液相色谱思考题.docx
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液相色谱思考题
第一章
1.名词解释
基线:
在正常操作条件下，仅由流动相通过检测器系统时所产生的连续的响应信号，一般是一条直线。
峰面积：
色谱曲线与基线间所包围的面积
半峰宽：
在1/2峰高处的峰宽度
标准偏差：
0.607倍峰高处对应峰宽值的一半
死时间：
流动相流过色谱柱所需时间（不保留组分流过色谱柱所需时间）不被固定相滞留的组分从进样到出现最大峰值时所经历的时间。
调整保留时间：
样品的保留时间减去死时间即为调整保留时间
相对保留值（分离因子）：
常用γ或α表示，两组分的调整保留值（调整保留时间或体积）之比即为相对保留值：
组分从进样到出现色谱峰的时间或体积值
容量因子（分配比）k’：
即分配比，指在一定温度与压力下两相达到平衡后，组分在固定相和流动相中质量的比值
分配系数k：
在一定温度与压力下两相达到平衡后，组分在固定相和流动相中浓度的比值
分离度：
两个相邻色谱峰的分离度R定义为两峰保留时间差与两峰峰底宽平均值之商
2.理论塔板数和有效理论塔板数的计算公式？
两者的区别？
答：
理论塔板数
有效理论塔板数
两者的区别：
由于在色谱柱中存在着死体积（在组分的保留时间中包括了死时间），因此，从分配平衡理论计算出来的理论塔板数n并不能完全反映柱效，利用扣除死体积（或扣除死时间）后的调整保留体积（时间）计算的有效理论塔板数neff能更真实地反映柱效。
3.速率理论方程（VanDeemter方程）
其中H,A,B,及u各表示什么意思？
答：
H—塔板高度；A—涡流扩散项；B—纵向分子扩散项；C—传质阻力项；u—流动相流动的线速度.
4.
，其中各字母的含义是什么？
答：
——填充的不规则因子
dp——固定相颗粒粒径
5.B=2rDm，其中Dm表示什么？
在GC还是HPLC中可以忽略B？
为什么？
答：
Dm表示组分在流动相中的扩散系数。
纵向扩散在GC中普遍存在，由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。
6.速率方程中，传质阻力项包括哪两类传质阻力？
答：
固定相传质阻力和流动相传质阻力
7.由速率方程推导得到最佳流速为多少？
答：
可以通过范蒂姆特方程求导获得
8.在UPLC中，为什么高流速仍能得到很高的柱效？
答：
根据VanDeemter方程
式中
dp——固定相颗粒粒径
因为UPLC中的填料颗粒的粒径很小，由公式传递可知H很小，所以即使在高流速下UPLC仍能得到很高的柱效。
9.高柱效是否就一定能实现高分离度？
为什么？
答：
不一定，由分离度方程
可知柱效即理论塔板数N只是分离度的一个决定因素，高柱效只说明理论塔板数N较大，而影响分离度的因素不仅有理论塔板数N，还有容量因子k´和分离因子а，它们三者同时决定分离度的大小。
所以高柱效不一定能实现高分离度。
10.何为柱外效应？
答：
柱外效应是指色谱柱之外的造成色谱峰展宽的成因,主要由进样装置、检测池及它们与柱之间的连接管路所产生。
包括柱前展宽、柱后展宽
11.
分离度方程R=?
答：
其中k´是容量因子，α是分离因子，N是理论塔板数
12.k´,α,N（或n）分别与哪些因素有关?
答：
k´与流动相组成（主要是溶剂比例等）、固定相的性质及柱温有关。
α随流动相组成（特别是有机溶剂种类和pH值等）、固定相的性质及柱温的变化而变。
N（或H）由板高方程各项参数决定，一般随色谱柱长、填料粒径、流速和温度等操作条件的变化而变。
第三章
1.HPLC与GC比较，其特点？
答：
分析对象及范围：
GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只占有机物总数的20%；HPLC可以分析较高沸点、较高分子量的、稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。
流动相的作用：
GC采用的流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，与组分之间基本没有作用；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的条件自由度较大。
它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过流动相组成来控制和改进分离。
操作温度：
GC需高温；HPLC常常在室温下进行。
HPLC主要分为哪几种类型？
答：
正相色谱、反相色谱、凝胶色谱、离子凝胶色谱、手性色谱、亲和色谱
按分离机理可以将HPLC分为五类：
分配色谱—基于被分离组分在两相中的分配系数不同（根据固定相和流动相相对极性的差别,又可分为正相色谱和反相色谱）；吸附色谱—基于被分离组分对活性的固定相表面吸附力的不同；离子交换色谱—利用不同离子与固定相上的相反电荷离子间作用力大小的不同进行分离；体积排阻色谱—利用固定相孔径的不同，把被分离的组分按分子大小分开的一种色谱分离方法；亲和色谱—依据生物分子与固定相上键合的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的物质进行分离
2.HPLC仪器由那几部分组成？
答：
高压输液系统、进样装置、色谱柱、检测器、数据处理系统
3.输液泵一般由两只泵头组成一台泵，两只泵头的连接方式有哪两种？
答：
串联和并联
4.什么叫梯度洗脱？
答：
流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k'，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。
5.梯度洗脱可高压混合或低压混合，两者的主要优缺点？
答：
高压混合的优缺点：
1）使用多台色谱泵，在泵后混合；2）配置灵活、简单，脱气简单；3）滞后体积较小
低压混合的优缺点：
1）用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合；2）对脱气要求高；3）滞后体积较大
6.流动相脱气的目的？
有哪几种脱气方式？
答：
脱去流动相中的气体，防止在流动相中产生气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线漂移，噪音增加。
脱气方式：
在线脱气、离线超声脱气、真空脱气、氦气脱气等。
7.普通检测器与二极管阵列检测器的区别？
各自优缺点？
答：
两者的区别：
普通检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。
而二极管阵列检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接收器上被检测
普通检测器的优点：
1）结构较简单、性能较稳定可靠；2）检测线性范围较宽；3）与梯度洗脱兼容,且是非破坏性的；4）相当大一部分有机物有一定程度的UV吸收灵敏度较高。
缺点：
1由于不是所有化合物都有UV吸收，因此不是通用检测器
2样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波长检测，或使用折衷的波长
3流动相组成对本底吸收和信噪比有影响
二极管阵列检测器优点：
1不仅可以获得色谱图还可以得到紫外光谱图
2可在色谱分离时，对每个色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图,并进行比较，可判别色谱峰的纯度及分离状况。
8.UVD,FLD,RID,ELSD这些检测器哪些是通用型的检测器？
哪些是选择性检测器？
哪些可与梯度洗脱兼容？
哪些不兼容？
答：
RID，ELSD是通用型检测器。
UVD,FLD,是选择性检测器
UVD,FLD,ELSD与梯度洗脱兼容
RID与梯度洗脱不兼容
注：
UVD—紫外检测器，FLD—荧光检测器，RID—示差折光检测器，ELSD—蒸发光散射检测器
9.LC-MS中的离子源常用的有哪两种？
答：
电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离源（APCI）
10.ESI主要通过高压电喷雾及离子蒸发而实现样品组分的离子化，APCI主要通过快速蒸发及分子离子化使样品组分离子化。
11.ESI和APCI生成离子方式不同，ESI是液相离子化，APCI是气相离子化。
对于后者，液流离开喷嘴时，因高温加热和雾化气（N2）的作用而使样品和溶剂迅速蒸发成气态。
12.ESI适用于极性化合物和生物大分子分析；APCI适用于弱极性、小分子化合物的分析。
13.通过LC-MS接口的极性切换，LC-MS可做哪两种电荷的离子检测模式？
质谱信号采集方式有哪两种模式？
答：
正离子和负离子
质谱信号采集方式：
选择离子模式（SIR）（主要为定量）和扫描模式（Scan）（定性）
14.LC-MS中质量分析器常用的种类有四极杆质量分析器及离子阱质量分析器？
15.电喷雾离子化过程可分为以下三步：
（1）形成带电小液滴
（2）溶剂蒸发和小液滴碎裂
（3）最终形成气相离子
16.大气压化学电离可分为以下两步：
（1）快速蒸发
（2）分子离子化（电晕放电）
17.简述正相色谱和反向色谱的特点（包括：
固定相和流动相的相对极性，不同极性化合物的出峰顺序，流动相极性大小与洗脱强度的关系）。
答：
正相色谱：
1固定相极性较强，流动相极性较弱；
2样品极性越强出峰越晚
3流动相极性越强，洗脱强度越大
反向色谱：
1固定相极性较弱，流动相极性较强；
2样品极性越强出峰越早
3流动相极性越强，洗脱强度越小
18.下列色谱柱，哪些可用于正相，哪些可用于反向？
答：
可用于正相得色谱柱：
NH2柱、硅胶柱、氰基柱
可用于反相得色谱柱：
ODS柱、C8柱、苯基柱氰基柱
20.何为封端（或封尾）？
答：
封尾是用如三甲基硅烷等小分子与键合了C18以后的硅胶进行进一步的反应。
由于硅烷相对很大的体积，使得C18和其它键合相在发生键合反应时只能覆盖不到硅胶表面的50%。
硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。
封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。
封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。
21.什么样的反相柱不会发生“疏水塌陷”？
答：
内嵌极性基团的反相柱不会发生疏水塌陷
22.为防止普通反相柱发生“疏水塌陷”，流动相配制应注意什么？
答：
流动相不可用纯水溶液,应至少加3-5%的甲醇或乙腈,以提高对固定相的湿润性,从而防止“疏水塌陷”
23.硅胶基质键合相能够承受的pH范围为2~8；而聚合物基质键合相承受pH范围一般可达2~12
24.溶剂选择性分组的依据是：
构成溶剂极性的三种主要的分子间作用力（忽略色散力）分量比例的相似性。
据此，Snyder将81种溶剂分为8组。
25.何为反相离子抑制色谱的分离模式？
举例说明。
答：
在反相色谱法中，通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法。
以葡萄酒中酚类物质的测定为例，由于酚类物质均有弱酸性，极性较强，在水和甲醇中有较大溶解度。
因此，在甲醇/水为流动相并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。
若采用离子抑制色谱法可较好的分离。
样品处理：
将25mL红葡萄酒样品通过聚酰胺柱（259mm×17mmid,用5ｇPolgamid-6（Serva）装填，并先用pH2.5的酸性水平衡），以100ｍL蒸馏水淋洗，再用150mL30％的甲醇（酸化至PH2.5）洗脱，洗脱液真空浓缩至5ｍL左右，并用15％甲醇定容至10ｍL。
色谱柱：
ODS柱（125mm×4mmiD）
流动相：
体积比为85:
15的水－甲醇（用HClO3调PH2.5）流速为1ｍL/min；检测波长为280nm。
26.何为反相离子对色谱分离模式？
举例说明。
答：
反向离子对色谱是将与被分析离子带相反电荷的离子（配对离子或反离子）加到流动相中，与溶质离子结合形成弱极性离子对，此离子对在流动相中不易离解而迅速转移到键合相中，进而在固定相和流动相间进行分配，最终实现分离的一种反向色谱模式。
如三聚氰胺的分离，三聚氰胺是弱碱性有机物，在溶液中主要以阳离子存在，在以水-甲醇或水-乙腈为流动相的反相柱（C18）上保留时间比较短，由于杂质的影响还会出现严重的拖尾现象。
若在流动相中加入庚烷磺酸钠试剂，则可以与样品中的阳离子形成离子对，使其成为电中性分子，这样样品的保留时间会增大，分离效果会得到提高。
27.对于反相离子对色谱，离子对试剂的烷基长度（即碳链长度）对欲分析化合物的保留值有何影响？
答：
烷基长度不同，形成离子对的能力不同。
一般烷基长度越长，保留时间也就越长。
28.k´、α、N（或n）是影响分离度的三个重要参数。
通过改变流动相的溶剂比例和pH等，即可调节k´；改变流动相的有机溶剂种类和pH等，则可调节α。
1．对于单糖和低聚糖的HPLC测定，有多种柱系统（包括色谱柱和流动相）可供选择，请简述其中两种柱系统的组成，并说明其分离机制（即分离模式）
答：
分离柱
流动相
分离模式
氨基键合相
C18耐碱性柱
环糊精键合相
石墨化碳柱
乙腈－水或乙腈－甲醇－水
稀NaOH溶液（Ph11）
乙腈-水（0.1%甲酸）
2~15%乙醇，含1mmol/lNaOH
正相分配
反相色谱
正相色谱
吸附，反相分配
阳离子交换柱（Ca2+、Ag+、Pb2+、K+型或或H+型）
水或稀酸（pH2）
空间排阻，配位交换
2．请简述HPLC分析葡萄酒中中性酚和酸性酚的样品处理方法及色谱条件（包括色谱柱，流动相大致组成，检测条件）。
答：
样品处理方法：
取葡萄酒样品用0.1NNaOH调pH至中性，然后用乙酸乙酯分三次萃取，合并萃取液并真空浓缩至干用甲醇定容，用0.45μm微孔膜过滤，得到中性酚样品溶液。
再将萃余液（水相）用甲酸调到PH＝2.0，用乙酸乙酯分三次萃取，合并萃取液并真空浓缩至干用甲醇定容，0.45μm微孔膜过滤，得到酸性酚样品溶液。
中性酚色谱条件：
色谱柱：
ODS100×4.6mm（i.d）
流动相组成：
40%乙腈和水两元梯度
检测器：
UV280
柱温：
室温（20℃）
进样量：
5μL
流速：
1mL/min
酸性酚色谱条件：
色谱柱：
ODS100×4.6mm（5μ）
流动相组成：
1%醋酸和甲醇/水/醋酸（60/39/1，V/V/V）两元梯度
检测器：
UV280
柱温：
室温（20℃）
进样量：
5μL
流速：
1mL/min
3．分析多糖或多肽的分子量分布应采用何种色谱分离模式？
在该模式操作中，控制流动相的pH和离子强度的主要目的是什么？
答：
采用高效体积排阻色谱，控制流动相的pH和离子强度的主要目的是抑制样品分子与填料之间可能存在的吸附、离子交换等二级效应，使样品分子完全按体积排阻机理分离。
4．若在一个气相色谱图上，测得保留时间tR=5.37cm,死时间tM=0.52cm,峰底宽Wb=1.32cm,假定柱长为1m,计算:
（1）理论塔板数和有效理论塔板数;
（2）塔板高度及有效塔板高度;
（3）容量因子.
答：
理论塔板数：
n=16×（tR/Wb）2=16×（5.37/1.32）2=264.8
有效理论塔板数：
neff=16×（（5.37-0.52）/1.32）2=216
塔板高度：
h=l/n=1/264.8=0.00378
有效塔板高度：
heff=L/N=1/216=0.00463
容量因子：
k=（tR-t0）/t0=（5.37-0.52）/0.52=9.327
5．三聚氰胺的化学结构如下，请据此结构特点和本课程所学知识，选择一种可用于三聚氰胺检测的HPLC分离模式，并说明理由。
答：
从结构式可以看出三聚氰胺是非极性有机化合物，呈弱碱性，容易结合H+形成带正电的阳离子，在以水-甲醇或水-乙腈为流动相的反相柱（C18）上保留时间比较短，由于杂质的影响还会出现严重的拖尾现象。
若在流动相中加入庚烷磺酸钠试剂，则可以与样品中的阳离子形成离子对，使其成为电中性分子，利于延长样品的保留时间，分离效果会得到提高。
因而可选择分离模式为反相离子对色谱对其进行分离。
6.气相色谱分析油脂的脂肪酸组成样品前处理过程?
取约3～5滴植物油样品于20ml试管中，加入0.5mol/L的NaOH甲醇溶液2ml，60℃水浴中加热至油珠完全溶解（约30min），冷却后加入25%BF3甲醇溶液2ml，60℃水浴酯化20min，冷却后加入2ml正已烷，振摇，加入2ml饱和NaCl溶液振摇，离心取上层有机相于一只干燥试管中并加入少量无水硫酸钠以除去微量的水，供分析使用。
色谱条件:
色谱柱（colum）：
PEG20M，30m（柱长）×0.32mm，i.d.（内径）液膜厚度0.5μm。
载气（Carriergas）：
氮气（N2）:
流量3.0ml/min，尾气30ml/min;
燃烧气：
H247ml/min；助燃气：
空气400ml/min;
程序升温（Columtemperature）：
起始温度120℃,保留3min，10℃/min，至190℃（0.1min）,2℃/min，至220℃（15min）。
分析时间40min；检测器：
260℃；汽化室：
250℃；进样量：
0.5ul；
分流比：
10：
1；
7.请简述分析果汁中葡萄糖、果糖及蔗糖的色谱条件与样品处理方法，并说明样品处理的主要步骤的目的
答：
色谱条件：
色谱柱：
Sugarpak1,6.5mmid×300mm
流动相：
纯水
检测器灵酸敏度：
4
柱温：
85℃
流速：
0.4ml/min
进样体积：
10μL
样品处理方法：
（1）准确量取3ml果汁至10ml容量瓶中用无水乙醇定容至刻度，目的是提取果汁中的葡萄糖、果糖及蔗糖，沉淀蛋白质和大分子糖。
（2）离心，取上清液在热水浴条件下用氮气将乙醇吹去，用水定容至刻度。
除去乙醇，以防HPLC分析时影响糖的分离。
（3）用0.45um有机相微孔膜过滤，滤液颜色若较深，再用Sep-PakC18固相萃取小柱处理去除色素等杂质。
目的是除去蛋白质和大分子糖沉淀，消除色度对分析的影响。
（4）处理后的样液上机测定
8.液相色谱分析鸡精中的肌苷酸和鸟苷酸含量
采用反相高效液相色谱，按分子极性大小，使鸡精中各种组分同时得到分离，利用紫外检测器测定肌苷酸钠和鸟苷酸钠组分含量。
1）.标准溶液系列配制
分别准确称取肌苷酸钠和鸟苷酸钠标准品20mg左右于100ml容量瓶中，用超纯水溶解定容摇匀后，即得0.2mg/ｍＬ左右的标准溶液，再以此逐级稀释成0.1mg/mＬ,0.05mg/mＬ,0.01mg/mＬ,0.005mg/mＬ, 0.001mg/mＬ的标准溶液系列，均经0.45μm微孔膜过滤，滤液供进样用。
2）.样品处理
准确称取200mg左右鸡精至10ml容量瓶中用3ml水溶解，然后用无水乙醇定容至刻度，充分摇匀，静置，过滤后取3ml滤液用N2吹至0.5ml以下，再用水定容至3ml，摇匀后用0.45um有机相微孔膜过滤，滤液再用C18固相萃取小柱处理去除色素等弱极性杂质，处理后的样液上机测定。
3）.色谱条件
色谱柱：
DiamosilC18,4.6mmid×250mm，5um
流动相：
甲醇：
0.05％H3PO4溶液5：
95
检测：
254nm，DAD
柱温：
30℃
流速：
1.0ml/min
进样体积：
5μL
4）.上机测定
4.1标准曲线制作
将不同浓度的系列标准品分别上机进样分析，以峰面积为横坐标（x），浓度为纵坐标（y）作线性回归，得到肌苷酸钠和鸟苷酸钠的标准曲线方程、相关系数及线性范围。
4.2样品测定
将三个平行样品溶液分别进样，每个样均重复进样3次取其峰面积平均值代入标准曲线方程或单点校正计算含量。
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