不同生长期异堇叶碎米荠叶挥发性成分及硒含量分析.docx

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不同生长期异堇叶碎米荠叶挥发性成分及硒含量分析

学号：

071040128

本科毕业论文

题目:

不同生长期异堇叶碎米荠叶

挥发性成分及硒含量分析

姓名：

牟迪

班级：

0710401

专业：

生物工程

指导教师：

周毅峰副教授

中国·恩施

二O一四年五月

ID:

071040128

BACHELOR'STHESISOFHUBEIUNIVERSITYFORNATIONALTIES

AnalysethevolatilecomponentsandseleniumcontentsofCardamineviolifoliaatdifferentgrowthperiods

Name:

DiMou

Grade:

0710401

Profession:

Biologicalengineering

Tutor:

Coprof.Yi-fengZhou

Enshi•China

May,2014

学术声明

1、坚持以“求实、创新”的科研精神从事研究工作。

2、本论文中除引文外，数据和有关材料均是真实的。

3、其他同志对本研究所做的贡献已在论文中做了声明并表示了谢意。

4、本声明的法律后果由本人承担。

作者签名：

年月日

导师审核声明

本人郑重声明：

该生上交的学士学位论文，是在本人的指导下独立进行研究所取得的成果。

其内容均经本人审核，同意作为该生的学位论文提交。

　　　　导师签名：

　　　　年月日

不同生长期异堇叶碎米荠叶挥发性成分及硒含量分析牟迪

（湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施，445000）

摘要：

为了探寻异堇叶碎米荠叶片不同生长期挥发性成分和硒含量，主要通过顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用仪（SPME-GC/MS）测定挥发性成分，通过石墨消解仪将叶片消解后，用双道原子荧光光度计测定出硒含量。

结果表明：

1）异堇叶碎米荠叶片挥发性物质主要为异硫氰酸苄酯、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、苯乙腈，其相对含量在各个时期中较高；2）异硫氰酸苄酯在不同时期异堇叶碎米荠叶片中相对含量较高，在幼苗期高达82.22%；3）随着异堇叶碎米荠的生长叶片硒含量呈显著性增加，到开花期时，达到最高，随后变化不显著，幼苗期硒含量最低为339.00mg·Kg-1，花期硒含量最高为1103.55mg·Kg-1。

关键词:

异堇叶碎米荠；挥发性成分；硒

AnalysethevolatilecomponentsandseleniumcontentsofCardamineviolifoliaatdifferentgrowthperiods

DiMou

（CollegeofBiologicalScientificandtechnical,HubeiMinzuUniversity,HubeiEnshi,445000，）

Abstract:

InordertoexplorethevolatilecomponentsandseleniumcontentofCardamineviolifoliaatdifferentgrowthperiods,wemeasurethevolatilecomponentsbyusingSPME-GC-MSanddeterminetheseleniumcontentsbydigestingwithGraphitedigestionapparatusanddetectingwithdoublechannelatomicfluorescencespectrometer.Itturnoutthat：

1）themainvolatilesubstanceswhichrelativecontentsarehigherineveryperiodsofCardamineviolifoliaareBenzylmustardoil、2,2,4,6,6-PentamethylheptaneandBenzylcyanide;2）BenzylmustardoilisthehighestsubstanceinCardamineviolifoliaatdifferentgrowthperiods,whichreachtothemaximumof82.22%atseedingstage;3）AstheCardamineviolifoliagrowsolder,themoreseleniumcontentsareaccumulated，andthecontentcometothehighestatfloweringstage,butthechangeisnotsignificantafterwards.Attheseedingstage,seleniumcontentsareinaminimumof339.00mg·Kg-1,whiletheseleniumcontentsarethehighestduringfloweringstageof1103.55mg·Kg-1.

Keywords:

Cardamineviolifolia；volatilesubstances；selenium

目录

1文献综述1

1.1硒的性质及药用价值1

1.1.1硒的性质1

1.1.2硒的药用价值1

1.1.2.1抗癌1

1.1.2.2抗氧化2

1.1.2.3解毒作用2

1.1.2.4硒的其他作用2

1.2植物富硒2

1.2.1植物富硒能力的划分2

1.2.2植物对硒的吸收和代谢3

1.3异堇叶碎米荠的性质4

1.3.1异堇叶碎米荠特征4

1.3.2异堇叶碎米荠的地理分布5

1.3.3异堇叶碎米荠的研究现状5

1.5选题意义6

2材料与方法7

2.1材料7

2.2药品7

2.3设备7

2.4异堇叶碎米荠叶片的挥发性物质测定7

2.4.1样品准备7

2.4.2SPME-GC-MS测定挥发性物质7

2.5异堇叶碎米荠叶片硒含量测定8

2.5.1标准曲线绘制8

2.5.2样品消解8

2.5.3样品硒含量测定9

2.6数据分析9

3结果与分析10

3.1不同时期异堇叶碎米荠叶片挥发性成分分析10

3.2不同时期异堇叶碎米荠叶片硒含量分析14

4小结与讨论15

参考文献16

致谢18

附录19

1文献综述

1.1硒的性质及药用价值

1.1.1硒的性质

硒（Selenium）是一种化学元素，符号为Se，与氧、硫同族，属于第四周期VIA族，是一种非金属元素，其性质与硫接近。

瑞典化学家J.J.Berzelius在1817年发现硒[1]。

硒主要以有机硒和无机硒这两种方式存在。

无机硒一般主要指亚硒酸盐和硒酸盐这两种物质，这两种物质主要是从硒矿床中获得。

湖北恩施是天然富硒区，其土壤中无机硒含量较高，同时有着硒矿床。

有机硒是生物对无机硒进行代谢转化产生，然后存在于生物体内。

人体内缺少合成有机硒的功能，必须从摄取的食物中获得[2]。

由于硒是人体必不可少的元素，对人体有重要作用，保持人体内硒含量的稳定十分重要，而食物中有着丰富的有机硒，人体可以通过直接食用补充体内缺少的硒。

在一般情况下，每个人只需要保持每天均衡饮食，就可以满足人体对于硒的要求，保证人体内硒含量处于正常的水平。

人体内硒含量较低时，会使许多组织器官受到损害，导致疾病的发生，如：

食道癌、冠心病[3]等。

因此，对于体内硒含量偏低的人群，必须通过外部因素进行补充有机硒来保持人体内硒含量处于正常的水平，从而保证人体能够进行正常的新陈代谢，维持人体正常的生理机能。

1.1.2硒的药用价值

1.1.2.1抗癌

硒在癌症基因调控中属于调控因子，对于癌症基因表达有着重要的意义。

细胞有丝分裂时，硒对蛋白质和DNA的合成产生抑制，有效延长有丝分裂间期，为DNA修复创造条件[4]。

从而一定程度上减少细胞癌变的几率，对机体有着抗癌的效果。

流行病学研究表明，在很多硒含量较低，甚至缺硒的地区，其居住的人群癌症的发病率和死亡率均高于硒含量较高地区的人群，死于癌症的人群体内的血硒水平较低。

通过对缺硒人群进行补硒发现，硒能够降低癌症的发病率和死亡率，增强人体的免疫能力[4]。

因此，对于缺硒的人群来说，通过外部条件补充体内硒含量，使得体内硒含量处于正常水平，对身体健康有着重要的影响。

1.1.2.2抗氧化

硒是抗氧化酶系的组分，能够通过改变抗氧化酶，让机体抗氧化。

同时可以对自由基进行直接清除，发挥抗自由基损伤的作用[5]。

自由基具有很强的氧化性，是属于一种在机体发生氧化反应的过程中产生的有害化合物，这种有害化合物可以损伤对机体具有重要作用的生物大分子如核酸、蛋白质等，使得生物体的部分遗传信息遭到破坏，从而导致遗传信息表达时，蛋白质在合成的过程中发生错误，造成异常物质的在细胞内积累而使细胞老化。

因此，硒在发挥抗自由基损伤作用时，机体内细胞的老化变缓，使得细胞代谢在较长时间都处于高效率阶段，从而可以起到抗衰老的作用。

1.1.2.3解毒作用

硒与硫同主族，其性质二者之间相似，都是属于带负电荷的非金属离子。

在机体内能够和带正电荷的有害金属离子发生结合，生成金属—硒—蛋白质复合物[6]。

通过这种方式，这样就可以将含金属离子的复合物从体内排出，缓解了有害金属对人体造成的伤害，保持人体正常的新陈代谢，起到解毒作用。

特别是对于一些汞、铅、镉等重金属有着重要的作用，如镉会导致人体肾损伤、高血压、贫血等症状，硒在人体内能使得镉在器官组织和细胞中再分配，同时硒使镉从低分子量的关键蛋白质结合转为较高分子量的代谢关系不大的蛋白质结合，生成的物质使得镉的浓度降低，从而降低镉对人体的伤害。

1.1.2.4硒的其他作用

硒还具有提高人体免疫力[7]。

对于动脉硬化、白内障等疾病的治疗和预防有着很好的效果。

目前硒的研究正被越来越多的人所重视，硒对身体的作用的更深层次的研究有着巨大的作用。

1.2植物富硒

1.2.1植物富硒能力的划分

植物按照富硒能力的划分方法主要有两种：

一种方法是分为聚硒植物和非聚硒植物，聚硒植物体内硒含量较高，能够作为硒指示植物，如黄芪属植物，地上部分硒含量每千克可达几百甚至几千微克[8-9]；非聚硒植物硒含量较低，大部分农作物属于非聚硒植物，体内硒含量不超过30mg·Kg-1[10]。

另一种方法是将植物分为累积植物、中度含硒植物与低度含硒植物[11]。

其中累积植物的体内硒含量最高，其体内硒含量每千克能够达到几千毫克[12]。

累计植物对于硒的耐受能力最强，一般生长在高硒土壤环境中；中度含硒植物体内硒含量次之；低度含硒植物体内硒含量最低，对于硒的耐受能力也最弱，当土壤中硒含量较高时，会导致植物死亡。

1.2.2植物对硒的吸收和代谢

硒主要是通过植物根部上的硫转运蛋白进入植物体内，从而进行相关的代谢。

硒与硫对于细胞膜上的硫转运蛋白产生竞争作用[13]。

二者均依靠硫转运蛋白转运，进入到细胞中，而不同种类的硫转运蛋白在硒酸盐吸收的过程中有着不同的作用。

硒酸盐以同向协同运输方式进行转运进入细胞，每吸收3个质子的同时吸收一个硒酸盐[14]。

植物主要吸收硒酸盐和亚硒酸盐，这两种盐在植物体内的代谢机理不同，见下图1.1[15-17]。

硒酸盐在硫转运蛋白的作用下进入叶绿体中，然后在ATP硫酸化酶（ATPS）的作用下产生5'-磷酸硒腺苷（APSe）。

而亚硒酸盐在亚硫酸还原酶（SiR）的作用下进一步还原成Se2-。

Se2-在半胱氨酸合成酶的作用下生成硒代半胱氨酸（SeCys）。

一部分硒代半胱氨酸是在硒代半胱氨酸甲基转移酶（SMT）的作用下，生成甲基硒代半胱氨酸，进而产生甲基硒代半胱氨酸硒氧化物；然后在半胱氨酸亚砜裂解酶的作用下生成胶太硒甲烷，最后生成二甲基二硒化物（DMDSe）。

另一部分硒代半胱氨酸是胱硫醚-γ-合成酶对硒代半胱氨酸产生催化，生成硒代胱硫醚，而胱硫醚-β-裂解酶对硒代胱硫醚作用，生成硒代高半胱氨酸，然后进一步生成硒代蛋氨酸。

其中一部分硒代蛋氨酸进入细胞质，在蛋氨酸甲基转移酶作用下产生硒甲基蛋氨酸，在高半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）作用下生成硒代高半胱氨酸；而硒甲基蛋氨酸通过甲基蛋氨酸水解酶生成二甲基硒化物。

对于不耐硒植物来说，当植物吸收硒以后，硒经过有毒的硒代半胱氨酸在半胱氨酸脱硫酶作用下形成单质硒，而单质硒就会和铁硫蔟中的硫发生竞争而形成铁硒簇，而铁硒簇没有铁硫蔟稳定，可以参与到蛋白质的形成，从而可以形成硒蛋白，但是由于硒的加入使蛋白质的折叠发生了改变，进而影响蛋白质的功能，从而导致对植物的毒害。

硒化合物有着促氧化的作用，当硒通过硫转运蛋白进入植物细胞后，会形成硒代谷胱甘肽，由于谷胱甘肽是植物体内一种主要的抗氧化物质，所以造成植物体内谷胱甘肽的含量减少，使得活性氧的积累增加。

造成植物体内的氧压力增加，最终导致毒害作用[18]。

这些原因导致了不耐硒植物在富硒土壤中难以生存，但是一些植物能够通过将吸收的硒代谢生成二甲基二硒化物和二甲基硒化物排出体外，从而降低体内硒含量，起到植物解毒的功能，使得植物有一定的耐硒能力。

在富硒植物中，硒酸盐在进入植物体内后经代谢产生的甲基硒代半胱氨酸无法进入蛋白质中，只能独自存在于细胞质中。

所以硒能够在植物组织中不断积累，从而使得植物体内硒含量达到较高的水平[19]。

这个代谢过程一定程度的解释了植物对硒的耐受，使得硒含量在植物体内增加。

图1.1植物硒代谢途径

Fig1.1Seleniummetabolicfateinplants

1.3异堇叶碎米荠的性质

1.3.1异堇叶碎米荠特征

异堇叶碎米荠，也名壶瓶碎米荠[20]。

它是一种十字花科（Brassicaceae）碎米荠属（CardamineLinn）的一年生草本植物，能够高度耐硒，其体内硒含量高，属于聚硒植物。

异堇叶碎米荠的叶片形状呈圆心形或肾状心形，叶片边缘有齿状；顶生小叶面积较大，有较长的小叶柄[19]。

异堇叶碎米荠的生长时期主要分为幼苗期、抽苔期、开花期、结荚期这四个时期，在这四个时期中，其叶片在形状上大致相同，面积大小差异较大。

花瓣呈白色，没有明显的花柱。

异堇叶碎米荠可当做野菜食用，也可以入药，能够清热解湿。

用于尿道炎，膀胱炎，痢疾，白带；外用治疔疮，具有十分重要的药用价值。

下图1.2为种植的异堇叶碎米荠。

图1.2种植的异堇叶碎米荠

Fig1.2plantofCardamineviolifolia

1.3.2异堇叶碎米荠的地理分布

异堇叶碎米荠生长温度一般为10℃～25℃。

当温度比10℃低时，异堇叶碎米荠的生长就会受到影响，发育变得缓慢；当高于25℃，其品质会下降，温度过高甚至死亡[20]。

因此异堇叶碎米荠对于温度要求较高，生活在低温环境中。

但是异堇叶碎米荠在各种光照强度下均能生存，对于光照要求不严格。

异堇叶碎米荠在适宜温度下，偏好弱光。

同时异堇叶碎米荠一般生活在pH值偏碱性的土壤中，由于有很强的耐硒能力，因此一般生活在富硒土壤环境中。

主要分布在湖北省的西部、安徽省的九华山以及浙江的柴桥等地[21]。

湖北恩施双河地带土壤具有高浓度的硒环境，海拔1400多米，在其地区上生长的异堇叶碎米荠主要分布在含硒量较高的土壤中，其土壤疏松，空气中水分含量较高，特别是在硒矿旁的小水沟边生长极其旺盛。

1.3.3异堇叶碎米荠的研究现状

由于碎米荠有着很强的耐硒能力，其体内有着很高的硒含量，具有很高的价值，目前国内对于碎米荠的研究有很多。

卢金清等[22]对华中碎米荠挥发性物质通过气相色谱-质联用进行了测定，分析出华中碎米荠中各种化学成分以及相对百分含量。

丁莉等[23]对堇叶碎米荠营养成分进行了分析，发现维生素C、纤维素、硒这三种物质的质量分数为49.327mg/100g、10.037%、26.408μg·g-1，含量均比同类蔬菜高。

一定程度证实了碎米荠中硒含量较高，而且拥有很好的食用价值，对于富硒产品的开发有着一定的参考价值。

彭诚等[24]对堇叶碎米荠不同时期营养成分与含硒量的关系进行了研究，表明含硒量和可溶性蛋白、可溶性糖含量变化趋势基本一致，在苔期达到最高。

说明了硒含量和可溶性蛋白、可溶性糖三者之间可能存在一定的联系，这个猜想需要进一步的研究。

牟敏等[25]对恩施堇叶碎米荠通过采用环已烷萃取有机硒，将无机硒与总硒同时测定，通过恩施双河渔塘坝溪沟边、石煤渣堆和坡地上生长的三种恩施堇叶碎米荠进行测定，表明堇叶碎米荠有机硒含量最低92%以上，生长在溪沟边的堇叶碎米荠总硒和有机硒含量最高；雷红灵等[26]对恩施碎米荠叶片的抗氧化酶活性进行了研究，通过不同硒浓度研究，得出恩施碎米荠的叶片抗氧化酶活力的最适硒质量浓度是3060mg·L-1。

证实了恩施碎米荠的高度耐硒能力，为研究恩施碎米荠提供了一定的参考价值。

向天勇等[27]通过不同浓度的外加硒对恩施碎米荠生长发育进行了研究，发现了恩施碎米荠对硒的耐受能力随着成熟度的增加而提高。

还有很多关于碎米荠的研究，但总的来说这些研究都为碎米荠与硒的关系提供了很好的研究价值，建立了一定的研究体系。

1.5选题意义

硒作为一种人体必需的营养元素，在我们的生活中对于疾病的预防和治疗有着重要的作用，通过对植物中硒含量的研究，进而研究植物中硒的代谢途径，了解植物体内硒的代谢机理，通过一定技术手段，从而提高植物内硒含量，对于有机硒的应用有着重要的意义。

我国大部分地区属于低硒、缺硒地带，人们在平时生活饮食中的硒摄入量不足，严重影响着我国人口的身体健康，对于缺硒人群进行补硒迫在眉睫。

因此生产富硒产品，进而提高缺硒人群体内的硒含量显得十分重要。

而异堇叶碎米荠在富硒土壤中生存，对于硒有着强耐受能力，其体内硒浓度很高，属于聚硒植物，研究其体内硒代谢途径，对于开发富硒产品，从而提高人体的硒含量，保持人体内正常的硒含量水平，对于疾病的预防和治疗有着重要的指导意义。

通过测定异堇叶碎米荠不同时期叶片的挥发性成分以及硒含量，寻找挥发性物质中是否存在硒化合物，为研究硒在异堇叶碎米荠中的代谢机理奠定了一定的基础，为开发新的富硒产品提供了一定的参考价值。

2材料与方法

2.1材料

供实验用的异堇叶碎米荠来自于2012年湖北恩施双河的种子，通过取自湖北恩施双河的硒矿渣培育获得的不同生长时期异堇叶碎米荠。

2.2药品

优级纯：

硝酸；盐酸

分析纯：

无水氯化钙；硼氢化钾；氢氧化钾

10μg·mL-1硒标准溶液

2.3设备

分析天平（ME204E/02，瑞士梅特勒-托利多有限公司）；石墨消解仪（SH220，济南海能仪器有限公司）；数显鼓风干燥箱（GZX-9420MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；气相色谱-质谱联用仪（Agilent6890N/5975C，美国安捷伦公司）；萃取头（DBV/CAR/PDMS50/30μm，美国Supelco公司）；双道原子荧光光度计（AFS-9760，北京海光仪器公司）

2.4异堇叶碎米荠叶片的挥发性物质测定

2.4.1样品准备

取处于幼苗期、抽苔期、开花期、结荚期的异堇叶碎米荠叶片，按照叶片大小的不同，取样的数量不同。

一般表面积较大的叶片取1片，表面积较小的叶片取2-3片，轻轻去掉叶片上面的杂质，用滤纸擦干叶片表面的水分。

2.4.2SPME-GC-MS测定挥发性物质

取样：

称取2g无水氯化钙（用于干燥）放入洁净干燥的50mL试剂瓶中，剪取一张与50mL试剂瓶瓶底大小一致的滤纸放入瓶中，完全盖住无水氯化钙。

将擦拭干净的叶片放入瓶中的滤纸上，用8层封口膜对试剂瓶瓶口进行密封，并用2根橡皮筋将瓶口的封口膜扎紧。

萃取：

放入设置为60℃的数显鼓风干燥箱中，保持30min，然后将装有样品的试剂瓶取出冷却至室温，迅速插入已在进样口（250℃）老化30min的萃取头，用手柄推出纤维头，在常温下萃取30min。

进样：

将已经萃取好的纤维头推回，将萃取头迅速插入气相色谱-质谱联用仪的进样口，推出纤维头，解吸3min，进行测定。

色谱条件：

HP-5MS石英毛细管柱（0.25μm×0.25mm×30m）,载气为氦气，流速为1mL·min-1，进样口温度为250℃，不分流进样。

程序升温条件（40℃保持2min，再以5℃·min-1升温至130℃，保持1min；再以15℃·min-1升温至280℃，保持2min）。

质谱条件：

离子源EI源，电子能量70eV，离子温度230℃，四级杆温度150℃，倍增管电压1.2kV，扫描质量范围m/z35～550。

2.5异堇叶碎米荠叶片硒含量测定

2.5.1标准曲线绘制

分别量取10mL浓度为1、2、4、8、10、20μg·L-1的硒标准溶液在原子荧光光度计上测定硒含量，以B道浓度为横坐标，以B道荧光值为纵坐标作图，得到图2.1。

得出线性回归方程y=182.126x-76.886。

相关系数为R2=0.9993，说明1-20μg·L-1之间线性关系良好。

图2.1硒含量测定标准曲线

Fig2.1Thestandardcurveofseleniumcontents

2.5.2样品消解

将弯嘴漏斗、消解管、25mL容量瓶、10mL离心管、烧杯、50mL量筒、玻璃棒放入酸缸（里面为20%HNO3）中浸泡一夜，然后取出清洗，经UP水润洗后，放入设置为60℃的数显鼓风干燥箱中干燥备用。

取处于不同时期异堇叶碎米荠的叶片，首先用自来水冲洗干净后，然后用UP水润洗，再放入经UP水润洗后的洁净干燥烧杯中，最后将烧杯放入设置为60℃的数显鼓风干燥箱中将叶片烘干（约8小时），再用经UP水润洗后的干燥洁净的研钵将干燥的叶片磨碎，装入2mL离心管中备用。

用分析天平分别称取50mg样品并记录，加入消解管，同时增加一组不加入样品的空白对照。

向消解管中加入5mL浓硝酸，盖上弯嘴漏斗，放入设置温度为160℃的石墨消解仪中，直至消解管中液体透明、无颗粒物质。

将消解管上的弯嘴漏斗取开，继续消解，直至消解管中液体体积剩余2mL左右，从石墨消解仪上取下消解管，将消解管及其液体冷却至室温。

向冷却的消解管中加入2mL浓度为6mol·L-1盐酸溶液，轻轻震荡均匀，放入石墨消解仪中在160℃条件下保持6min，再从石墨消解仪上取下消解管，并冷却至室温。

最后将消解管中的液体转入对应编号的25mL容量瓶中，用5%盐酸定容，震荡均匀。

2.5.3样品硒含量测定

分别量取10μL定容后的液体，转入对应编号的事先准备的10mL离心管中，用10%盐酸定容至10mL，通过双道原子荧光光度计进行测定。

标准系列：

10%盐酸；载流：

10%盐酸；还原剂：

1%硼氢化钠+0.5%氢氧化钠

仪器条件：

总灯电流：

80mA；辅阴极灯电流：

40mA；光电倍增管负高压：

280V；原子化器高度：

8mm；载气流量：

300mL·min-1；屏蔽器流量：

800mL·min-1

2.6数据分析

本实验中的数据主要是通过OrginPro8.0和SPSSV19.0这两种软件进行分析，然后得出相应的结论。

3结果与分析

3.1不同时期异堇叶碎米荠叶片挥发性成分分析

对于处于不同时期异堇叶碎米荠的叶片按照上述方法进行测定后，对总离子流图谱中的各峰经质谱扫描后得质谱图，经NIST08.L质谱数据库进行检索，并结合有关文献，确定了异堇叶碎米荠叶片中挥发性成分的化学组成，其结果见下图。

图3.1幼苗期异堇叶碎米荠叶片挥发性成分总离子流

Fig3.1T