第七章分子生物学其它实验技术.docx

1、第七章分子生物学其它实验技术第七章 分子生物学其它实验技术实验一 M13克隆和DNA序列分析一、原理和用途DNA的序列分析是DNA分子克隆研究中最重要的方法之一，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片段的操作方面，都有着十分广泛的实用价值。根据DNA序列，可以得知限制性酶切位点；可以了解蛋白质的编码区和上、下游调控序列，进而研究编码基因的表达；可以确定基因诱变后特异的碱基变化；在疾病基因诊断中，可提示疾病的分子缺陷，并确认某个位置的碱基突变，从而找出疾病发生的机制。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert（19

2、77）发明的化学修饰法。这两种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、 G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前应用广泛的是M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA测序法。M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（ddNTP）测序法的基本原理是：M13噬菌体是一种单链DNA噬菌体，但它在感染宿主（大肠杆菌）后，在菌体细胞内复制成为双链并繁殖，又以单链形式透出菌体，再度感染新的宿主菌。把一段待测DNA用遗传工程方法插入双链的M13复制型DNA中，经过培养扩增，在培养物的上清液

3、中可以提取到单链的M13噬菌体的DNA。该单链DNA已含有插入待测DNA的序列，作为单链模板。在待测DNA的3端人工合成一段引物，在DNA聚合酶I作用下，复制链延长。2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）掺入到核苷酸生长末端，取代了脱氧核苷（dNTP）之后，由于ddNTP没有3-OH基团，所以核苷酸链就不再能够继续延长（终止了链的合成），这种复制延长的终止是随机的，于是形成分子量、长度、大小不等的片段。然后再电泳分离，自显影，读图分析碱基序列。例如在同一个反应试管中，加入同一种DNA合成的引物和模板，DNA聚合酶，ddTTP，dTTP，以及其它3种脱氧核苷三磷酸 （dATP、dGTP和dCTP

4、），其中dATP是带32P放射性标记的，那么经过适当的温育之后，将会产生出不同长度的DNA片段混合物。它们全都具有同样的5-末端，并在3末端的ddTTP处终止。将这种混合物，加到变性的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，就可以获得一系列全都以 3-末端ddTTP为终止残基的DNA片段的电泳谱带模式。使用其它核苷酸的抑制物，如 ddATP，ddCTP，ddGTP，并分别在不同反应试管中温育，然后连同第一个ddTTP反应，平行加到同一变性凝胶上作电泳分离，最后再通过放射自显影技术，检测单链DNA片段的放射性条带。结果可以从放射性X光片上，直接读出DNA的核苷酸顺序。由于M13噬菌体克隆-双脱氧核苷酸（d

5、dNTP）测序法采用的是DNA分子克隆的方法，即将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到一种合适的载体分子上。使用这样的克隆程序的本身，就可以保证所有来自同一个重组体克隆的后代，都含有一种同源的插入序列。另一个突出优点是，序列测定反应中所必须的引物序列是M13mp载体上多克隆位点两侧的已知序列（正向引物和负向引物），所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物，此引物称做“通用引物”（universal primer），这样就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。DNA碱基序列测定的方法还有很多，近年来还应用荧光标记代替了同位素标记，它是用4种不同最大吸收峰的荧光物质标记4种不同碱

6、基，这样就可用仪器代替人工读图谱，再经过计算机处理，序列测定可完全自动化，效率大为提高，这样连成一体的仪器称为全自动测序仪。二、实验材料外源DNA和M13噬菌体载体。三、溶液与缓冲液1 M13mp系列载体2 E.coli JML01及感受态细胞3 TE缓冲液4 T4 DNA连接酶及缓冲液5 DATP6 SOB培养基：100 mL中含2.0 g Tryptone，0.5 g Yeast extract，0.05 g NaCl，1.5琼脂，混匀后加入KCl 0.186 g（pH 7.0）。7 100 mmol/L IPTG：24 mg IPTG溶于l mL ddH2O。8 2 X-gal（M/V）

7、：溶于二甲基甲酰胺。9 2YT培养基：100 mL中含1.6 g 胰蛋白胨，1.0 g 酵母粉，0.5 g NaCl，1.5琼脂 （pH 7.0）。10 0.7YT上层琼脂：YT液体培养基中入0.7琼脂。11 LB培养基：100 mL中含1.0 g胰蛋白胨，0.5 g酵母粉，1.0 g NaCl，1.5琼脂（pH 7.0）。12 PEG13 3 mol/L NaAc14 M13引物：互补于M13克隆位点3端DNA单链的人工合成的17个碱基的寡核苷酸片段。15 -32PdATP。16 DNA聚合酶I（Klenow片段）。17 10%过硫酸胺18 TEMED19 尿素20 按表71加入4种dNTP

8、底物混合物。表71 四种测序反应管中4种dNTP加入量混合物dATP（mol/L）dCTP（mol/L）dGTP（mol/L）dTTP（mol/L）XA1.96245245245XC1.9416322322XG1.9432216322XT1.943223221621 4种ddNTP：0.125 mmol/L ddATP0.5 mmol/L ddCTP0.5 mmol/L ddGTP1.0 mmol/L ddTTP22 上样液：0.1%二甲基苯蓝0.1溴酚蓝95甲酰胺10 mmol/L EDTA23 40（W/V）丙烯酰胺: N，N-亚甲基双丙烯酰胺（19:1）：丙烯酰胺 38 gN，N-亚甲基

9、双丙烯酰胺2 g溶于ddH2O定容至 l00 mL。24 5TBE：Tris 54.0 g Na2EDTA2H2O 0.93 g硼酸 27.5 g加ddH2O至 800 mL用硼酸调pH至8.0（约加2.5 g）用ddH2O定容至1 L。四、仪器设备及耗材恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液器，吸头，EP管。五、实验方法1外源DNA在M13噬菌体载体的克隆（1）将适量的M13载体DNA与待克隆的外源DNA片段混合，两种DNA的体积合计不得超过7.5 L；不足时，可加TE（pH 8.0）将体积补足至7.5 L。加入1 L l0T4

10、 DNA连接酶缓冲液和1 L 10 mmol/L ATP。混匀后取出1 L放于另一个含有9 L TE（pH 8.0）的管中，贮存于4备用。注意：10 L连接反应液中应含M13 DNA 20 ng（0.004 pmolL），待测插入片段取20 ng100 ng（0.004 pmolL0.02 pmolL），这种组合可得到适量的重组体，适于大多数克隆实验。同时进行两个对照反应，其中：同等量的载体DNA，无外源DNA；同等量的载体DNA和适量的对照DNA，后者应在以往的实验中曾成功地克隆于M13噬菌体（例如用识别四核苷酸序列并可产生合适粘端的限制酶消化的噬菌体DNA）。（2）在步骤（1）的每个反应中

11、各加入0.5 L的T4 DNA连接酶，略加振荡，于16温育46 h。（3）从70冰箱中取出一份冻存的E.coli JML01感受态细菌（每管100 L），于室温融化，然后冰浴10 min。（4）吸取5 L连接反应液，加入到感受态细胞中，混匀，立即置冰浴中45 min。（5）42热激90 s，立即将管放回冰浴之中，2 min 后加入175 L SOB培养液，轻轻振荡混匀。（6）将上述混合培养物涂布在预先用20 L IPTG(100 mmol/L)和100 L X-gal（20 mg/mL）的LB琼脂平板上。（7）将平皿倒置，于37培养812 h，观察白色噬菌斑。2制备重组M13单链DNA模板（1

12、）挑取白色单菌落，接种于5 mL 2YT液体培养基中，37振荡培养过夜。次日按1比例稀释，继续培养至对数生长期。（2）取2 mL培养液加入10 mL培养管中，再加入单个噬菌斑，于37振荡培养58 h。（3）将培养液转入1.5 mL Eppendorf管中，10 000 r/min离心10 min。（4）将上清液转入新的1.5 mL Eppendor管中，10 000 r/min再离心10 min。（5）吸取1.2 mL上清液，加入到300 L PEG溶液中，振荡混匀，室温或于4静置15 min。（6）10 000 r/min离心15 min（沉淀M13颗粒），吸弃上清液，再离心2 min，弃上

13、清液。（7）加入200 L TE缓冲液，振荡，分散病毒颗粒。（8）加入200 L平衡酚，混匀，12 000 r/min离心5 min。（9）吸取180 L上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混匀，同上抽提1次。（10）吸取160 L上清液，加入1/10 体积的3 mol/L NaAc、2.5 体积无水乙醇，于-70放置30 min，沉淀单链DNA。 （11）10 000 r/min离心15 min，弃去上清液，沉淀用70乙醇洗1次，离心5 min，吸去上清液，再离心2 min，吸去残余上清液，真空抽干沉淀。（12）加入10 L TE溶解沉淀，备用。3测序反应（1）取4支1.

14、5 mL的Eppendorf管，标记A、C、G、T，分别加入以下试剂，备用。A管：1 L XA、1 L 0.125 mmol/L ddATP，C管：1 L XC、1 L 0.5 mmol/L ddCTP，G管：1 L XG、1 L 0.5 mmol/L ddGTP，T管：1 L XT、1 L 1.0 mmol/L ddTTP。（2）于另一个1.5 mL Eppendorf管中加入4 L重组M13单链DNA模板、2 L L引物、 1 L l0聚合酶反应缓冲液，ddH20补至总体积12.4 L，混匀。置5565保温10 min，室温放置缓慢冷却，使引物与模板退火。（3）加入l L -32pdATP

15、、1 L大肠杆菌DNA聚合酶I（Klenow片段）、瞬时离心混匀。 （4）各取3 L分别加入A、C、G、T管中，瞬时离心混匀。（5）30水浴保温15 min，各加入1 L 0.5 mol/L dATP，瞬时离心混匀，再于30水浴保温15 min。（6）各管加入上样液4 L，混匀，于95变性3 min，速置冰中备用4测序凝胶板的制备、核苷酸链的电泳分离及放射自显影（1）电泳用玻璃板处理1 确定凝胶接触面（制胶面），做上标记。 2 制胶面用洗液处理，水冲净，洗洁净擦洗，水彻底冲净，竖起凉干。3 将凹槽玻璃板制胶面硅化（第一次使用的玻璃板需硅化2次），自然干燥。（2）制胶模1 将玻璃板平放于实验台上

16、，玻璃板间左右两侧边缘夹放0.4 mm厚的边条。2 用胶带封住两侧及底边，夹子夹紧，30度水平夹角倾斜放置。（3）配制6聚丙烯酰胺凝胶溶液1 取12 mL 40（W/V）丙烯酰胺:N，N-亚甲基双丙烯酰胺（19:1），37 g尿素、16 mL 5TBE、适量ddH2O，微加热溶解后定容80 mL。2 真空抽气10 min。3 加入300 L 10过硫酸胺、20 L TEMED，混匀。（4）灌胶1 混匀后，立即缓缓平稳地将溶液灌入胶膜中，不能出现气泡。2 将鲨鱼齿梳平端插入凹槽胶中深约0.51.0 cm。3 胶凝固后，除去下端封边的胶带，将胶板安置在垂直板电泳槽上，上、下槽内加入TBE缓冲液。4

17、 小心将鲨鱼齿梳拔出，用TBE缓冲液洗槽，可加入1滴溴酚蓝观察胶面是否平整。观察后，更换槽内缓冲液，将梳子反过来插入，齿尖正好与胶面接触，不得深入胶内。（5） 预电泳：2 000V电压，预电泳1 h。（6） 上样。（7） 电泳：用移液器小吸头将核苷酸序列测定反应液，按ACGT的次序把4管内的产物加到聚丙烯酰胺-尿素凝胶板点入鲨鱼齿梳齿间，可分两次上样，第一次上样3.5 L，2 000 V电压电泳2 h后，第二次将剩余样品全部上样，3 000 V电压电泳67 h。（8） 加X光片：取下胶板，掀起带凹槽玻璃板，胶上铺一层保鲜膜，去除气泡，于暗室中压片，-20曝光过夜（暗盒上最好压上重物，以便使X-

18、光片与胶贴紧）。（9） X光片的显影、定影：将曝光完毕后的X-光片在暗室置于水中湿润，然后置于显影液中显影，直至条带清晰显示为止。用水淋洗片刻后置于定影液中定影15 min以上，取出干燥。（10）读片：从第二次上样的底部找到插入片段与载体连接处的限制性酶切序列（此顺序是已知的），以此为起点，从下往上读就是新合成链5向3的碱基序列（见图7-1），其互补链就是原插入M13的待测DNA 3至5的碱基序列。每次可读出200300个核苷酸序列。六、作业与思考题1. 序列分析过程中的终止效应是如何产生的？2. 如何根据放射自显影X-光片上的条带确定测序的核苷酸序列?实验二 Western印迹分析（I）一、

19、原理和用途Western印迹分析（Western blotting）是将蛋白质经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后转移到固相支持物上，然后用特异性抗体进行特异酶联免疫反应（ELISA）检测的免疫学方法。它是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法，具有很高的灵敏度，能达到标准的固相放射免疫分析水平。粗蛋白提取物中，小于50 ng的抗原可以测出，在较纯的制剂中，可测出15 ng抗原。其原理是：转化的外源基因正常表达时，转基因细胞中含有一定量的目的蛋白。从转化细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质胺

20、分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上，膜在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭非特异性位点。然后加入特异抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的二抗，最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。根据检出结果，可得知被检细胞内目的蛋白表达与否、浓度大小及大致的分子量。在基因工程中，Western印迹分析是非常有用的技术，特别对转基因高等生物的研究中，可用于检测（1）外源基因在转基因个体中的表达活性；（2）外源基因在转基因个体中表达的器官组织特异性；（3）外源基因在转基因个体中的表达调控。本实验以转基因植物的基因表达检测为例，介绍Western印迹分析的

21、基本方法。二、实验材料转基因及非转化植物相同器官或部位的组织材料。三、溶液与缓冲液1 蛋白提取缓冲液：25 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）10 mmol/L KCl20 mmol/L MgCl2l mmol/L DTTl mmol/L PMSF（现加）2 100丙酮溶液（含0.09-巯基乙醇）。3 样品缓冲液：50 mmol/L TrisHCl（pH 6.8）2SDS10甘油5-巯基乙醇0.1溴酚兰4 30单体贮液：称取29.2 g丙烯酰胺（Acr），0.8 g甲叉双丙烯酰胺（Bis），ddH2O定容至100 mL，4保存。5 10过硫酸铵：一般现配现用。称1 g过硫酸铵，ddH

22、2O定容至10 mL。6 浓缩胶缓冲液：Tris 3.03 gddH20 45 mL10SDS 2 mL用浓盐酸调pH至6.8，ddH2O定容至 50 mL，复调pH至6.8。7 4分离胶缓冲液：1.5 mol/L TrisHCl0.4SDS，pH 8.88 4浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L TrisHCl0.4SDS，pH 6.89 10SDS：称取5 g SDS，加双蒸水至50 mL。10 TE MED （N,N,N,N-四甲基乙二胺）。11 10电极缓冲液：甘氨酸 144 gTris 30 g10SDS 100 mL加蒸馏水至 1000 mL12 固定液：95乙醇 131 mL冰乙酸

23、25 mL加蒸馏水至 250 mL13 浸泡液：95乙醇 79 mL醋酸钠 17 g25戊二醛 1.2 5 mL硫代硫酸钠 0.5 g加蒸馏水至250 mL。14 银染液：AgNO3 0.25 g甲醛 50 L加蒸馏水定容至250 mL。15 显色液：碳酸钠 6.25 g甲醛 25 L加蒸馏水定容至250 mL16 脱色液：乙醇 250 mL冰乙酸 80 mL加蒸馏水定容至1000 mL17 考马斯亮蓝染液：0.29 g考马斯亮蓝R-250溶解在250 mL脱色液中。在使用前边搅拌边加热至60。18 第一抗体：用被检蛋白质制备的兔抗血清。19 第二抗体：用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG。20 转

24、移缓冲液：380 mmol/L甘氨酸50 mmol/L Tris0.1SDS20甲醇加水至1000 mL21 封闭液：含3牛血清白蛋白（BSA）的TNT缓冲掖。22 TNT缓冲液：10 mmol/l TrisHCl（pH 8.0），150 mmol/L NaCl0.05 Tween2023 DAB显色液：10 mmol/L TrisHCl（pH 7.6）0.3CoCl20.6二氨基联苯胺（DAB）30H2O2。24 碱性磷酸酶缓冲液：100 mmol/L NaCl50 mmol/L MgCl2100 mmol/L TrisHC1（pH 9.5）25 NBT/BCIP显色液：碱性磷酸酶缓冲液10

25、 mL，加0.075氯化硝基四氮唑蓝（75 mg NBT溶于1 mL二甲基甲酰胺）33 L，0.0755-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（50 mg BCIP溶于1 mL二甲基甲酰胺）11 L。四、仪器设备及耗材高速低温离心机，电泳仪，垂直平板电泳槽，摇床，洗脱仪，转移电泳槽，硝酸纤维素膜（NC膜），其它：离心管、Tip头、一次性PE手套。五、实验方法1植物可溶性蛋白的提取（4下进行）（1） 分别从转基因及非转化植物相同器官或部位剪取2 g材料，用蒸馏水洗净，投到置4冰浴的研钵中；（2） 分别加入2倍体积的4下存放的蛋白提取液，研磨至匀浆；（3） 10 000 r/min离心，取上清液；（4） 加入

26、5倍体积的冷丙酮（含0.09的-硫基乙醇），置20 1 h；（5） 12 000 r/min离心，收集沉淀；（6） 冰冻干燥机干燥成粉末保存；（7） 使用时，用样品缓冲液溶解蛋白，取待测蛋白溶液l mL，适当稀释，在波长260 nm和280 nm下测吸光值，然后利用下列公式估计蛋白含量：蛋白质浓度（mg/mL）1.45A280-0.74A260。2SDS-PAGE分离蛋白质（1） 制胶：根据待检蛋白质的分子质量，确定需配制度凝胶浓度（表72）。按表73配制相应浓度的胶。表72 丙烯酰胺浓度与被分离蛋白质的关系（SDS-PAGE）丙烯酰胺浓度分离蛋白质（Da）5.00.572.121057.53

27、.69.410410.01.66.810415.01.24.3104表73 SDS-PAGE分离胶的配方贮 液分离胶中丙烯酰胺终浓度（）5.07.510.012.015.030单体贮液(mL)2.503.755.006.007.504分离胶缓冲液(mL)3.753.753.753.753.75H2O(mL)8.757.506.255.253.7510过硫酸铵（L）200200200200200TEMED（L）1010101010（2） 在配制凝胶时，将水、30单体贮液混合完全后，真空脱气5min，然后加入过硫酸铵和TEMED，充分混合后，缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平板电泳槽两片玻璃的窄缝中，

28、并注意在本操作过程中不能产生任何气泡。然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水，在室温下静置1530 min。当凝胶完全聚合后，则在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线。除去上层水相，并用滤纸条吸干，再灌以浓缩胶。浓缩胶的配方如表74。灌制好浓缩胶后，立即插上样品梳子。凝固后将电极缓冲液倒入电泳槽，并使负极槽液面高于短玻璃片，正极槽液面可稍低，轻轻将梳子拔出。表74 SDS-PAGE浓缩胶的配方贮 液取用体积（mL）30单体贮液0.6504浓缩胶缓冲液1.250H203.05010过硫酸铵100TEMED10（2）点样将转基因植物蛋白质提取液、非转化植物蛋白质提取液、负对照样品、正对照样品及蛋白质

29、分子量标准样品分别与载样缓冲液等体积混合，使用前100加热35min，每孔上样量一般为210 g，蛋白液的浓度一般为l mg/mL。记录样品顺序。（3）电泳：先以1015 mA稳流电泳，待溴酚蓝指示线（蓝色）到达浓缩胶和分离胶界面时，改为2030 mA稳流电泳。电泳结束后，溴酚蓝泳动至接近凝胶边缘时停止电泳。3转移蛋白质（1）电泳结束后，取出胶，置转移缓冲液中浸泡30 min。（2）剪取硝酸纤维素膜，于转移缓冲液中浸泡。（3）将转移装置中的海绵置转移缓冲液中浸泡。（4）将膜铺在胶上，排出气泡。用两块3 MM滤纸将胶和膜夹好，再夹上海绵，放入电转移槽中。注意膜的一面靠正极（见图72）。（5）电泳

30、槽中加入转移缓冲液，60 V、40下转移2.5 h。（6）取下胶和膜，倒扣于滤纸上，用铅笔在膜上描出胶上点样孔位置，揭去胶，从膜上剪下分子质量标准样品的泳道条带，置氨基黑中染色，照相。4封闭（1）将转移后的硝酸纤维素膜置TNT缓冲液中冲洗23次。（2）转入含1BSA的TNT缓冲液中，37封闭30 min，其间轻轻摇动。5免疫反应（1）将封闭后的膜置TNT缓冲液中漂洗23次，每次510 min。（2）加入用TNT稀释的第一抗体10 mL，37轻轻摇动1 h。（3）将结合了第一抗体的硝酸纤维膜，置TNT缓冲液中洗三次，每次510 min。（4）取1 L第二抗体，用TNT缓冲液稀释至8mL。（5）膜置NTN液中，加入稀释好的二抗，37轻轻摇动1 h。6酶显色反应（1）将硝酸纤维膜用TNT缓冲液洗三次，每次510 min。（2）将膜放入NBT/BCIP显