综合设计实验表讲解.docx

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综合设计实验表讲解

综合与设计性实验方案（教案）

学院：

xxxxxxxx2014年9月13日

实验课程名称

生物化学开放实验

专业

xxxx　

实验项目名称

食用植物油脂酸价、碘价的测定

实验班级

xxxxx　

实验项目类型

方案编写人

分班（组）情况

指导教师

唐功　

实验员

实验人数

实验地点

生物化学实验室　

实验时间

1、实验目的

（1）掌握测定食品植物油脂的主要常规指标方法；

（2）食用植物油脂的品质可由测定其酸价、碘价等理化特性来判断。

2、实验条件：

实验场地及仪器、设备、材料

仪器

碘量瓶250mL；各种分析天平；碱式滴定管；锥形瓶250mL；常用玻璃仪器。

试剂

（1）酚酞指示剂（10g/L）：

溶解1g酚酞于90mL（95%）乙醇与10mL水中。

（2）氢氧化钾标准溶液[C（KOH）=0.05mol/L]。

（3）碘化钾溶液（150g/L）：

称取15.0g碘化钾,加水溶解至100mL,贮于棕色瓶中。

（4）硫代硫酸钠标准溶液（0.1mol/L）：

按GB601配制与标定。

（5）韦氏碘液试剂：

分别在两个烧杯内称入三氯化碘7.9g和碘8.9g，加入冰醋酸，

稍微加热，使其溶解，冷却后将两溶液充分混合，然后加冰醋酸并定容至

1000mL。

（6）环己烷（分析纯）。

（7）冰乙酸（分析纯）。

（8）可溶性淀粉（分析纯）。

（9）氢氧化钾标准溶液（0.05mol/L）的标定：

（按GB601标定或用标准酸标定）。

（10）中性乙醚—乙醇（2+1）混合液：

按乙醚—乙醇（2+1）混合，以酚酞为指示剂，用所配的KOH溶液中和至刚呈淡红色，且30s内不退色为止。

（11）淀粉指示剂（10g/L）配制：

称取可溶性淀粉0.50g，加少许水，调成糊状，倒入50ml沸水中调匀，煮沸至透明，冷却。

材料

食用植物油

3、设计思路：

（设计原理、流程、数据处理方法及实验步骤等）

酸价的测定

1）称取3.00g—5.00g混匀的试样，置于锥形瓶中，加入50mL中性乙醚—乙醇混合液，振摇使油溶解，必要时可置于热水中，温热使其溶解；

2）冷至室温，加入酚酞指示剂2-3滴，以氢氧化钾标准滴定溶液滴定，至初现微红色，且0.5min内部退色为终点；

3）平行2次，空白1次，记录实验数据。

碘价的测定

1）试样的量根据估计的碘价而异（碘价高，油样少；碘价低，油样多），本实验在0.120g-1.130g左右；

2）将称好的试样放入250mL锥形瓶中，加入10mL环己烷—冰乙酸等体积混合液，溶解试样；

3）准确加入12.50mL韦氏试剂，盖好塞子，摇匀后放于暗处30min以上（碘价低于150的样品，应放1h；碘价高于150的样品，应放2h）；

4）反应时间结束后，加入10mL碘化钾溶液（150/L）和75mL水，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加几滴淀粉指示剂继续滴定至剧烈摇动后蓝色刚好消失；

5）在相同条件下，平行2次，空白1次。

4、成果评分标准：

酸价

计算公式

式中：

X——试样的酸价（以氢氧化钾计），单位为毫克每克（mg/g）；

V——试样消耗氢氧化钾标准溶液体积，单位毫升（mL）；

C——氢氧化钾标准溶液实际浓度（mol/L）；

m——试样质量，单位为克（g）；

56.11——与1.0mL氢氧化钾标准溶液[C（KOH）=1.000mol/L]相当的氢氧化钾毫克数。

计算结果保留两位有效数字。

碘价

计算公式

式中：

V1——试样消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；

V2——空白试剂消耗硫代硫酸钠的体积，mL；

C——硫代硫酸钠的实际浓度，mol/L；

m——试样的质量，g；

0.1269——1/2I2的毫摩尔质量，g/mmol。

5、要求阅读的参考资料：

酸价（酸值）是指中和1.0g油脂所含游离脂肪酸所需氢氧化钾毫克数。

酸价是反映油脂质量的主要技术指标之一，同一种植物油酸价越高，说明其质量越差越不新鲜。

测定酸价可以评定油脂品质的好坏和贮藏方法是否恰当。

碘价：

测定碘价可以了解油脂脂肪酸的组成是否正常有无掺杂等。

最常用的是氯化碘—乙酸溶液法（韦氏法）。

其原理：

在溶剂中溶解试样并加入韦氏碘液，氯化碘则与油脂中的不饱和脂肪酸起加成反应，游离的碘可用硫代硫酸钠溶液滴定，从而计算出被测样品所吸收的氯化碘（以碘计）的克数，求出碘价。

过氧化值：

检测油脂中是否存在过氧化值，以及含量的大小，即可判断油脂是否新鲜和酸败的程度。

常用滴定法，其原理：

油脂氧化过程中产生过氧化物，与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，计算含量。

羰基价：

常用比色法测定总羰基价，其原理：

羰基化合物和2，4—二硝基苯胺的反应产物，在碱性溶液中形成褐红色或酒红色，在440nm波长下，测定吸光度，可计算出油样中的总羰基价。

中国《食用植物油卫生标准》规定：

羰基价≤20mmol/kg。

综合与设计性实验方案（教案）

学院：

xxxxx　2014年9月13日

实验课程名称

生物化学开放实验

专业

xxxxx　

实验项目名称

糖类的性质实验----糖类的颜色反应

实验班级

xxxxx　　

实验项目类型

方案编写人

分班（组）情况

指导教师

唐功　

实验员

实验人数

实验地点

生物化学实验室　

实验时间

1、实验目的

1．了解糖类某些颜色反应的原理。

2．学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。

2、实验条件：

实验场地及仪器、设备、材料

器材

（1）试管及试管架

（2）滴管

试剂

（1）莫氏（Molisch）试剂：

5％α-萘酚的酒精溶液1500mL称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100mL，贮于棕色瓶内。

用前配制。

（2）1％葡萄糖溶液100mL（3）1％果糖溶液100mL（4）1％蔗糖溶液100mL

　　（5）1％淀粉溶液100mL（6）0.1％糠醛溶液100mL（7）浓硫酸500mL

（8）塞氏（Seliwanoff）试剂0.05％间苯二酚-盐酸溶液

　　1000mL称取间苯二酚0.05g溶于30mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100mL。

3、设计思路：

（设计原理、流程、数据处理方法及实验步骤等）

1）取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、　1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、0.1％糠醛溶液各1mL。

再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。

斜执试管，沿管壁慢慢加入浓硫酸约1mL，慢慢立起试管，切勿摇动。

浓硫酸在试液下形成两层。

在二液分界处有紫红色环出现。

观察、记录各管颜色。

2）取3支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液各0.5mL。

再向各管分别加入塞氏试剂5mL，混匀。

将3支试管同时放入沸水浴中，注意观察、记录各管颜色的变化及变化时间。

4、成果评分标准：

α-萘酚反应：

试剂

现象

1%葡萄糖溶液

分层；无色

1%果糖溶液

分层；维紫红

1%蔗糖溶液

分层；颜色不分明

1%淀粉溶液

分层

0.1%糖醛溶液

分层；紫红

间苯二酚反应：

试剂

水浴5min；5ml塞氏试剂

水浴10min；5ml塞氏试剂

水浴5min；10ml塞氏试剂

1%葡萄糖溶液

无

无

无

1%果糖溶液

微红

砖红

无

1%蔗糖溶液

无

无

无

5、要求阅读的参考资料：

多羟基酮称为酮糖，如二羟丙酮、赤藓酮糖、木酮糖、果糖、景天庚酮糖等都是天然存在的酮糖，酮糖都是α碳上有羟基的酮。

醛糖和酮糖具有醇羟基和羰基的性质，都是还原糖，因为酮糖分子内虽然无醛基，但其羰基受相邻α碳原子上羟基的影响，而呈现出还原活性。

两者的鉴别：

（1）西利万诺夫试验（Seliwanofstest），间苯二酚于盐酸中与酮糖反应呈红色，而醛糖呈色很浅；

（2）弱氧化剂，如溴水可将醛糖氧化成相应的糖酸，而对酮糖则无氧化作用。

综合与设计性实验方案（教案）

学院：

xxxxx　2014年9月13日

实验课程名称

生物化学开放实验

专业

xxxxx　

实验项目名称

糖类的性质实验----糖类的还原作用

实验班级

xxxxx　

实验项目类型

方案编写人

分班（组）情况

指导教师

唐功　

实验员

实验人数

实验地点

生物化学实验室　

实验时间

1、实验目的

学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。

2、实验条件：

实验场地及仪器、设备、材料

器材

　　1．试管及试管架2．竹试管夹3．水浴锅4．电炉

试剂

　　1．斐林（Fehling）试剂1000mL

　　甲液（硫酸酮溶液）：

称取34.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于500mL蒸馏水中。

　　乙液（碱性酒石酸盐溶液）：

称取125g氢氧化钠和137g洒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中。

　　为了避免变质，甲、乙二液分开保存。

用前，将甲、乙二液等量混合即可。

　　2．本尼迪克特（Benedict）试剂1000mL

　　称取柠檬酸钠173g及碳酸钠（Na2CO3·H2O）100g加入600mL蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释至850mL。

　　另称取17.3g硫酸铜溶解于100mL热蒸馏水中，冷却，稀释至150mL。

　　最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。

3、设计思路：

（设计原理、流程、数据处理方法及实验步骤等）

许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，故在碱溶液中能将铜、铋、汞、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。

糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。

先取1支试管加入斐林试剂约1mL，再加入4mL蒸馏水，加热煮沸，如有沉淀生成，说明此试剂已不能使用。

经检验，试剂合格后，再进行下述实验。

　　取5支试管，分别加入2mL斐林试剂，再向各试管分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％麦芽糖溶液、1％淀粉溶液各1mL。

置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却。

观察各管溶液的变化。

4、成果评分标准：

斐林试剂是一种弱氧化剂，如果是还原性糖就可以和斐林试剂发生氧化还原反应，会看到砖红色氧化亚铜沉淀生成，本尼迪克特试剂，就是班氏试剂，实验现象和斐林试剂一样，二者的主要成分都是氢氧化铜，前者不稳定，后者稳定性好。

5、要求阅读的参考资料：

斐林试剂和本尼迪克试剂。

都含Cu2+的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色或黄色的Cu2O沉淀。

生成Cu2O沉淀的颜色之所以不同是由于在不同条件下产生的沉淀颗粒大小不同引起的，颗粒越小呈黄色，越大则呈红色。

如有保护性胶体存在时，常生成黄色沉淀。

综合与设计性实验方案（教案）

学院：

xxxxxxx2014年9月13日

实验课程名称

生物化学开放实验

专业

xxxxxxx　

实验项目名称

考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量

实验班级

xxxxxxx

实验项目类型

方案编写人

分班（组）情况

指导教师

唐功　

实验员

实验人数

实验地点

生物化学实验室　

实验时间

1、实验目的

1）学习分光光度计的原理及操作

2）学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度。

2、实验条件：

实验场地及仪器、设备、材料

试剂

1）标准蛋白质溶液：

0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液

2）考马斯亮蓝G250蛋白染色剂：

3、设计思路：

（设计原理、流程、数据处理方法及实验步骤等）

1）根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光光度法。

该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。

该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200-800nm之间的光。

2）分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。

3）紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。

由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm-400nm。

可见光区为400nm-800nm。

4）考马斯亮蓝G250法

原理：

考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg/mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。

操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。

去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定。

实验设计与步骤：

1）标准曲线的绘制：

取6只试管，分别加入浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的标准蛋白质溶液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。

2）样品测定：

样品液0.1mL,然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm测定吸光值。

从标准曲线中查出相应的浓度。

4、成果评分标准：

1）数据记录

标准蛋白质溶液浓度mg/ml

0

0.1

02

0.3

0.4

0.5

C

吸光度A

0

0.021

0.037

0.056

0.070

0.107

0.017

2）标准曲线的绘制

3.样品的测定

根据标准曲线可以找出样品对应的点（0.085，0.017），所以样品的浓度为0.085mg/ml。

5、要求阅读的参考资料：

1）分光光度计必须放置在固定而且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。

严防震动、潮湿和强光直射。

2）盛待测液时，必须达到比色杯2/3左右，不宜过多。

若不慎使溶液流出比色杯外面，必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净才能放入比色杯槽内。

移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。

3）千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯光滑面。

4）用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。

5）每套分光光度计上的比色杯及比色槽不能随意更换。

综合与设计性实验方案（教案）

学院：

xxxxxxx2014年9月13日

实验课程名称

生物化学开放实验

专业

xxxxxxx

实验项目名称

氨基酸纤维素薄层层析

实验班级

xxxxxxx

实验项目类型

方案编写人

分班（组）情况

指导教师

唐功　

实验员

实验人数

实验地点

生物化学实验室　

实验时间

1、实验目的

学习纤维素薄层层析的操作方法，掌握分配层析的原理。

2、实验条件：

实验场地及仪器、设备、材料

实验材料

绿豆芽或萌发小麦种子

仪器

烧杯50mL×1；玻璃板5cm×20cm×1；层析缸；毛细管；喷雾器；研钵。

试剂

标准氨基酸溶液：

丝氨酸、色氨酸、亮氨酸，分别以0.01mol/L盐酸配成4mg/mL的溶液。

纤维素粉（层析用）或微晶型纤维素（层析用）；羧甲基纤维素钠（CMC）。

层析溶剂系统：

正丁醇（分析纯）﹕冰醋酸（分析纯）﹕水＝4﹕1﹕1（V/V）。

显色剂：

0.1％茚三酮-丙酮溶液。

3、设计思路：

（设计原理、流程、数据处理方法及实验步骤等）

以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。

纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。

层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。

当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。

1）氨基酸的提取

取已萌发好的小麦种子2g（或绿豆芽下胚轴2g），放入研钵中，加95％乙醇4mL及少量的石英砂，研成匀浆后，倒入离心管中离心3000r/min、15min，上清液即为氨基酸提取液，用滴管小心吸入点样瓶中备用。

2）制板

取少量羧甲基纤维素钠（约12mg），置研钵中充分研磨，再称取纤维素粉3g于研钵中研磨，再加入14mL水研磨匀浆，把纤维素匀浆倒在洗净烘干的玻璃板上，轻轻震动，使纤维素均匀分布在玻璃板上，水平放置风干，用前放入100～110℃烘箱中活化30min。

此处羧甲基纤维素钠是起粘合剂作用，它使纤维素粉能较牢固地粘附于玻璃板上，加入量过多会破坏纤维素薄层的毛细作用而使层析速度延缓，加的量过少则粘合不牢固，因此需要注意加量控制。

3）点样

用刀片将薄层板上薄层的左右各边刮削掉0.5cm，以防止“边缘效应”。

在纤维素薄板上距一端15mm处，用铅笔轻轻划出点样记号。

样点之间距离1.3cm。

用毛细管吸取样品，在记号处点样，样品斑点直径控制在2mm左右。

4）展层

将薄板有样品的一端浸入已存放展层溶剂的层析缸中，层析溶剂液面不能高于样品线。

待展层溶剂走到距薄板顶端0.5～1cm时取出此薄板（约1～2h），用铅笔在前沿处作一记号后用电吹风吹干。

5）显色

将茚三酮显色剂喷雾在板上，用热吹风吹数分钟，（或置于70～80℃烘箱中烘干）即可观察到紫红色的氨基酸斑点，脯氨酸例外，为黄色斑点。

用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸的Rf值。

Rf值为迁移率（rateofflow,Rf），在恒定条件下，每种氨基酸有其一定的Rf值。

根据已知标准氨基酸和Rf值，与小麦（或绿豆芽）提取液中氨基酸的Rf值比较，确定提取液中含有哪些种氨基酸。

4、成果评分标准：

附注

1．在操作过程中，手必须洗净，只能接触薄板上层边角；不能对着薄板说话，以防唾液掉在板上。

2．配制展层剂时，要用纯溶剂，应现用现配，以免放置过久其成分发生变化（酯化）。

5、要求阅读的参考资料：

在用多元系统进行展层时，其中极性较弱的和沸点较低的溶剂（例如氯仿-甲醇系统中的氯仿）在薄层板的两边易挥发，因此，它们在薄层两边的浓度比在中部的浓度小，也就是说在薄层的两边比中部含有更多的极性较大或沸点较高的溶剂，于是位于薄层两边的Rf值要比中间的高，即所谓“边缘效应”。

为减轻或消除边缘效应，可在层析缸的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸，使层析缸内溶剂蒸汽的饱和程度增加。

综合与设计性实验方案（教案）

学院：

xxxxxxx2014年9月13日

实验课程名称

生物化学开放实验

专业

xxxxxxx

实验项目名称

过氧化物酶活性的测定POD

实验班级

xxxxxxx

实验项目类型

方案编写人

分班（组）情况

指导教师

唐功　

实验员

实验人数

实验地点

生物化学实验室　

实验时间

1、实验目的

过氧化物酶活性的测定POD

2、实验条件：

实验场地及仪器、设备、材料

仪器：

分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器

试剂：

愈创木酚、30%H2O2、0.2mol/L磷酸缓冲液（7.8）、0.1mol/L磷酸缓冲溶液（PH6.0，见附录）反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲溶液（PH6.0）50ml，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷却后，加入（待溶液冷却后再加入，否则引起分解）30%H2O219μl，混合均匀，保存于冰箱中。

]

3、设计思路：

（设计原理、流程、数据处理方法及实验步骤等）

过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。

本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。

1）粗酶液的提取：

称取植物材料0.4-0.5g，加磷酸缓冲液（7.8）5ml（分几次加入），于研钵中研磨成匀浆，以8000r/min离心10min，收集上清液于冷处（冰箱4度保存）。

2）酶活性的测定：

一个试管入反应混合液3ml，磷酸缓冲液（7.8）1ml，作为校零对照，另外加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（龙麦26酶液稀释10倍，克旱16酶液稀释15倍），立即开启秒表计时，于470nm测OD值，每隔15秒读1次值，读45秒，以为每15秒钟OD变化值测酶活性的大小，以△OD/min.mg蛋白质表示。

计算公式：

ΔA470：

反应时间内吸光值的变化

W：

样品重量

V：

提取液总体积，即5ml

Vt：

测定时所用体积,即1ml

t：

反应时间

注意：

一般来说，都需要稀释，如果酶液稀释了，应在计算时乘上相应的倍数。

磷酸缓冲液配置

A0.2mol/lNaH2PO427.8gNaH2PO4•H2O1000ml

B0.2mol/lNa2HPO471.7gNa2HPO4•12H2O1000ml

A（ml）B（ml）

PH7.88.591.5

200ml

PH6.087.712.3

4、成果评分标准：

A470nm=0.003/0.01=0.3

植物叶过氧化物酶活力=6.0

5、要求阅读的参考资料：

过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。

本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。