基因芯片技术检测利福平药物诱导H37Rv株基因突变的应用研究.docx
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基因芯片技术检测利福平药物诱导H37Rv株基因突变的应用研究
基因芯片技术检测利福平药物诱导H37Rv株基因突变的应用研究
【摘要】目的用利福平、异烟肼药物作用H37Rv株，诱导基因突变，用基因芯片技术检测耐药菌株突变基因位点。
方式H37Rv菌株用不同浓度的利福平和异烟肼加入培育液中观看菌株的耐药生长情形，耐药菌株用PCR扩增产物杂交，基因芯片检测药物作用部位是不是有突变，检测突变基因位点。
结果利福平药物诱导H37Rv耐药，用基因芯片技术检测利福平耐药菌株，rpoB基因531位发生突变，TCG转变成TTG，直接测序发此刻相同位点发生突变。
耐异烟肼耐药菌株katG基因315位发生突变，AGC转变成ACC。
同时加入两种药物的耐药株用基因芯片检测别离在rpoB基因531位，katG基因315位发生突变。
结论结核分枝杆菌产生耐药的机理与药物作用基因位点突变有关。
基因芯片检测技术耐药菌株基因突变，不仅能够准确地确信突变位点和突变类型，快速、高效、设备简单，并能同时检测分析成千上万个基因有关突变位点。
【关键词】H37Rv株；药物诱导耐药；DNA芯片；突变基因
我国是世界上结核病发病率最高的22个国家之一，肺结核患者约有600万人，每一年约有25万人死亡。
世界卫生组织报警：
肺结核日夺全世界千人性命，在西太平洋地域每日有近1000人死于肺结核，将减弱地域的经济增加，肺结核大部份患者年龄在15岁至54岁之间，是社会的要紧劳动力。
若是作为家庭经济支柱，经济有重要阻碍，在孟加拉国每2min就有1人感染肺结核，每10min就有1人死于结核病。
结核病严峻危害人类健康及经济的进展。
结核病流行显示高患病率、高耐药率、低速降率等特点[1]，专门是抗结核药物的普遍应用及不合理的服药，结核杆菌产生高耐药，临床检测困难，耐药菌株存在作为传染源，对流行病的操纵带来严峻要挟。
快速检测那部份耐药菌株，可为临床诊断医治提供靠得住的依据。
为了排除传染源，操纵结核病的流行，咱们用利福平等药物作用于结核菌，用基因芯片技术检测耐药菌株的基因转变，有快速高效的应用成效，现报导如下。
1材料和方式
材料和仪器
全自动血培育仪EspclturesystemⅡ。
结核菌培育液Espmyco培育瓶，mL/瓶，美国TREKDiagnosticsystemsInc生产。
生物平安柜Fx1200-Ⅱ-A/B，上海瑞仰净化设备。
煮沸箱。
Lightcycler荧光PCR仪。
Generalscanning芯片信息系统Scannarray3000扫描仪。
基因芯片由中科院上海信息系统和微技术研究所，宁波瑞芯生物科技生产。
引物正向CAGGACGTGGAGGCGATC18bp；反向CGCTCACGTGACAGACCG18bp；由上海生工工程技术效劳合成。
H37Rv菌株购自中国药品生物制品检定所
利福平﹑异烟肼医院购买。
方式
用利福平﹑异烟肼药物诱导作用H37Rv菌株。
H37Rv菌株在无菌生物柜中打开，用无菌生理盐水稀释，抽取mL接种。
Espmyco培育基中置EspculturesystemⅡ培育仪培育，3周后见细菌生长，继续培育1周后取培育液mL别离接种于Espmyco培育基中，置培育仪培育，培育2周后见各瓶有细菌生长。
用利福平加入培育悬液中诱导作用于细菌。
利福平g/粒，用无菌生理盐水10mL溶解呈150mg/10mL，抽取1mL=15mg/mL利福平加9mL生理盐水，即呈mg/mL，即1500g/mL利福平。
取1500g/mL利福平2mL加入培育液中，浓度呈240g/mL利福平。
取1500g/mL利福平mL加入培育液中，浓度呈48g/mL利福平。
取1500g/mL利福平mL加入培育液中，浓度呈g/mL利福平。
依据WHO发布的标准：
细菌在含40~50g/mL利福平培育基上能够生长为耐药。
用异烟肼加入培育悬液中作用诱导细菌异烟肼100mg/片，溶于10mL无菌生理盐水中即100mg/10mL；取1mL加水9mL稀释浓度呈10mg/10mL；取1mL加水9mL稀释浓度呈1mg/10mL，即1000g/10mL，100g/mL；取1mL加水9mL稀释浓度呈10g/mL；取mL10g/mL利福平加入培育基菌液中呈1g/mL异烟肼浓度。
取mL100g/mL利福平加入培育基菌液中呈10g/mL异烟肼浓度。
取mL100g/mL利福平加入培育基菌液中呈5g/mL异烟肼浓度。
耐药标准1~10g异烟肼在培育基上仍能生长。
培育基悬液中别离加入含5g/mL异烟肼，48g/mL利福平的培育基悬液；配制成含10g/mL异烟肼，248g/mL利福平的培育基悬液作用诱导细菌。
以上，，配制含不同药物的培育基置培育仪培育观看结果。
培育物含不同药物浓度经70d后仍能生长的细菌培育液。
别离取耐48g/mL利福平﹑5g/mL异烟肼﹑48g/mL利福平和5g/mL异烟肼菌液作测定。
据有关文献报导，异烟肼耐药标准1g/mL和10g/mL别离为低浓度和高浓度耐药[2]，WHO发布的标准细菌在含40~50g/mL利福平培育基上能够生长判定为耐药。
H37Rv原菌培育液作对照。
用煮沸裂解法提取DNA，将抽提液用聚合酶链反映扩增所需目的DNA片段。
引物由上海生工生物工程效劳公司合成，rpoB基因引物：
上游引物5＇-CAGGACGTGGAGGCGATC-3＇下游引物：
5＇-CGCTCACGTGACAGACCG-3＇，序列号515684，rpoB基因794-1974，目前国际国内研究突变基因相关区域。
katG基因引物＇-CACTTTCGGTAAGACCCATGGC-3＇，＇-TATTGCCAAGCGCCAGCAGG-3＇。
rpoB基因，聚合酶链反映程序，扩增体系25L，取制备好的DNA样品2L，PCR反映液Buffer3L，dntpmmol/L2L，Taq聚合酶2L，Mg2+mmol/L2L，10pmmol/mL，引物一、2各L。
加水L。
聚合酶链反映程序：
第一将标本预变性94℃4min，再以94℃30s，60℃30s，70℃30s循环35次。
再后72℃延伸4min，置2~8℃保留。
KatG反映体系：
50L。
Buffer5L；2mmol/LMgCl4L；dntp5L；引物120mol/L1L；引物220mol/L1L；Tap聚合酶5g/lL；模板5L；H2OL。
反映程序：
第一94℃3min预变性，然后以94℃1min，64℃1min，72℃1min，35个循环，再后以72℃5min延伸，置2~8℃保留。
聚合酶链扩增产物由中科院上海信息系统和微技术研究所宁波瑞芯生物制品用基因芯片技术进行基因测序及基因突变分析。
H37Rv对照样本及耐药菌株的扩增产物，用基因芯片序列测定。
该芯片包括：
511，513，514，516，526，531，532和533位密码子突变在内的30种单核苷酸变态性。
还包括katG基因282~387位密码子。
2实验结果
培育结果观看
含异烟肼5g/mL培育基在35d，70d仍见细菌生长。
含利福平48g/mL培育基在21d，35d，70d仍见细菌生长。
含利福平48g/mL和异烟肼5g/mL培育基在21d，35d，70d仍见细菌生长。
基因芯片检测结果
H37Rv株基因芯片测序及直接测序为野生型。
H37Rv利福平耐药株基因芯片检测发觉531位基因发生突变。
TCG突变成TTG。
利福平加异烟肼作用H37Rv株耐药发觉531位、315位均发生突变。
TCG突变成TTGAGC突变成ACC。
直接测序结果
H37Rv株用测序仪直接测序未见突变基因。
利福平作用H37Rv株见531位发生突变。
TCG突变成TTG。
异烟肼作用H37Rv株见315位发生突变。
AGC突变成ACC。
3讨论
抗结核药物的诞生拯救了无数结核病患者的生命，对结核流行病的操纵发挥了庞大作用。
但随着药物的滥用及不正规利用，结核菌应付环境的生存条件，对一些药物产生耐药，不管细胞膜或细胞核都会发生变异。
菌株能变异成颗粒状，抗酸性阴性或减弱。
研究发觉DNA发生突变，是药物作用部位的遗传基因发生改变而产生耐药。
实验用利福平诱导H37Rv株发觉DNA531位碱基发生突变：
TCG→TTG，产生耐药，且仍具生命。
利福平药物的作用是通过细菌DNA聚合酶β亚基结合，抑制转录起始和RNA的延伸，起到杀菌作用。
那个结合位点是由不同RNA聚合酶亚单位上关键氨基酸的改变而致使其构象的改变，从而使药物结合位点缺失[3]。
rpoB基因是细菌RNA聚合酶β亚基的编码基因，全长3543个碱基，现研究发觉其中长81个碱基的核心区易发生突变，利福平不能与RNA聚合酶亚基结合因此细菌产生耐药，这与Garoial等的结果相似[4]。
咱们的实验结果发觉531位发生突变与国外报导相符。
目前国内外研究证明90%~95%的结核分枝杆菌耐利福平菌株存在rPOB基因突变，而且这些突变集中于核心区域内包括507~533位是耐利福平的决定区。
异烟肼作用H37Rv株诱导结果发觉DNA315位碱基发生突变。
最近几年来国内外学者的大量研究以为异烟肼事实上是一药物前体，需经mtb过氧化氢-过氧化酶（katG）活化后才发挥抗结核作用，而过氧化氢-过氧化酶正是由katG基因编码的[5]。
在对耐INH的临床分离株中，3株菌种有2株存在katG基因片段的缺失，他们以为katG基因的缺失是mtb，INH耐药的一起机理[6]。
国内吴雪琼、胡忠义等研究证明katG基因突变在315位密码子。
目前，我国对katG基因的分析多集中于282bp与237bp突变区域，这些区域的变异可在2/3的耐药菌株中观看到[7]。
实验结果也显示耐INHH37Rv株在315位密码子有突变：
AGC突变成ACC（丝氨酸突变成苏氨酸）。
katG基因的突变，过氧化酶活性下降，异烟肼失去对细菌的杀灭作用。
咱们用利福平和异烟肼两种药物作用H37Rv株培育诱导，菌株对两种药物均产生耐药，用基因芯片测序，在531位和315位碱基均发生突变：
TCG突变成TTG，AGC突变成ACC。
这在国内外学者研究中也曾报导：
结核分枝杆菌对多种药物耐药。
这给临床医治带来了困难，提示临床选用其他的药物医治。
从咱们的实验中证明了国内外学者对结核分枝杆菌耐利福平、异烟肼药物产生，rpoB基因及katG基因突变的研究功效。
结核分枝杆菌rpoB基因及katG基因的改变因此产生对利福平及异烟肼耐药。
基因芯片技术在90年代第一由美国Affymetrix公司的Fodor博士提出并开始基因芯片技术的研究，它是目前分子生物学最前沿的方式，是物理学、微电子学和生命科学的交叉综合的高新技术，是最近几年来进展起来的进行大规模遗传变态性检测的新方式。
基因芯片技术在结核分枝杆菌菌种鉴定中的应用，具有高速高效等优势，能同时分析成千上万个基因，用基因芯片直接测序可在几小时内测得结果。
在结核分枝杆菌耐药性研究顶用芯片检测结果突变型，测序结果也是突变型，而且病人痰液中存在少量的DNA就能够够进行结核分枝杆菌分子的突变，不仅能够正确地确信突变位点和突变类型，而且基因芯片技术能将大量探针同时固定在支持物上，能够一次性对样品序列进行检测和分析。
因此能够利用芯片测序的技术来检测患者标本中是不是存在结核分枝杆菌，更重要的是它的快速、高效、设备简单。
既提高了检测的特异性，又能将结核杆菌感染和其他分枝杆菌感染区分。
因此，基因芯片技术可作为临床检测结核杆菌感染。
何敏等检测102例肺结核患者晨痰标本的结果用基因芯片技术检测的阳性率要高于痰涂片法和痰培育法[8]。
这一新技术在临床推行应用具有极大价值，芯片技术开创于20世纪90年代初，是目前分子生物学最前沿的方式[9]。
咱们利用基因芯片技术对H37Rv株用药物作用诱导检测基因突变，还未在临床普遍应用。
下一步工作将用此技术应用于临床，为临床诊断医治提供新的方式。
【参考文献】
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