻干燥机干燥成粉末保存；

（7）使用时，用样品缓冲液溶解蛋白，取待测蛋白溶液lmL，适当稀释，在波长260nm和280nm下测吸光值，然后利用下列公式估计蛋白含量：

蛋白质浓度（mg/mL）＝1.45A280-0.74A260。

2．SDS-PAGE分离蛋白质

（1）制胶：

根据待检蛋白质的分子质量，确定需配制度凝胶浓度（表7－2）。

按表7－3配制相应浓度的胶。

表7－2丙烯酰胺浓度与被分离蛋白质的关系（SDS-PAGE）

丙烯酰胺浓度

分离蛋白质（Da）

5.0

0.57～2.12×105

7.5

3.6～9.4×104

10.0

1.6～6.8×104

15.0

1.2～4.3×104

表7－3SDS-PAGE分离胶的配方

贮液

分离胶中丙烯酰胺终浓度（％）

5.0

7.5

10.0

12.0

15.0

30％单体贮液（mL）

2.50

3.75

5.00

6.00

7.50

4×分离胶缓冲液（mL）

3.75

H2O（mL）

8.75

7.50

6.25

5.25

3.75

10％过硫酸铵（μL）

200

TEMED（μL）

（2）在配制凝胶时，将水、30％单体贮液混合完全后，真空脱气5min，然后加入过硫酸铵和TEMED，充分混合后，缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平板电泳槽两片玻璃的窄缝中，并注意在本操作过程中不能产生任何气泡。

然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水，在室温下静置15～30min。

当凝胶完全聚合后，则在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线。

除去上层水相，并用滤纸条吸干，再灌以浓缩胶。

浓缩胶的配方如表7－4。

灌制好浓缩胶后，立即插上样品梳子。

凝固后将电极缓冲液倒入电泳槽，并使负极槽液面高于短玻璃片，正极槽液面可稍低，轻轻将梳子拔出。

表7－4SDS-PAGE浓缩胶的配方

贮液

取用体积（mL）

30％单体贮液

0.650

4×浓缩胶缓冲液

1.250

H20

3.050

10％过硫酸铵

100

TEMED

（2）点样

将转基因植物蛋白质提取液、非转化植物蛋白质提取液、负对照样品、正对照样品及蛋白质分子量标准样品分别与载样缓冲液等体积混合，使用前100℃加热3～5min，每孔上样量一般为2～10g，蛋白液的浓度一般为lmg/mL。

记录样品顺序。

（3）电泳：

先以10～15mA稳流电泳，待溴酚蓝指示线（蓝色）到达浓缩胶和分离胶界面时，改为20～30mA稳流电泳。

电泳结束后，溴酚蓝泳动至接近凝胶边缘时停止电泳。

3．转移蛋白质

（1）电泳结束后，取出胶，置转移缓冲液中浸泡30min。

（2）剪取硝酸纤维素膜，于转移缓冲液中浸泡。

（3）将转移装置中的海绵置转移缓冲液中浸泡。

（4）将膜铺在胶上，排出气泡。

用两块3MM滤纸将胶和膜夹好，再夹上海绵，放入电转移槽中。

注意膜的一面靠正极（见图7－2）。

（5）电泳槽中加入转移缓冲液，60V、40℃下转移2.5h。

（6）取下胶和膜，倒扣于滤纸上，用铅笔在膜上描出胶上点样孔位置，揭去胶，从膜上剪下分子质量标准样品的泳道条带，置氨基黑中染色，照相。

4．封闭

（1）将转移后的硝酸纤维素膜置TNT缓冲液中冲洗2～3次。

（2）转入含1％BSA的TNT缓冲液中，37℃封闭30min，其间轻轻摇动。

5．免疫反应

（1）将封闭后的膜置TNT缓冲液中漂洗2～3次，每次5～10min。

（2）加入用TNT稀释的第一抗体10mL，37℃轻轻摇动1h。

（3）将结合了第一抗体的硝酸纤维膜，置TNT缓冲液中洗三次，每次5～10min。

（4）取1L第二抗体，用TNT缓冲液稀释至8mL。

（5）膜置NTN液中，加入稀释好的二抗，37℃轻轻摇动1h。

6．酶显色反应

（1）将硝酸纤维膜用TNT缓冲液洗三次，每次5～10min。

（2）将膜放入NBT/BCIP显

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