基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用.docx

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基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用

基因工程及其在大肠杆菌生产人干扰素中的应用

一、课程设计目的

了解工业生产中的新型育种技术并比较不同育种技术的优势；

学习理解基因工程育种技术及其操作原理；

研究基因工程育种技术在人干扰素生产中的创新。

二、课程设计题目描述与要求

本文介绍一种二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术——基因工程，介绍其在育种中的应用。

文中重点介绍了基因工程育种的一般步骤，以及近年来出现的运用基因工程进行定向育种的主要新技术：

基因的定点突变，易错PCR，DAN重排及基因组重排。

之后，应用基因工程育种技术重组大肠杆菌BL21（pBAI）生产人干扰素a2b,通过优化补料分批培养时葡萄糖的流加策略,提高了hIFNa2b的表达量和表达速率。

不同的葡萄糖流加方式有各自的优点,采用恒速流加葡萄糖的方式,hIFNa2b的表达量达到6540mg/L,高于目前已知文献中hIFNa2b的最高表达量5200mg/L。

三、课程设计报告内容

引言

基因工程是二十世纪七十年代发展起来的一种新型生物技术，其发展从根本上改变了生物技术的研究和开发应用模式。

1972年美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40DNA、λ噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。

翌年，美国斯坦佛大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素连个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，该重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞相应的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的诞生。

在二十世纪八十年代以来，随着大批大批成果的出现及应用，基因工程带来了一场新的革命。

利用这些技术，可以直接地、有针对性地在DNA分子水平上改造生物的遗传性状。

通过转入外源基因，微生物和动、植物细胞可以产生出自身原来没有的蛋白质。

同样，利用重组DNA技术，也可以使一些原来存在量极低但有重要工业或医学用途的小分子（抗生素）或蛋白质之外的大分子物质得以大量生产。

特别是随着重组DNA技术的完善和发展，以基因水平为核心的现代分子定向育种技术越来越受到工业微生物育种学家的关注，并展示了良好的应用前景。

1、基因工程育种

基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达引，与前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。

基因工程技术的全部过程一般包括目的基因DNA片段的取得、DNA片段与基因载体的体外连接、外源基因转入宿主细胞和目标基因的表达等主

要环节。

1.1基因工程育种的一般步骤是：

（1）目的基因的获得：

一般通过化学合成法、物理化学法（包括密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法）、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法（逆转录法）、Norther杂交分析法、cDNA文库筛选法、杂交筛选法、编码序列富集（磁珠捕获）、产物导向法、Nod连接片段筛选法、外显子捕获法及外显子扩增法、剪接位点筛选法、作图克隆法、杂交细胞克隆法、消减杂交法、相同序列克隆法、差异显示逆转录PCR法、显微克隆与微克隆法和插入诱变法等方法获得目的基因。

（2）载体的选择：

基因工程载体主要是质粒和病毒，载体一般为环状DNA，其要求有自我复制能力、分子小、拷贝数多、易连接和易筛选等特点。

（3）重组子体外构建：

主要方法有粘性末端连接法、平端连接法、人工接头连接法和同聚物加尾连接法。

（4）重组载体导入受体细胞：

其主要途径有转化、转导、显微注射、电穿孔法、快速冷冻法和炭化纤维介导法等。

（5）重组体筛选和鉴定：

以合适的筛选方法选择具有最佳性能的突变重组子，重组体筛选和鉴定主要通过表型法、DNA鉴定筛选法，选择性载体筛选法、分子杂交选择法、免疫学方法和mRNA翻译检测法等方法来实现。

1.2运用基因工程进行定向育种的新技术

1．2.1基因的定点突变

定点突变（site—specificmutagenesis或site—directedmutagenesis）是指在目的DNA片断（例如：

一个基因）的指定位点引入特定的碱基对的技术，其包括寡核苷酸介导的定点突变、盒式诱变以及以PCR为基础的定点突变。

近十年来，定点突变技术获得了长足的发展，并且在此基础上又发展了很多新技术。

例如：

重叠延伸PCR法（OverlapExtensionPCR简称EO—PCR）、大引物PCR法（MegaprimerPCR）、一步重叠延伸PCR（One—stepOverlapExtensionPCR，简称OOE．PCR）、单管大引物PCR（Single—tubeMegaprimerPCR）、快速定点诱变法、多位点环状诱变法TAMS（TargetedAmplificationofMutantStrand）定点诱变技术。

在这些技术中，单管大引物PCRTAMS定点诱变技术最为简单和适用，并得到广泛的应用。

单管大引物PCRPicard等和HKe等分别建立了单管大引物PCR法。

该法省去了传统上以PCR为基础的定点突变中第1轮PCR产物的纯化过程，实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应的定点突变目标。

在上述2组研究者建立的方法中，后者提出的方案更加巧妙、简单（图1）。

其只需设计Tm值不同的2个侧引物，在第1轮PCR反应中用Tm值低的侧引物（F1）和诱变引物，在较低的退火温度下进行扩增反应，产生大引物；然后再加入Tm值高的侧引物（F2），在较高的退火温度下进行第2轮反应，扩增出含突变位点的整个DNA产物。

Ke等在此方法中还提出了2条更为细致、有效的改进措施，使PCR产物的最终产量和纯度均有所提高。

这2条改进措施为：

（1）在第1轮PCR反应中，诱变引物的浓度仅为侧引物的1％，以减少诱变引物在第2轮PCR中的干扰作用；

（2）在第l轮PCR反应后，亦即第2轮PCR反应前，增加5个循环的不对称扩增，这有利于提高其后的扩增效率。

这种单管大引物法的优点是：

实现了在同一管中先后进行2轮PCR反应，大幅简化了操作步骤，并且省时、省力。

在对多个样品进行操作时，该方法的优点更为突出。

在以PCR为基础的诱变方法中，该法是引入单位点突变最简单、最经济的方法。

图1单管大引物PCR过程

Figure1TheprocessofSingle·tubemegaprimerPCR

TAMS定点诱变技术2003年，Young等报道了一种有目的地扩增突变链的定点诱变技术（Targetedamplificationofmutantstrand，TAMS）。

该技术能够一次引入多个位点的突变，并且能够有目的地扩增突变链，从而使突变效率几乎达到100％。

该方法主要分3步（图2）：

（1）线性单链DNA模板的制备：

通过线性PCR制备单链DNA模板；

（2）突变链的合成：

该步骤需用2个锚锭引物（即Anchor5和Anchor3）和多个诱变引物（Mut1和Mut2）。

（3）有目的地扩增突变链：

设计扩增引物（PCR5和PCR3），使其3′端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增引物只能退火到突变链而不是亲本链。

在多位点的突变试验中，TAMS诱变技术应该是首选方法。

定点突变技术已在蛋白质的结构和功能改造上取得了很大成功。

例如，利用定点突变改变酪氨酰-tRNA合成酶的活性中心，从而使酶活力提高了50倍；此外，在T4溶菌酶中加入二硫键，显著提高了该酶的稳定性。

图2TAMS定点诱变技术原理和操作过程

Figure2TheprincipleandoperationprocessofTAMS

1．2.2易错PCR

DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能方法。

利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术就称为易错PCR（Error_pronePCR，简称EP—PCR）。

此方法的原理与操作如图3，其操作过程是在TaqDNA聚合酶催化的PCR反应体系中，利用Mn替代天然的辅助因子Mg，使TaqDNA聚合酶缺乏校对活性，同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡，因此导致碱基的错配率大大增加，通常约为0.1％。

另外，还可以在该反应体系中加入dITP等三磷酸脱氧核苷类似物来控制错配水平。

这种方法可以将错配率最大提高至20％。

孔荣等利用易错PCR使D-海因酶对底物的水解活性提高了2.4倍；黄瑛等用易错PCR使短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶活性提高了1.31倍，Km值由8.24mmol/L降低至7.717mmol/L，在pH>8.0时的稳定性也较野生型脂肪酶有所提高。

图3易错PCR示意图

Figure3Sketchoferror-pronePCR

1．2.3DAN重排

DNA重排（DNAshufling）技术是一种利用重组文库的体外定向进化技术，Stemmer于1993年首先提出。

DNA重排的基本原理是首先将同源基因（单一基因的突变体或基因家族）切成随机大小的DAN片段，然后进行PCR重聚。

那些带有同源性和核苷酸序列差异的随机DAN片段在每一轮循环中互为引物和模板，经过多次PCR循环后能迅速产生大量的重组DNA，从而创造出新基因。

其操作的原理和步骤如图4。

图4DNA重排的原理及操作步骤

Figure4TheprincipleandoperationprocessofDNAshuffling

Zhao等在此基础上发明了一种更加简化交叉延伸程序（STEP）（图5）。

此技术是在一个PCR反应体系中以2个以上相关的DNA片段为模板进行PCR反应。

引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性、短暂复性（延伸）过程。

在每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地与含不同突变的模板进行杂交，使延伸继续，并由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复进行直到获得全长基因片段，重组的程度可以通过调整时间和温度来控制。

此方法省去了将DNA酶切成片段这一步，致使DNA重排方法进一步简化。

图5交叉延伸程序的基本过程

Figure5Basicprocedureofstaggeredextensionprocess

近几年来，提高DNA重排技术捕获变异的能力一直是研究人员努力的方向。

Ostermie等以核酸外切酶Ⅱ代替DNaseI对靶序列进行消化，发明了递减法建立杂交酶技术（ITCHY），使得非同源性序列间也能发生重排，扩大了该技术的用途。

Hiraga等开发的SISDC技术在组件内部引入了限制性内切酶识别标记，用相应的限制性内切酶代替DNaseI产生重排片段。

Bergquist等开发的DOGS技术则是根据保守模体区序列特征设计简并引物，扩增出保守同源区后再用重排操作生成突变富集体。

由于此方法是在突变耐受的保守区直接增加转辙组的几率，所以其产生的突变频率大大增加。

DNA重排的最大特点是在反复突变过程中引进了重组这一自然进化中最重要的过程，而且其对可操作的靶序列的长度没有任何要求，可以达到几万kb。

通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高，同时还打破了传统物种之间由于生殖隔离导致不能重组的界限。

1．2.4基因组重排

基因组重排（genomeshufling）技术是受DNA重排的启发，于2l世纪出现的全基因组改组技术。

这种技术将分子定向进化的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。

首先，利用经典的诱变育种技术获得含有目标性状的基因组库，然后利用原生质体融合技术将这些发生正向突变的菌株的全基因组进行多轮随机重组，从而快速筛选表型得到较大改进的杂交菌种。

该技术巧妙地采用了多轮循环原生质体融合技术，将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生），即递归原生质体融合（recursiveprotoplastfusion）的方法。

Zhang等于2002年首次报道应用基因组重排方法快速地使弗氏链霉菌（Streptomycesfradiae）产生泰乐菌素的能力得到提高。

该方法以营养缺陷型为出发菌株，仅用了1年时间，通过两轮基因组改组就从24000株菌株中分离到2组共14株泰乐菌素高产菌株，其泰乐菌素产量高于通过经典诱变育种方法所筛得的生产菌株SF21，而后者（SF21）是用经典诱变育种方法在长达20年的时间中先后筛选过约1000000个菌株后才获得的。

由此可见，此技术大大减少了工作量，并缩短了筛选时间。

四川抗菌素工业研究所的徐波等以产量性状为标记特征，应用基因组重排的方法在一年之内使替考拉宁产量提高了65.3％。

除上述技术外，近年来又出现了一些新技术，例如：

部分基因片段改组、单链DNA家族改组（SSDNAs）、简并引物基因改组（DOGS）、瞬时模板的随机嵌合、单向引物的随机重组、自我复制、体外随机引发重组（RPR）、酶法体外随机-定位诱变（random—site—directedmutagenesis）、交错延伸剪接PCR等。

2、基因工程育种技术在大肠杆菌种的应用

大肠杆菌是迄今为止研究的最为详尽的原核细菌，其K-12MG1655株的4000多kb的染色体DNA已测序完毕，全基因共含有4405个开放阅读框，其中大部分基因的生物功能已被鉴定。

作为一种成熟的基因克隆表达受体，大肠杆菌被广泛用于分子生物学研究的各个领域，如基因的分离扩增、DNA序列分析、基因的表达产物功能鉴定等。

由于大肠杆菌繁殖迅速，培养代谢易于控制，大肠杆菌的分子遗传学背景已相当明了，不断完善的基因操作技术可将大肠杆菌构建成为用于异源蛋白生产的分子工厂。

因此，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌，以规模化生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。

现在已有100多种异源蛋白通过大肠杆菌基因工程菌实现了产业化，其中包括一些结构相当复杂的人体蛋白，如HAS、pro-UK、MT、M-CSF及Hb等。

工业中常用于生产医药蛋白如人胰岛素、人生长激素、人干扰素、人白细胞介素和抗体。

以下以生产人干扰素为例介绍其应用。

人干扰素a2b（HumanInterferona2b,hIFNa2b）是由165个氨基酸组成的多肽,具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、修复DNA结构损伤等作用。

hIFNa2b在临床上广泛应用,对肝炎、呼吸道病毒感染、疱疹病毒感染等均具有治疗作用。

大肠杆菌表达系统具有生长快速、发酵成本低、表达水平高等优点,是生产外源蛋白的理想表达体系。

在大肠杆菌温度诱导表达外源蛋白的发酵过程中,如何控制升温诱导后菌体的生长,提高产物的比生产速率,是实现高密度高表达的关键。

本文采用大肠杆菌BL21（pBAI）表达hIFNa2b,其表达通过温控型PL启动子调控。

考察了补料方式对hIFNa2b生产速率的影响,hIFNa2b表达水平达到6540mg/L。

2.1材料与方法

2.1.1　材料

菌株　宿主菌E.coliBL21（DE3）[BF-dcmompThsdS（r-Bm-B）galλ（DE3）],重组质粒为pBAI,带有氨苄青霉素耐药性标记,hIFNa2b基因表达受λPL启动子和质粒cI857编码的蛋白调控。

培养基　种子培养基为LB培养基（蛋白胨10g/L,酵母抽提物5g/L,NaCl10g/L）,灭菌后加入100mg/L氨苄青霉素钠。

分批发酵培养基为含葡萄糖5g/L的LB培养基。

未特别注明的补料分批发酵培养基均为含葡萄糖5g/L的2×LB培养基（蛋白胨20g/L,酵母抽提物10g/L,NaCl10g/L）,补料液为400g/L的葡萄糖。

培养基配制所用蛋白胨和酵母抽提物均为Oxoid产品,其余试剂为国产分析纯,采用去离子水配制。

2.1.2　培养方法

种子培养　从-20°C保藏的甘油管中取出1ml菌液,接入装有30ml种子培养基的250mL锥形瓶,于摇床200r/min,30°C下培养10h,为一级种子;将一级种子以1.5%的接种量转接至装有70mlLB培养基的500ml锥形瓶中,相同条件培养9h,为二级种子。

发酵罐培养　将二级种子以6%的接种量接入5L发酵罐（RIBE-5型）中。

培养液装量为2.5L，生长阶段控制温度30°C,表达阶段控制温度42°C，发酵过程中控制pH为7.0,通气量4L/min，初始搅拌转速为400r/min,发酵过程中转速逐渐提高以维持溶氧大于20%。

补料分批培养过程中,初始葡萄糖耗尽后采用3种不同的葡萄糖流加方式，即恒pH流加、恒速流加、恒比供应速率流加。

恒pH方式为当pH超过7.0时自动补入葡萄糖；恒速流加以5.4g/（L·h）的速率流加葡萄糖；恒比供应速率（QG）为0.27g/（g·h），每小时根据菌体浓度调整葡萄糖的流加速率。

2.1.3　测定方法

菌体浓度测定采用浊度法,测定波长600nm处的光密度（OD600）,根据标准曲线计算菌体干重。

葡萄糖测定采用葡萄糖测定试剂盒（上海科欣生物技术研究所）测定。

乙酸测定采用气相色谱法[5]。

hIFNa2b的电泳测定采用三（羟甲基）甲基甘氨酸（φ=0.15）-SDS-聚丙烯酰胺三层胶系统分离目的蛋白[6],凝胶用考马斯亮蓝染色,用图像分析系统（SmartViewanalysisprogram,上海复日科技有限公司）定量。

取发酵液于12000r/min,4°C下离心10min,得到的菌体用Tris-HCl缓冲液（50mmol/L,pH7.0,4°C）洗涤,然后溶于上样缓冲液中[12mmol/L、pH6.8Tris-HCl,甘油（φ=0.05）,SDS（7.5g/L）,巯基乙醇（φ=0.02）,溴酚兰（0.5g/L]。

2.2　结果与讨论

2.2.1　分批发酵

在5L罐中分批培养,结果见图6和表1。

培养2.5h升温诱导,此时菌体处于对数生长期,升温对于菌体生长的影响并不显著,表达初期菌体比生长速率较升温前略有下降。

分批发酵中葡萄糖耗完时,乙酸积累达到最大值1.1g/L。

hIFNa2b的表达水平达到749mg/L,是相同培养基条件下摇瓶培养的2.9倍。

诱导后1h,hIFNa2b比生产速率为162mg/（g·h）,生产速率为275mg/（L·h）；诱导后期比生产速率下降至95mg/（g·h）,但由于菌体浓度增大,生产速率达到363mg/（L·h）。

图6　分批培养时菌体（◆）、葡萄糖（■）、乙酸（●）及hIFNa2b（▲）的变化曲线

Fig.6　Profilesofdrycellweight（◆）,residualglucose（■）,aceticacid（●）andhIFNa2b（▲）inbatchcultivation

2.2.2葡萄糖流加对于hIFNa2b生产水平的影响

要获得hIFNa2b的高体积表达水平,则需维持较高的比生产速率,并且增大菌体密度,流加葡萄糖是一种很好的选择。

恒pH流加葡萄糖　培养4h后升温诱导表达hIFNa2b,此时残糖浓度为0.9g/L。

6h时初始葡萄糖耗尽,溶氧迅速回升,开始用恒pH法补加葡萄糖,即pH高于设定值时蠕动泵自动加入葡萄糖溶液1s。

此补料分批发酵实验记为FB1,结果见图7和表1。

升温诱导后,菌体生长明显减慢,升温后2h菌体的比生长速率为0.425h-1,与升温前的0.710h-1相差很大,这与诱导时环境和细胞生理状态有关。

与分批发酵相比较,升温诱导时（2.5h）菌体处于对数生长前期,培养基中营养物质充分,而本实验中于4h升温诱导时菌体处于对数生长后期,培养基中的营养物质已经被大量消耗,难以维持对数期的比生长速率。

进入恒pH补料阶段后,菌体比生长速率下降的趋势进一步明显,发酵末期菌体比生长速率仅为0.025h-1。

图7　恒pH补料分批培养（FB1）中菌体（◆）、葡萄糖（■）、乙酸（●）及hIFNa2b（▲）的变化曲线

Fig.7　Profilesofdrycellweight（◆）,residualglucose（■）,aceticacid（●）andhIFNa2b（▲）inpH-statfed-batchcultivation（FB1）

hIFNa2b表达量在11.5h达到2400mg/L,是分批发酵的3.2倍。

诱导初期的2h内,hIFNa2b比生产速率为148mg/（g·h）,生产速率高达730mg/（L·h）。

后期hIFNa2b表达速率明显减慢,发酵末期仅为10mg/（g·h）。

在恒pH补料分批培养中,能较好地控制葡萄糖的流加,使得发酵后期没有乙酸积累。

但是恒pH流加方式下的葡萄糖流加是基于有机氮源的异化代谢引起pH上升,随着培养基的氮源如氨基酸的逐渐消耗,减少了氨离子的产生,从而不易引起发酵液pH上升,导致葡萄糖补加速率的降低,使得培养过程中特别是发酵后期葡萄糖的供应不足。

如图8所示,培养过程中葡萄糖流加速率rG从2.83g/h下降到1.99g/h,葡萄糖比消耗速率QG从0.115g/（g·h）下降到0.087g/（g·h）,限制了hIFNa2b的表达。

与分批培养相比,虽然hIFNa2b的比生产速率有所下降,但总产量和菌体hIFNa2b含量大幅提高,说明菌体浓度升高有利于提高hIFNa2b表达水平,恒pH流加是一种操作方便的流加方式。

图8　恒pH补料分批培养（FB1）中葡萄糖浓度（■）、葡萄糖流加速率（◆）及葡萄糖比消耗速率（▲）的变化曲线

Fig.8　Profilesofresidualglucose（■）,feedingrateofglu-cose（◆）andspecificconsumptionrateofglucose（▲）inpH-statfed-batchcultivation（FB1）

恒速补料实验中hIFNa2b平均生产速率是恒pH补料时的1.65倍,表明葡萄糖供应的改善提高了hIFNa2b的表达水平,尽管葡萄糖的比消耗速率还是从诱导初期的0.28g/（g·h）下降到0.21g/（g·h）。

因为期望达到较高的菌体密度,所以生长期较长。

诱导前培养基中营养物质消耗较多,8.5h时菌体的比生长速率已经降低到0.203h-1,升温诱导后1h,比生长速率更降低至0.074h-1,营养消耗导致hIFNa2b的比生产速率仅27mg/（g·h）,大大低于恒pH补料分批培养实验FB1。

通过恒速补糖方式取得了hIFNa2b非常高的表达量,但这是通过延长发酵时间和提高菌体浓度实现的,过低的比生产速率大大影响发酵生产效率。

2.3　诱导前添加有机氮源对hIFNa2b生产水平的影响

许多基因工程菌外源基因的表达显示出与生长速率相关的特性,而补料分批培养中,随着菌体浓度的提高,诱导初期的比生长速率明显下降,反映了营养的限制。

因此在诱导前1.5h补充有机氮源（酵母提取物25g）,以满足菌体生长和产物合成的需要。

初始葡萄糖耗完后,采用恒比供应速率（0.27g/（g·h））的方式补充葡萄糖,发酵过程记为FB3,结果见图9和表1。

图9　补料分批培养FB3中菌体（◆）、葡萄糖（■）、乙酸（●）及hIFNa2b（▲）的变化曲线

Fig.9　Profilesofdrycellweight（◆）,residualglucose（■）,aceticacid（●）andhIFNa2b（▲）infed-batchcultivationFB3（yeastextractwasaddedat