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针对致病菌株的大量保守

副猪嗜血杆菌三聚自转运蛋白：

针对致病菌株的大量保守结构域的表达

编译者按：

副猪嗜血杆菌是目前困扰生猪养殖业的主要致病菌之一。

本文通过对副猪嗜血杆菌的三聚自转运蛋白的结构特征，侵袭性和非侵袭性菌株的结构域差异等的研究，旨在进一步了解该病致病株在组织的定植和侵袭特点。

摘要

副猪嗜血杆菌是Glasser’s疾病的病原菌，但关于该病的致病性因素目前知之甚少。

本文中，我们将就致病株Nagasaki，描述13个三聚自转运蛋白的分子特征，这些自转运蛋白由YadA的C-端转位分子区域所组成，这些转位分子被分为三组。

所有结构域都拥有模体和一些重复序列，这些模体和重复序列具有粘附素，红血球凝集素和侵袭素的一些特征，在其中心，有不同的胶原样重复拷贝。

这些区域结构共享H.somnus129Pt的两个三聚自转运蛋白。

通过微点阵杂交对基因组进行比较，论证了H.parasuis毒力株的同族关系和非毒力株的高变异性。

因此，这些基因被命名为vtaA（毒力相关型三聚自转运蛋白）。

对不同侵袭性菌株的17种同族体vtaA基因的测序阐明了一个广泛存在的镶嵌结构。

基于在vtaA基因中DNA吸收的信号序列，我们采用了一种演化机制，通过该机制，基因复制，变化的累积量以及基因重组，加上横向基因结构域的转移，都导致多基因家族的多样性。

本研究有助于了解副猪嗜血杆菌致病株组织定植和侵袭特点。

引言

对于细菌定植和存活而言，针对宿主组织的粘附素是一个重要因素。

粘附素是细菌表面的一种结构，介导同宿主细胞的相互作用。

粘附素在本质上各不相同，在其中一个三聚自身载体中，该载体也被称为AT-2家族，出现在革兰氏阴性菌中。

该家族具有结合真核细胞和胞外基质蛋白的能力。

这些蛋白质含有一个N-端信号肽，一个娩出成分，和一个负责在细胞外膜形成孔隙的C-端领域。

娩出成分常常包含多重具有粘附素和红细胞血凝素的重复序列（Hep-Hap）和基本序列（HIM）。

尽管在不同种类细菌之间，转为分子区域的氨基酸变化很大，但它们仍形成β-序列，通过该序列，娩出成分得以移至胞外。

它们的免疫原性使它们有望成为理想的疫苗。

在流感嗜血杆菌，莫拉杆菌，嗜血嗜血杆菌，脑膜炎奈瑟菌，或耶尔森氏菌中，人们已经部分或全部描述了它们的结构，功能及免疫原性等特征。

然而，并非所有对致病菌的研究都与重要的人类疾病息息相关。

在副猪嗜血杆菌中，该菌属革兰氏阴性，隶属Pasteurellaceae家族，人们对介导针对宿主组织的粘附素或毒力因子的分子结构基本上还知之甚少。

副猪嗜血杆菌常见于上呼吸道健康的猪群。

某些菌株能够迁移进入肺胀，引起肺炎，甚至引发严重的全身感染，其特点是纤维素性多发性浆膜炎，关节炎，脑膜炎等Glasser’s疾病。

虽然到目前为止已经鉴定出15种血清型，但仍然有许多菌株无法定型。

尽管在一个既定血清型的表型和H-型副猪嗜血杆菌之间不是严格的一一对应关系，但人们普遍认为，5-型具有高致病性，而3-型毒力较低。

该细菌的另一个显著特征是它的遗传变异性。

当对120株野株和11株参照株进行多轨迹分型方法鉴定时，发现了109种序列类型。

比较有趣的是，共观察到两种分歧，其中一种包括从患病猪中分离到的毒力株中的大多数。

尽管在H-型副猪中介导针对宿主组织的粘附素和毒力因子大体上尚不为人知，最近的研究仍然显示：

副猪嗜血杆菌菌株中5型和4型（时常被认为与毒性有关）往往首先自体外侵入猪脑血管内皮细胞。

由于这种侵袭并不消除蛋白酶K的作用，人们推测，假定的侵袭素不大可能是蛋白质。

然而，已描述的细菌粘附素中大多都是蛋白质。

本报道中，我们描述了高致病性副猪嗜血杆菌菌株中的13个同源基因以及17个编码VtaA蛋白的不同侵袭性菌株的同簇体，这些同簇体，常称之为AT-2，包含胶原三倍螺旋重复。

对来自致病性菌株且不具有非致病性菌株高度分歧特性的vtaA的同簇体而言，娩出成分相对保守。

而且，至少针对娩出成分而言，这些多基因家簇很可能涉及重复和横向基因转移。

材料和方法

细菌菌株和培养条件

副猪嗜血杆菌（表1）培养在巧克力琼脂平板上，置于37摄氏度含5%CO2的环境中，直到长满平板。

HP和F9菌株分别由HIPRAS.A实验室（西班牙）和西班牙巴塞罗那自治大学兽医学院从临诊剖检猪上分离得到。

细菌悬浮在磷酸盐缓冲液中，经离心回收，并于磷酸盐缓冲液中洗涤两次。

来自副猪嗜血杆菌基因组DNA经商品试剂盒抽提，并用Sau3AI和RsaI（新西兰生物公司）消化或超声降解。

之后，DNA降解片段用T4聚合酶连接（新西兰生物公司）。

DNA片段大小从450到1500bp不等，经琼脂糖凝胶纯化。

该基因组按以下方法进行构建：

DNA片段被插入到去磷酸化的载体pUC-9（使用新西兰快速链接试剂盒）的BamHI或SmaI克隆位点,并对一株大肠杆菌进行改造。

重组质粒DNA的分离使用的是NucleoSpin公司96孔闪存试剂盒。

（Macherey-Nagel）

测序，序列组装和基因分析

使用BigDyeTerminatorv3.1化学制品公司（应用生物制品公司）的M13通用引物质粒插入片段对该改造质粒进行测序。

该序列用PHRED,PHRAP程序组装成毗连序列群，并

同源性搜索和开放阅读框的确定分别使用的是GenBand公司提供的非冗余数据库（http:

//www.ncbi.nlm.nig.gov/BLAST/）的BlastN和BlastP程序，以及GeneMark（http:

//opal.biology.gatech.edu/GeneMark/heuristichmm2.cgi）公司提供的运算方法。

改造基因的结构域依据WellcomeTrustSangerInstitute（http//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）公司的Pfam数据库进行分析。

DNA微点阵的构建，杂交和分析

从上述毗连序列群中，选出85个包括部分重叠和非重叠的编码vatA序列的重组质粒。

一个与所有副猪嗜血杆菌16SrRNA的同源性达到98%的16SrRNA片段被用于阳性对照，该片段对应于细菌单克隆基因的60DNA片段。

（核糖体蛋白质，DNA和RNA聚合酶，代谢酶等）。

选择一个750bp的多聚核苷酸编码的哺乳动物的朊蛋白作为阴性对照。

该克隆片段使用通用型M13引物，经PCR扩增后，纯化，一式三份，进行UltraGAPS幻灯观测。

使用一个改进程序，对一至二微克的基因组DNA进行随机标注（BioprimeDNAlabelingsystem;Invitrogen）.来自Nagasaki菌株的DNA用dCTP-Cy3进行标记，用于杂交对照；而对来自其它菌株的DNA，包括Nagasak菌株，标记为dCTP-Cy5。

然后，将来自对照株（Nagasaki）以及一株试验株的同等数量的基因组DNA共同置于幻灯片下，以ArrayBoostAB410对其进行杂交操作。

经过洗涤，然后用4000芯片的微点阵扫描仪（PerkinElmer）对这些幻灯片进行扫描,之后，用QuantArray（GSILumonics）对其荧光强度进行分析。

消除背景干扰后，用从16SrRNA基因片段获得的信号对条带强度进行标准化。

若上述克隆片段信号强度是阴性对照组（朊粒）的三倍，则视为阳性。

计算每一样本的比率（Cy5试验株/Cy3对照株或Cy5对照株/Cy3对照株）和其平均值。

比值低于0.3或在0.3到0.8之间表示试验株高变异，或者是对应DNA片段缺失，抑或对应DNA片段中度变化；若比值高于1.5表示试验株基因组扩增一倍。

据此，可以根据比率在0.8—1.5之间确定菌株之间的一致性，并使用下列公式对基因差异进行评估：

（ΣFI单拷贝基因片段/单拷贝基因片段数）/（ΣFIvtaA结构域/结构域片段数）。

转位分子YadA区域的DNA扩增

采用15纳克基因组DNA和20皮摩尔正向和反向引物进行PCR.（见图。

SIB的补充材料），扩增循环为:

94℃,反应3分钟，然后，94℃，45秒，20个循环进行变性，68℃，45秒进行退火，72℃，1分45秒延伸。

经2%琼脂糖凝胶电泳和荧光金染色后对结果进行分析。

vtaA基因的DNA扩增

扩增使用的是Invitrogen公司的TaqDNA聚合酶，150纳克基因组DNA，40皮摩尔前引物，20皮摩尔对应的反向引物（见图S1A和B的补充材料），94℃，2分钟变性，94℃，30秒，30个循环，60℃，30秒退火，68℃，15分钟延伸。

所有扩增产物经68℃，15分钟进一步延伸后，37℃孵育过夜。

PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳和荧光金染色后进行结果分析。

vtaA基因的克隆

长PCR产物经NucleospinExtractⅡ（MachereyMagel）凝胶提纯，然后克隆到pCP-BluntⅡ-TOPO或pCR-XL-TOPO克隆载体上。

在转化进入大肠杆菌后，阳性重组质粒与特定引物相结合，该引物在基因组中每400到500bp出现一次。

序列分析，序列种系，序列预测

使用ClustalW将核苷酸和氨基酸进行排列，使用localBLAST比较其基模，重复序列和结构域，使用SingleP和PSORTb探测信号肽，使用SWISS-MODEL建立结构同源模型，使用SNAP和DataMonkeyWeb服务商分析选择压力，使用BioEdit检测Pasteurellaceae所携带的信号序列。

所有的系统分析都由结构上紧密相连的引导共有序列系谱组成。

使用MEGA4.0获得最大简约性和最小值的演化（最大合成的可能性距离）。

最后，使用RDP,GENECONV,Chimaera,MaxChi，BootScan,SiScan和3Seq等包含在RDP2工具包里的运算规则探测重组序列。

序列接受号

本篇报道的序列已经在GenBank数据库上注册，序列接受号为EU678322到ER678351。

结果和讨论

副猪嗜血杆菌的三聚自转运蛋白的结构特征和鉴定

副猪嗜血杆菌Nagasake菌株是高毒力血清型的参照株，用该菌株已经在几个实验室成功地复制出副猪嗜血杆菌病。

由于这些原因，该株被选用来测序。

据估计，在脉冲场凝胶电泳中，副猪嗜血杆菌（Nagasake）的基因组长度大约为2.4Mbp。

这些基因的99%以盒式策略排列，33，935个读本被组装成240个重叠群。

经过注释，硅片翻译基因中的13个基因有显著同源性，属于自转运蛋白，粘附素和红血球凝集素等功能家族的细菌蛋白质，这些蛋白质现在被称为三聚自转运蛋白或AT-2家族。

通过和Pfam数据库相比较，我们可以确定这些蛋白质的结构。

所有这些都是由多重Hep-Hap重复序列（序列接受号PF05658），HIM模体（PF05662）,和一个C-端YadA转运域（PF03895）组成。

这些重复序列，模体和转运域都是许多致病菌的粘附素和红血球凝集素的特征。

在13种蛋白质的中心部分，都有数量不同（从2到18）的胶原三螺旋重复序列（PF01391）。

这些序列插在HIM模体之间（图1）。

根据这些结果，可以很明显地看出，上述基因和基因产物形成了一个基因家族，我们分别称之为vtaA或VtaA，单个基因被称为vtaA1到vtaA13。

这种多基因家族并不集中，而是散布于整个基因组，因为没有一个重叠群包括一个以上的vtaA基因（数据未显示）。

所有基因（见图S1补充材料）的5’-端的多重序列显示，其开始的207个核苷酸具有高度保守性，表明该区域有一个常规功能，但没有发现信号肽表现出生物信息功能。

然而，一个结构上融合了497bp的基因融合片段，包括vtaA4上游起始密码子在内的116个核苷酸，接着是378bp的编码核苷酸和无启动子和增强子的phoA，表明存在一个活跃的启动子和一个密码改变了的信号肽。

事实上，在质粒改造之后，碱性磷酸酶活性恢复，说明在大肠杆菌DH5α的周质空间存在融合蛋白。

而且，对第一个vtaA氨基酸进一步分析显示，许多β和γ蛋白菌的自转运蛋白保守序列拥有一个扩增的信号肽。

事实上，模体MNKIF/Y是完全保守的，vtaA的前72个氨基酸包括交替出现的小的亲水区和较大的憎水区。

图1.来源于Pfam数据库，由硅读码器解读的vtaA基因的蛋白质构架。

这儿仅列出13株Nagasaki菌株的同源分子，它们显示出相同的基本结构。

三组中的每一部分都以YadA转运蛋白区的一系列同形体为基础。

染色相同的区域，重复序列和模体完全相同，它们沿着各自的VtaA结构域的分布与染色体内重组相一致。

对在H型流感病毒（ACCGCTT）和A型肺炎病毒（ACAAGCGGT）的鉴定由箭头表示。

它们的序列码从不以重复序列或模体的形式，而是以连接区的形式出现。

这种序列对细菌的自然转化和为细菌提供横向基因转移是必须的。

根据对YadA结构域（图S1B）的序列比较，三聚自转运蛋白基因以及它们的蛋白质产物可以分成三组。

目前，在功能上，尚不清楚这些氨基酸的变化是如何影响C-端区域的。

使用Hia晶体结构作为最佳匹配模板，用SWISS-MODEL对上述结构进行模型构建。

所有VtaA蛋白质都有非常相似的结构，倾向于在C-端形成4个β链（见图S2补充材料），这一发现已经在耶尔森氏菌，莫拉菌和流感嗜血杆菌上得以证实。

因此，所有YadA的三个C端区域很可能具有外膜蛋白锚定功能，带有自转运蛋白特征性的β-桶结构，该自转运蛋白履行AT-2蛋白家族所有必需功能。

当使用保守的5’-端和3’-端进行系统地重建时，对5’-端和3’-端进行比较，发现了完全不同的拓扑结构构（图2）。

使用可信的辅助程序，同YadA结构域相比，引导值进一步证实3’-端存在三个不同区域，而对5’-端的研究证实，尽管基因长度非常短，却不存在上述区域。

这一点表明，基因的两端涉及下列不同模式。

另外，部分重组事实的存在，如果不是全部存在的话，表明，结构域的存在不能排除。

图2本研究中，所有vtaA基因的5’延伸信号肽（与用于基因扩增的引物相比，缺少钱27个核苷酸）和YadA3’端（与扩増引物相比缺少终末核苷酸）均被测序。

通过使用1000引导程序，相邻连接和最大简约性以及最小值的演化（最大合成的可能性距离）构建引导共有序列系谱。

这儿仅显示相邻系谱，尽管针对所使用的系谱，引导程序值显示超过50。

由于vtaA19和vtaA29序列区域以及针对每一个基因5’端扩增引物的缺失，使用5’端的系统重组不能使用vtaA19和vtaA29序列。

这种5’端观测到的分型不同于3’端，表明每一个基因的结构有不同的演化速率。

3’端引导程序值证实存在三组转运域亚单位。

耶尔森氏菌YadA成熟蛋白的功能映射表明：

第21到81个氨基酸和83到103个氨基酸分别与嗜中性白血球和胶原三聚螺旋相结合。

这些氨基酸的位置同YadA蛋白的第一个Hep-Hap和HIM重复序列相对应。

在副猪嗜血杆菌中，Hep-Hap和HIM可变重复序列位于所有YadA蛋白质的N-端，表明这些序列具有相似的功能。

在第二和第三组，其它的Hep-Hap重复序列位于两个来自C-端YadA区域上游的HIM重复序列。

（图1）Hep-Hap重复序列和HIM模体的序列易变性相当高（同一性从20-100%），同一位置上，在同源序列间不存在严格意义上的相同（图1），表明在vtaA基因上基因内重组的几率较小。

然而，和同源的第二和第三组相比，第一组结构域的N-端区域（从信号肽的结尾到位于第一个胶原重复序列前的最后一个HIM模体）的重组几率似乎更高一点，这一点可以从对前述（见表S1补充材料）N-端区域的一一对应的比较中得到证实。

在Pfam数据库中描述的含胶原三聚螺旋重复序列的376个细菌蛋白质中，仅有两个同YadA的C-端区域相关，它们（GenBank登陆号：

YP719837和YP718689）属于Pasteurellaceae,Haemophilussomnus家族的成员，人们已经对其基因进行了测序。

这些产生胶原重复序列的细菌表面蛋白的功能已经完全阐述清楚。

证据表明，这些蛋白质与人肺成纤维细胞粘附素相关，它们通过α2β1整合素诱导细胞内信号发生和传导。

因此，对H.Somnus和副猪嗜血杆菌而言，AT-2分子胶原域是一个比较特殊的成分且赋予它们一些特定的生物学功能。

而且，尽管H.Somnus129Pt被认为是非致病株，该菌株定植于生殖器粘膜表面，其基因组中已发现的10个AT-2基因中，仍有两个显示出胶原重复序列。

因此，在VtaA蛋白中的胶原重复序列再次表明：

这种蛋白质家族与粘附素有关。

这些在Hep-Hag和HIM重复序列和模体（该模体是潜在的胶原结合重复序列）之间的多重胶原重复序列的插入，对多基因家族的结构和功能提出了几个疑点。

至于Hep-Hag或HIM重复序列，胶原重复序列在VtaA蛋白质之间及其内部表现出高度变异。

如果某些副猪嗜血杆菌株，包括Nagasaki株，能够从多系统中分离，同时，在其它细菌也含有AT-2的毒力，我们就可以推测，VtaA蛋白质对这种细菌的粘附/侵袭能力起作用。

为阐述这一问题，我们在基因水平上对一组侵袭性和非侵袭性菌株进行了比较。

（表1和2）。

表1.用于AT-2基因比较的副猪嗜血杆菌株

Strainidentification

Siteofisolation

Pathology

Glässer

Serovar

Sourceorreference

Nagasaki

Brain

Septicemia

Referencestrain（33）

SW114

Nose

Withoutlesions

NDa

Referencestrain（33）

Nose

Withoutclinicalsigns

NTb

VeterinarySchool,AutonomousUniversityofBarcelona

D74

Withoutlesions

Referencestrain（25）

HP-3123

Nose

EnteritisbyEscherichiacoli

−

HIPRAS.A.Laboratories

HP-1205

Pericardium

Pericarditisandpleuritis

HIPRAS.A.Laboratories

HP-1302

Brain

Polyserositis

HIPRAS.A.Laboratories

HP-1319

Brain

Polyserositis

HIPRAS.A.Laboratories

HP-2163

Joint

Pneumoniaandarthritis

HIPRAS.A.Laboratories

HP-2269

Joint

Pneumoniaandarthritis

HIPRAS.A.Laboratories

HP-33

Lung

Pneumonia

HIPRAS.A.Laboratories

aND,notdocumented.

bNT,nottypeable;+,positive;−,negative.

表2.下表是副猪嗜血杆菌每一NagasakiAT-2组中的一个代表株相对基因微点阵的数值。

Groupandgenesize

Positioncovereda

Domaincoveredb

RelativeFIratiosc

Noninvasivetestedstrains

Invasivetestedstrains

SW114

D74

HP-3123

HP-1205

HP-1302

HP-1319

HP-2163

HP-2269

HP-33

Nagasaki

Group1,vtaA9（2,859bp）

26to713

SP+Hep_Hag1to5

0.07

0.06

0.07

0.03

0.70

0.50

0.45

0.70

0.18

0.65

415to996

Hep_Hag2to7

0.10

0.09

0.06

0.05

0.70

0.60

0.40

0.86

0.17

0.57

0.95

1567to2097

Col1to3

0.08

0.11

0.07

0.04

1.10

0.77

0.58

1.35

0.42

1.15

1901to2568

Col2to3+HIM2to3

0.16

0.10

0.12

0.05

0.83

0.55

1.25

0.42

1.14

2437to2773

HIM3+YadA

0.24

0.28

0.19

0.17

1.20

1.10

0.75

1.22

0.77

1.22

0.96

Group2,vtaA11（4,500bp）

143to506

SP+Hep_Hag1to3

0.13

0.12

0.11

0.38

0.12

0.14

0.25

0.99

713to1435

Hep_Hag5to9+HIM1

0.13

0.16

0.10

0.02

0.70

0.42

0.70

0.32

0.65

1.03

901to1617

Hep_Hag7to9+HIM1

0.20

0.26

0.23

0.13

0.70

0.80

0.45

0.70

0.56

0.70

1.06

2100to2532

Col1to2

0.23

0.42

0.30

0.20

0.60

0.40

0.30

0.35

0.50

0.61

1.07

2586to3301

Col3to4

0.24

0.20

0.14

0.80

0.70

1.00

0.75

0.88

1.07

2819to3570

Col4+HIM3

0.25

0.19

0.16

0.24

0.90

1.00

0.80

0.95

0.90

0.83

0.88

4125to4500

HIM4+YadA

0.41

0.65

0.27

0.33

1.10

1.40

0.90

1.00

1.20

1.00

0.97

Group3,vtaA12（5,043bp）

1to585

SP+Hep_Hag1to3

0.30

0.42

0.37

0.29

0.90

0.75

0.65

0.60

1.26

0.90

1.02

1484to1873

Col1to2

0.19

0.20

0.14

0.15

1.80

1.90

0.50

1.60

1.70

1.03

1949to2400

Col3to5

0.07

0.05

1.80

2.10

0.55

1.85

1.04

2483to3091

Col6to9

0.12

0.09

0.06

2.25

1.70

0.55

0.54

2.35

1.20

2654to2991

Col

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